来源：Characterization of the cyclodipeptide synthase gene cluster in Streptomyces sp. NRRL F-5123 by unraveling the biosynthesis of drimentine B（Tetrahedron）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
地列美汀（Drimentines, DMTs）是一类具有2,5-二酮哌嗪（2,5-DKP）环的细菌生物碱，展现出多样的生物活性。本研究通过基因组合与生化实验，阐明了DMT B的完整生物合成途径：tRNA依赖性环二肽合酶DmtB2合成环(L-色氨酸-L-脯氨酸)（cWP），随后由环二肽氧化酶DmtD2_E2、异戊烯基转移酶DmtC2和萜烯环化酶DmtA2依次完成修饰步骤。研究揭示了DmtD2_E2的底物灵活性和脱氢位置选择性，为萜烯化DKP化合物的结构多样化提供了新的生物学信息。
研究背景
具有2,5-二酮哌嗪（2,5-DKP）骨架的天然产物在自然界中广泛分布，表现出高度的结构多样性和广泛的生物活性，包括抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等重要的生理和药理活性。地列美汀（DMTs）以含色氨酸的DKP骨架为特征，属于杂合异戊二烯类化合物，具有抗菌、抗真菌和驱虫活性。天然DMTs在结构上因第二个氨基酸的不同而有所区分，如DMT A/C/G分别来源于亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸。作为最小的环状肽，2,5-DKP由两个氨基酸通过两个肽键连接而成，可通过非核糖体肽合成酶（NRPSs）或环二肽合酶（CDPSs）组装。进一步的修饰酶——包括异戊烯基转移酶（PT）、萜烯环化酶（TC）、甲基转移酶（MT）、环二肽氧化酶（CDO）、细胞色素P450和α-KG依赖性氧化酶——可产生更复杂的含DKP化合物。前期研究已鉴定出三个编码DMTs的同源基因座dmt1-3，并建立了如下组装线：CDPS DmtB1合成cWX（X = Pro、Val或Leu），再由PSL型异戊烯基转移酶在C3位连接法尼基焦磷酸（FPP）部分。
研究方法
3.1 通用材料与方法
本研究所用细菌菌株和质粒列于表S1，引物列于表S2。Streptomyces sp. NRRL F-5123获自美国农业研究服务培养物保藏中心（NRRL）。本工作采用的通用方法按照标准程序或制造商说明进行。质粒提取和DNA纯化使用商业试剂盒（OMEGA, BIO-TEK）完成。引物合成和DNA测序由擎科生物技术有限公司（中国青岛）完成。高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）在Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪上进行。所有核磁共振（NMR）谱图均在Agilent-DD2-500或Bruker Avance III 600谱仪上采集，并使用MestReNova.12.0.0（Mestrelab）软件处理。
【数据】菌株：Streptomyces sp. NRRL F-5123；质粒提取/DNA纯化试剂盒：OMEGA, BIO-TEK；测序公司：擎科生物（青岛）；HR-ESI-MS仪器：Thermo LTQ Orbitrap XL；NMR仪器：Agilent-DD2-500或Bruker Avance III 600；NMR处理软件：MestReNova.12.0.0
研究结果
2.1 异源宿主天蓝色链霉菌M1146中DMT B的生产
我们此前已证明，在S. coelicolor M1146中异源表达dmtA2B2C2可产生DMT C（1）（图1）。
为探究dmtD2_E2在DMT生物合成中的作用，构建了在组成型启动子PhrdB控制下携带dmtD2_E2的质粒pWLI639，具体方法见实验部分。随后将pWLI639转入携带dmtA2B2C2的S. coelicolor M1146（命名为M1146/dmtA2B2C2）。所得异源表达菌株经发酵后进行HPLC分析。如图3所示，与M1146/dmtA2B2C2（panel ii）相比，在M1146/dmtA2B2C2中表达dmtD2_E2导致另一种化合物（2）的积累（panel iii）。
化合物2通过与标准品比对保留时间（panel iv）被鉴定为地列美汀B（DMT B），并通过¹H NMR谱图（图S1）和高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）分析进一步确认。结果表明，化合物2的[M+H]⁺离子为m/z 486.3127（图S2），比DMT C少两个质量单位，表明发生了脱氢反应。这些结果证明DmtD2_E2在DMT生物合成中充当氧化脱氢酶。
【数据】菌株：S. coelicolor M1146/dmtA2B2C2 + pWLI639（dmtD2_E2）；启动子：PhrdB；化合物2的HR-ESI-MS：[M+H]⁺ m/z 486.3127；与DMT C相比质量差：-2 Da；分析手段：HPLC、¹H NMR、HR-ESI-MS
2.2 DmtD2_E2负责DMT B前体环(L-色氨酸-L-Δ脯氨酸)的生物合成
为确定脱氢步骤的确切时间节点，将DmtD2_E2在大肠杆菌中表达（图S3），并以cWP和pre-DMT C为底物、吩嗪硫酸甲酯（PMS）为氢传递体进行体外酶促反应。结果表明，DmtD2_E2能够识别cWP并生成一个新峰（3）（图4，panel ii），但不能接受pre-DMT C（图S4），支持脱氢发生在cWP形成之后。
