来源：Lysine enrichment of ethanol industry co-products (thin stillage and whole stillage) through Corynebacterium glutamicum fermentation（Food and Bioproducts Processing）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
玉米基动物饲料普遍存在赖氨酸缺乏问题，尤其是蒸馏酒糟及其可溶物（DDGS）等乙醇联产品。本研究以赖氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13287为发酵菌种，直接以玉米乙醇生产的两类副产物——稀酒糟（TS）和全酒糟（WS）为底物进行发酵，系统考察了营养补充与初始pH对菌体生长和赖氨酸积累的影响。结果显示，在不添加任何外源营养的条件下，TS和WS中赖氨酸含量分别提升4.7倍和6.5倍；初始pH 8.0条件下，第5天赖氨酸浓度分别达到26.17 ± 1.53 mg/g底物（TS）和15.99 ± 0.74 mg/g底物（WS）。该策略无需额外营养补充即可实现乙醇联产品的赖氨酸增值，为饲料原料升级提供了简约可行的生物加工路径。
研究背景
玉米乙醇工业产生多种营养丰富的联产品，包括DDGS、全酒糟（WS）和稀酒糟（TS）。DDGS因蛋白质和能量密度高而被广泛用于畜禽日粮，2024年美国产量约达3600万公吨。然而DDGS的氨基酸谱存在固有失衡，赖氨酸对单胃动物尤其缺乏。干燥过程中的热诱导美拉德反应进一步降低赖氨酸生物利用率，迫使饲料工业额外添加昂贵的赖氨酸补充剂。赖氨酸是猪、禽和水产日粮中的第一限制性氨基酸，对肌肉沉积、氮利用和整体饲料效率至关重要。因此，提升乙醇联产品中赖氨酸含量具有明确的产业需求。虽然DDGS的营养组成已被充分表征，但其前体流——WS和TS作为发酵底物的潜力尚未被充分挖掘。
研究方法
2.1 微生物、材料与试剂
赖氨酸发酵实验使用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13287，该菌株为赖氨酸过量生产突变株，是野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032经紫外线诱变和筛选获得的同型丝氨酸营养缺陷型菌株，此前由Kromer等（2004）描述。该菌株未经过基因工程改造以利用甘油作为唯一碳源，本研究也未引入影响碳代谢的基因修饰。
稀酒糟（TS）和全酒糟（WS）取自美国南达科他州Wentworth的一家商业玉米乙醇精炼厂。已知不同乙醇工厂的酒糟流化学组成会因原料组成、发酵性能、工艺配置和生产周期而异。为最小化组成变异性，并实现对营养补充和初始pH效应的受控评估，TS和WS均来自同一家精炼厂。本研究的目的是利用乙醇联产品流进行受控的概念验证评估，而非评估工厂间的变异性，因此跨工厂和季节性变异评估不在本研究范围内。未来需要涉及多家乙醇工厂和不同生产周期的酒糟流研究，以评估所提出方法的更广泛适用性。
有机溶剂乙腈（ACN，HPLC级，99.9%）和甲醇（HPLC级，99.9%）购自Fisher Scientific。L-赖氨酸盐酸盐（99%）、乙酸（99.7%）、D-葡萄糖（99%）、D-木糖（99%）、氯化钾（99.9%）、硼酸（99.8%）、硫酸（96.1% w/w）、巯基乙醇（MCE，≥99%）和氢氧化钠（99.9%）均购自Fisher Scientific。邻苯二甲醛（OPA，>99%）购自TCI（美国）。甘油（≥99.5%）购自Sigma Aldrich。所有化学品均为分析纯级，并按制造商说明储存。
2.2 培养基制备与TS和WS的 submerged 发酵
将−80°C冷冻保存的谷氨酸棒杆菌培养物通过接种一环细胞至100 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，于30°C培养24小时进行活化。活化培养物保存在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）上，所有发酵实验以5%（v/v）的接种量使用24小时TSB培养物作为接种物。
采用两种实验方案评估TS和WS的赖氨酸生产，如图1所示。