HR-ESI-MS分析表明，化合物3的分子式为C₁₆H₁₅N₃O₂（m/z [M+H]⁺ 282.1241），比cWP少两个质量单位（图S5）。将¹H NMR数据与先前报道比对后，化合物3被鉴定为环(L-色氨酸-L-Δ脯氨酸)（cWΔP）（图S6）。进一步研究了DmtD2_E2的底物选择性。HPLC分析显示，除cWP外，DmtD2_E2还能识别cWA、cWL、环(L-色氨酸-L-缬氨酸)（cWV）和环(L-色氨酸-L-酪氨酸)（cWY），但不能识别环(L-色氨酸-L-异亮氨酸)（cWI）和环(L-色氨酸-L-苏氨酸)（cWT）（图4和图S17）。各产物的结构基于HR-ESI-MS（图S7）和NMR数据（图S8–16）确定，并参考了先前报道。值得注意的是，在cWP、cWL、cWY和cWV的情况下，脱氢发生在第二个氨基酸上，生成cWΔP、cWΔL、cWΔY和cWΔV（图4，S7-16；表S3）。对于cWA，脱氢发生在色氨酸上，生成cΔWA（图S7–8）。
【数据】DmtD2_E2表达宿主：E. coli；底物：cWP、pre-DMT C、cWA、cWL、cWV、cWY、cWI、cWT；氢传递体：PMS；化合物3分子式：C₁₆H₁₅N₃O₂；[M+H]⁺ m/z 282.1241；脱氢位置：cWP/cWL/cWY/cWV在第二位氨基酸，cWA在色氨酸
2.3 DmtC2的生化表征
基于dmt1编码的DMTs组装线，作为DmtC1的同源蛋白，DmtC2是一种异戊烯基转移酶，负责将FPP转移到cWP的C3位点以生成pre-DMT C。为验证其功能，DmtC2在大肠杆菌中可溶表达（图S3），随后进行生化反应并采用HPLC分析。如图5A所示，DmtC2如预期催化cWP的异戊烯化生成pre-DMT C（panel ii，图S18），而当使用cWΔP作为底物时出现了一个新化合物4（panel v）。
遗憾的是，化合物4未能成功分离，可能由于其不稳定性。HR-ESI-MS分析表明，化合物4的分子量（m/z [M+H]⁺ 486.3134）比pre-DMT C（m/z [M+H]⁺ 488.3263）小两个单位，与脱氢反应的发生一致。采用HR-MS/MS分析确定脱氢位置。如图5B所示，与pre-DMT C相比，虽然观察到共享的质子化取代离子m/z 334.25，但化合物4中由二甲基法尼基和法尼基消除产生的离子m/z 294.13和282.13比pre-DMT C的相应离子（m/z 296.13和284.13）小两个单位，从而支持脯氨酸环被脱氢的假设。为探究DmtC2对异戊烯基供体的底物选择性，测试了C5–C20单位：二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）、香叶基焦磷酸（GPP）和香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）。结果表明，在测试条件下DmtC2只能接受FPP，说明DmtC2对特定异戊烯基供体具有严格的底物特异性（图S19）。这些结果表明，DmtC2催化FPP转移到cWP和cWΔP的C3位点，分别形成pre-DMT C和pre-DMT B。
【数据】DmtC2表达宿主：E. coli；底物：cWP、cWΔP；化合物4：[M+H]⁺ m/z 486.3134；pre-DMT C：[M+H]⁺ m/z 488.3263；HR-MS/MS特征离子（化合物4）：m/z 334.25、294.13、282.13；pre-DMT C对应离子：m/z 296.13、284.13；异戊烯基供体测试：DMAPP、GPP、FPP、GGPP；DmtC2仅接受FPP
讨论与解读
DKP骨架外C=C键的安装主要由CDPS相关细菌途径中的CDO催化。迄今已有五个含CDO的途径被表征：S. noursei的albonoursin生物合成途径、Nocardiopsis dassonvillei的nocazines生物合成途径、S. monomycini的guanitrypmycins生物合成途径、S. chrestomyceticus的purincyclamide生物合成途径和S. cinnamoneus的guatrypmethine生物合成途径。Chevalier等人以大肠杆菌为底盘，共表达CDPS-Ssp5123（dmtB2）和CDO-Ssp5123（dmtD2_E2），导致cWΔP的形成。本研究表征了DmtD2_E2的体外活性，揭示其具有底物灵活性，脱氢反应发生在cWX（X = Pro、Ala、Val、Tyr或Leu）上，但有趣的是发生在不同位置。CDO催化Cα-Cβ键的脱氢。DmtD2_E2对不同底物的结合模式可能略有不同，需进一步研究以阐明其潜在机制。通过体内和体外表征DmtD2_E2，获得了对DMTs生物合成的更全面理解。如图6所示，由CDPS DmtB2合成的含色氨酸CDP cWP被CDO DmtD2_E2转化为cWΔP；cWP和cWΔP均能被PT DmtC2识别，随后经TC DmtA2分别生成DMT C和DMT B。
编译者解读：本研究通过体内基因组合表达与体外生化表征相结合的策略，系统阐明了DMT B的完整生物合成途径。方法上的亮点在于对DmtD2_E2底物选择性的系统考察——该酶对多种cWX底物均有活性但脱氢位置各异，这为环二肽氧化酶的工程化改造提供了有价值的参考。从合成生物学应用角度看，DmtC2对FPP的严格特异性限制了异戊烯基侧链的结构多样性，未来若能通过蛋白质工程拓宽其供体选择性，将有望产生更多新型萜烯化DKP化合物。不足之处在于化合物4因不稳定未能分离，其结构确认依赖于质谱数据，尚缺乏NMR级别的直接证据。
参考来源
Jiang Y. Characterization of the cyclodipeptide synthase gene cluster in Streptomyces sp. NRRL F-5123 by unraveling the biosynthesis of drimentine B. Tetrahedron, 2023. DOI: 10.1016/j.tet.2022.133213
DOI: 10.1016/j.tet.2022.133213