第一种方案中，TS和WS在不同营养补充条件下进行测试，以确定外源碳源或氮源是否增强赖氨酸生物合成。培养基制备时不补充营养（TS-Un和WS-Un），或补充葡萄糖、硫酸铵和生物素的组合。包括：TS补充葡萄糖（100 g/L）、硫酸铵（15 g/L）和生物素（TS-G/N/B）；TS补充葡萄糖和硫酸铵（TS-G/N）；以及仅含硫酸铵的TS或WS（TS-N和WS-N）。所有营养补充试验的初始pH均调至7.0，发酵期间每24小时手动校正pH。同时设置含全部补充物（G/N/B）的阳性对照。
第二种方案中，使用无任何营养补充的TS和WS评估初始pH对微生物生长和赖氨酸生产的影响。在121°C高压灭菌30分钟前，用3 M NaOH将TS和WS的初始pH分别调至6.0、7.0或8.0，培养基分别命名为TS−6、TS−7、TS−8和WS−6、WS−7、WS−8。与第一种方案不同，发酵期间不再进行pH调整。
所有发酵均在250 mL锥形瓶中进行，工作体积100 mL。submerged发酵条件为30°C、200 rpm、120小时。根据实验方案不同，pH要么维持在7.0（方案一），要么在初始调整后不控制（方案二）。发酵期间每24小时取样监测赖氨酸产量、微生物生长、pH变化和可溶性代谢物浓度。每个时间点先立即测量培养物pH，然后以10,000 × g离心10分钟分离固体和液体部分。上清液收集用于可溶性代谢物分析，含不溶性固体和谷氨酸棒杆菌细胞生物质的沉淀在60°C烘箱干燥48小时，储存用于后续水分含量、粗蛋白和氨基酸谱分析。可溶性蛋白、糖类、甘油、有机酸和赖氨酸在液体部分中定量。
2.3 分析方法
#### 2.3.1 TS和WS的总固形物含量
TS和WS的总固形物含量通过将约2 g样品在80°C烘箱干燥48小时测定。测定水分损失，固形物含量以干基表示。
#### 2.3.2 谷氨酸棒杆菌生长曲线
营养补充和未补充培养基中谷氨酸棒杆菌的生长每24小时通过标准平板计数法监测。每个取样点，在无菌缓冲蛋白胨水中制备发酵培养基的适当系列稀释液并充分混匀。使用倾注平板技术在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）上测定总活菌数。接种平板在30°C培养24小时，选择含30–300个菌落的平板进行计数。微生物生长量以log菌落形成单位每毫升（log CFU/mL）表示。以log CFU/mL对发酵时间作图构建生长曲线。
#### 2.3.3 TS和WS固体残渣的粗蛋白含量
固体残渣的粗蛋白使用LECO FP528燃烧分析仪测定。将约0.25 g干燥材料包裹在锡箔中，在氧气存在下燃烧测定总氮含量。样品粗蛋白百分比使用6.25的氮-蛋白转换系数计算。发酵上清液中的可溶性蛋白通过直接燃烧250 µL上清液测定。所有样品均进行三次重复分析。
#### 2.3.4 固体残渣的氨基酸谱
选定固体样品的氨基酸谱由Midwest Laboratories（美国内布拉斯加州）根据AOAC官方方法994.12分析。色氨酸根据AOAC官方方法988.15单独测定。
#### 2.3.5 碳水化合物、甘油和有机酸的定量
对于碳水化合物、甘油和有机酸的定量，离心获得的上清液适当稀释后经0.22 µm尼龙滤膜过滤。单糖、甘油和有机酸通过高效液相色谱（HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA）联用示差折光检测器（型号G1362A）分析。样品在Aminex HPX-87H色谱柱上、65°C条件下，以5 mM H₂SO₄为流动相、流速0.6 mL/min进行洗脱。总运行时间25分钟，进样体积5 µL。甘油（0.2775–4.44 mg/mL）、乳酸、乙酸、琥珀酸（0.0693–1.11 mg/mL）、葡萄糖（0.13–2.22 mg/mL）和木糖（0.13–2.22 mg/mL）的标准曲线在超纯水中制备用于定量。葡萄糖补充处理中的葡萄糖浓度在第0天、第2天和第5天测定，以评估发酵过程中残余葡萄糖的变化。
#### 2.3.6 赖氨酸含量的测定
发酵培养基中的赖氨酸含量通过HPLC（Agilent Technologies，Santa Cla…）分析。
【数据】菌株：谷氨酸棒杆菌ATCC 13287；接种量：5%（v/v）；TSB活化温度：30°C；活化时间：24h；葡萄糖补充浓度：100 g/L；硫酸铵补充浓度：15 g/L；初始pH：6.0/7.0/8.0（3 M NaOH调节）；灭菌：121°C，30min；发酵条件：250mL锥形瓶，100mL工作体积，30°C，200rpm，120h；离心：10,000 × g，10min；固体干燥：60°C，48h；总固形物测定：80°C，48h；粗蛋白分析：LECO FP528，约0.25g样品，转换系数6.25；HPLC条件：Aminex HPX-87H柱，65°C，5mM H₂SO₄，0.6mL/min，25min，进样5µL；滤膜：0.22µm尼龙
研究结果
3.1 营养补充对生长和赖氨酸生产的影响
TS和WS分别含约7%和13%的总固形物，两种底物表现出相近的粗蛋白含量（29.13–30.17%）。TS是一种营养丰富的流，由蛋白质（28.65%）、粗脂肪（25.29%）和可溶性碳水化合物（8.77 mg/mL）组成，这些在发酵过程中可共同作为碳源和氮源。HPLC分析显示存在丰富的可溶性碳源，包括甘油、琥珀酸、乳酸、乙酸以及可溶性寡糖和二糖的混合物，而葡萄糖和木糖低于检测限，表明初级乙醇发酵期间糖已被大量消耗。这些结果共同表明，TS和WS是复杂的发酵底物，特点是残余可发酵糖浓度低，但存在包括甘油和有机酸在内的替代可溶性碳源。
由于TS和WS缺乏可直接发酵的单糖，研究者评估了补充葡萄糖（G）、硫酸铵（N）和生物素（B）是否能增强谷氨酸棒杆菌的生长和赖氨酸生产。谷氨酸棒杆菌的生长和赖氨酸生物合成受pH、细胞密度、碳可用性和营养组成的强烈影响。该菌株已知具有碱耐受性，最佳生长通常报道在pH 7.0至8.0之间，且此前研究表明生物素补充在限定培养条件下可将赖氨酸产量提升至四倍。
与这些预期相反，两种补充葡萄糖的处理（TS-G/N/B和TS-G/N）的生物量积累和赖氨酸产量均显著低于未补充的TS（TS-Un）和TS-N（图2）。
发酵液中的赖氨酸浓度最初以上清液中的体积浓度（mg/mL）定量，报告于补充材料中。为实现不同总固形物含量底物间的直接比较，赖氨酸值随后被归一化并以mg/g干基表示。尽管补充葡萄糖的样品中赖氨酸含量在第2天略有增加，但到第5天下降，尽管仍有大量残余葡萄糖存在。TS-G/N/B处理的HPLC分析显示，葡萄糖从第0天的78.18 g/L降至第2天的73.55 g/L和第5天的59.87 g/L，表明整个发酵过程中补充葡萄糖仅被部分利用。葡萄糖在灭菌前加入以达到100 g/L的标称终浓度，并与TS培养基一起高压灭菌。然而，培养基制备和灭菌后HPLC测得的初始葡萄糖浓度为78.18 g/L，该值在整个研究中作为实际第0天葡萄糖浓度使用。由于葡萄糖浓度在灭菌后测定，本研究报告的所有值均基于HPLC测量浓度而非标称补充水平。标称补充水平与测量浓度之间的差异可能反映了热灭菌过程中的葡萄糖转化或与复杂酒糟基质组分的相互作用，但这些可能性未被直接研究，因此无法确认。
TS本身含有大量可溶性和不溶性碳水化合物以及有机酸，这些可能共同支持微生物生长和赖氨酸生产。在这些条件下，与未补充的对照相比，葡萄糖补充并未改善生物量积累或赖氨酸产量。虽然本研究未直接研究潜在机制，但整个发酵过程中高残余葡萄糖浓度的持续存在表明，在所评估的实验条件下葡萄糖可用性并非限制因素。因此，葡萄糖补充处理中观察到的赖氨酸产量降低不能归因于碳限制。相反，结果表明额外葡萄糖在所测试条件下未为赖氨酸生产提供可测量的益处。高葡萄糖培养条件下谷氨酸棒杆菌生长和代谢物产量降低此前已有报道，归因于碳氮比改变和代谢瓶颈等因素。然而，由于这些机制未在本研究中调查，仍属推测性，值得进一步研究。从生物加工角度看，无需葡萄糖补充即可生产赖氨酸是有利的，因为它减少了原料投入同时简化了发酵过程。
氮补充（TS-N）导致赖氨酸含量早期增加，但最终赖氨酸浓度与TS-Un相当，表明TS的天然营养组成在所评估条件下提供了足够的氮以支持赖氨酸生物合成。TS-Un从第0天到第5天赖氨酸增加4.7倍，生物量在第2天达到峰值，赖氨酸浓度在第5天达到最大值，与赖氨酸主要作为后期稳定期代谢物一致。这些结果表明，在所评估条件下，额外氮补充未增强TS中的赖氨酸生产，天然营养组成足以支持微生物生长和赖氨酸积累。
由于葡萄糖补充未改善TS中的微生物生长或赖氨酸生产，WS仅评估了氮补充。然而，氮补充（WS-N）相对于未补充对照（WS-Un）未改善赖氨酸产量，且补充培养基中的微生物生长再次较低（图3）。
尽管固形物含量较高（约13%），WS含有足够的天然营养以支持谷氨酸棒杆菌的有效生长和赖氨酸生产，无需外部营养补充。可能导致初始赖氨酸测量差异的另一个因素是灭菌过程中赖氨酸的热敏感性。TS和WS均含有天然氨基化合物和还原糖，热加工已被报道可促进美拉德反应从而降低可检测的赖氨酸浓度。然而，本研究未定量美拉德反应产物，因此该解释应被视为合理推断而非已确认机制。由于溶质浓度增加，这种效应在营养补充培养基中可能更为明显，可能导致含葡萄糖处理中观察到的较低初始赖氨酸含量。
大多数工业谷氨酸棒杆菌赖氨酸发酵依赖高葡萄糖浓度（通常80–120 g/L），通过限定或糖蜜基培养基供应，并在严格控制的分批补料条件下操作以最大化体积浓度。此类系统针对纯化底物而非联产品增值进行优化。相比之下，本研究使用TS和WS作为复杂的乙醇衍生发酵培养基，特点是残余可发酵糖极低，主要可溶性代谢物为甘油和有机酸。尽管可代谢碳水化合物浓度大幅降低……
【数据】TS总固形物：约7%；WS总固形物：约13%；粗蛋白含量：29.13–30.17%；TS蛋白：28.65%；TS粗脂肪：25.29%；TS可溶性碳水化合物：8.77 mg/mL；TS-Un赖氨酸增加：4.7倍（第0天至第5天）；TS-G/N/B葡萄糖消耗：78.18 g/L（第0天）→ 73.55 g/L（第2天）→ 59.87 g/L（第5天）；生物量峰值时间：第2天；赖氨酸峰值时间：第5天
3.2 初始pH对生长、pH动态和赖氨酸含量的影响
（由于原文节选在此处截断，后续结果内容根据可得原文呈现）
图4展示了不同初始pH条件下TS发酵的生长、pH动态和赖氨酸含量。
图5展示了不同初始pH条件下WS发酵的生长、pH动态和赖氨酸含量。
最佳赖氨酸浓度在初始pH 8.0条件下获得，第5天TS中达到26.17 ± 1.53 mg/g底物，WS中达到15.99 ± 0.74 mg/g底物。
图6展示了发酵液体中可溶性蛋白含量的变化。
图7展示了发酵固体中蛋白含量的变化。
发酵还富集了回收固体的蛋白质和氨基酸谱，值得注意的是，在pH 6.0条件下TS固体中蛋氨酸和色氨酸增加了20–28%。
【数据】最佳赖氨酸浓度（初始pH 8.0，第5天）：TS为26.17 ± 1.53 mg/g底物，WS为15.99 ± 0.74 mg/g底物；蛋氨酸和色氨酸增加：20–28%（TS固体，pH 6.0）
讨论与解读
本研究证明了利用稀酒糟（TS）和全酒糟（WS）这两种玉米乙醇生产联产品流作为谷氨酸棒杆菌发酵底物生产赖氨酸的可行性，无需广泛预处理或外部营养补充。在评估条件下，葡萄糖、硫酸铵或生物素的补充均未改善赖氨酸产量，最高赖氨酸富集始终在未补充处理中获得。这些发现表明，TS和WS的内在营养组成足以支持谷氨酸棒杆菌生长和赖氨酸生物合成，为乙醇联产品升级提供了简单可持续的策略。与传统依赖精制碳源和营养补充的赖氨酸发酵工艺不同，该方法直接利用营养丰富的乙醇联产品作为发酵底物，提供了联产品增值的替代策略。
初始pH显著影响发酵性能，中性至微碱性条件（pH 7.0–8.0）在TS和WS中均产生最高赖氨酸浓度。发酵还改变了可溶性含碳化合物的组成，表明整个培养过程中存在活跃的底物转化。除增加液体部分中的赖氨酸浓度外，发酵还提升了回收固体的蛋白质含量和氨基酸组成。
编译者解读
该研究在策略选择上颇具巧思——没有沿用工业赖氨酸发酵高糖培养基的经典路线，而是反向利用乙醇联产品中"残余糖不足"这一看似劣势的特征，证明内源营养足以驱动赖氨酸合成。这种"减法思维"降低了原料成本与工艺复杂度。pH 8.0偏好与菌株碱耐受特性吻合，提示初始pH优化可作为低成本调控杠杆。局限在于单工厂底物来源和未定量美拉德反应产物，工业推广前仍需多来源底物验证与技术经济评估。从合成生物学应用视角看，若后续结合代谢工程强化该菌株对甘油和有机酸的共利用，有望进一步提升联产品增值空间。
参考来源
Khadka, B. Lysine enrichment of ethanol industry co-products (thin stillage and whole stillage) through Corynebacterium glutamicum fermentation. Food and Bioproducts Processing, 2026. DOI: 10.1016/j.fbp.2026.06.024
DOI: 10.1016/j.fbp.2026.06.024