来源：Ribosomal pentapeptide nitration for non-ribosomal peptide antibiotic precursor biosynthesis（Chem）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
结核病致病菌的耐药性问题日益严峻，而环肽抗生素rufomycin对结核分枝杆菌展现强效抑制活性，其关键药效基团是罕见的非蛋白源氨基酸——3-硝基酪氨酸。本研究揭示了一个令人意外的生物合成机制：rufomycin基因簇中隐藏着一条此前被忽视的核糖体肽生物合成途径（RiPP），由一个小分子五肽MRYLH作为底物，经细胞色素P450酶RufO催化硝化，为下游非核糖体肽合成酶（NRPS）提供3-硝基酪氨酸构件。该发现首次展示了核糖体与非核糖体肽生物合成途径在同一天然产物中的完整融合，为酶工程改造和新型抗菌活性分子开发提供了全新思路。
研究背景
天然肽类产物是药物发现的重要来源，其生物合成主要分为两大途径：非核糖体肽合成酶（NRPS）途径和核糖体合成后修饰肽（RiPP）途径。NRPS利用模块化的缩合结构域催化载体蛋白结合氨基酸之间的肽键形成，可掺入大量非蛋白源氨基酸；而RiPP途径受限于必须使用蛋白源氨基酸，结构多样性受到制约。然而，近年研究发现，核糖体肽经高度修饰后同样能产生结构复杂的天然产物，两类途径之间的界限正逐渐模糊。
Rufomycin是一类环肽抗生素，对结核分枝杆菌具有强效杀伤活性，其分子中含有3-硝基酪氨酸残基，该修饰对药效至关重要。此前研究已鉴定出rufomycin基因簇中的一氧化氮合酶RufN和细胞色素P450酶RufO，但3-硝基酪氨酸的具体生物合成来源一直悬而未决。本研究从基因组挖掘出发，发现了一条隐藏的RiPP途径参与该非天然氨基酸的构建，揭示了核糖体肽生物合成与NRPS途径之间前所未有的协同关系。
研究方法
ilamycin/rufomycin基因簇及其他含rufNO/bytA系统的鉴定与比较
以来源于Streptomyces atratus S3_m208_1（PQ034618.1）rufomycin基因簇中RufN（XCX13212.1）和RufO（XCX13213.1）的氨基酸序列为查询序列，使用cblaster默认参数检测含一氧化氮合酶和硝化细胞色素P450基因同源物的生物合成基因簇。从NCBI数据库收集所得命中的基因组序列，使用antiSMASH 7.0分析以确定各菌株是否含有rufomycin/ilamycin基因簇。同时人工检查bytA前体肽编码序列的存在。使用CAGECAT以最小比对序列一致性0.45对rufomycin基因簇进行可视化。为鉴定更远缘的相关系统，使用RufO氨基酸序列（XCX13213.1）及活性位点I-螺旋基序RAXXHAGXEVPXRFL进行PSI-BLAST搜索，随后人工检查bytA和一氧化氮合酶基因的存在。所得命中序列从NCBI数据库收集并使用antiSMASH 7.0分析。
【数据】查询序列：RufN（XCX13212.1）、RufO（XCX13213.1）；菌株：Streptomyces atratus S3_m208_1；比对一致性阈值：0.45；数据库：NCBI；分析工具：cblaster、antiSMASH 7.0、CAGECAT、PSI-BLAST
l-酪氨酸-(苯基-3,5-d2)及Fmoc-l-酪氨酸-(苯基-3,5-d2)的合成
l-酪氨酸-(苯基-3,5-d2)和Fmoc-l-酪氨酸-(苯基-3,5-d2)的合成按照先前报道的方案进行。所有谱图与先前报道一致。
【数据】合成方法：参照已发表方案；氘代位置：苯基-3,5位；验证方式：谱图比对
肽合成
肽合成在0.1 mmol规模下手工进行，使用N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）和Oxyma Pure作为缩合试剂。2-氯三苯甲基氯树脂（97 mg）用DCM洗涤（3 × 2 mL），在DCM（2 mL）中溶胀30分钟，再用DCM洗涤（3 × 2 mL）。首个Fmoc保护氨基酸（0.15 mmol）在N,N-二异丙基乙胺（DIEA）存在下与树脂偶联过夜。未反应的氯三苯甲基基团用MeOH封端，以3 × 2 mL DMF/DIEA/MeOH（7:2:1）洗涤。Fmoc脱除使用20%哌啶/DMF溶液，随后进行Fmoc-氨基酸偶联（3当量），使用DIC（3当量）和Oxyma Pure（6当量），在50°C下反应10分钟。脱保护和偶联循环重复直至序列完成，最后进行脱保护以去除末端氨基酸的Fmoc保护基。肽从树脂上裂解使用5 mL TFA/TIS/H2O（95:2.5:2.5，v:v′:v″）溶液，室温振摇2小时。过滤分离树脂与溶液。树脂用TFA（2 × 1 mL）洗涤后，滤液在N2气流下浓缩至约1 mL，然后用预冷乙醚（20 mL）沉淀肽，在防爆离心机（Spintron, GT-175）中离心，并用乙醚（3 × 10 mL）洗涤。肽通过LC-MS（Shimadzu）分析，使用ACN（0.1% FA）梯度从0%到50%洗脱30分钟。结构参见图S9和S18，肽分析参见图S10、S11和S19–S22。
【数据】合成规模：0.1 mmol；树脂用量：97 mg；偶联试剂：DIC/Oxyma Pure；偶联条件：50°C、10 min；裂解液：TFA/TIS/H2O（95:2.5:2.5）；裂解时间：2 h（室温）；沉淀：预冷乙醚20 mL；分析：LC-MS（ACN梯度0%–50%，30 min）
定点突变
本研究的点突变通过定点突变方法产生。设计含目标突变的引物对，由Sigma-Aldrich合成。使用Phusion高保真PCR Master Mix（含HF Buffer，NEB）或Q5 Hot Start高保真DNA聚合酶（NEB）进行PCR扩增，产生含切口的突变质粒。PCR产物用DpnI内切酶（NEB）消化甲基化亲本DNA模板（产生粘性末端时），或使用KLD Enzyme Mix（NEB）进行连接和模板消化（产生平末端时）。反应后混合物转化NEB 10-ß感受态大肠杆菌细胞。过夜培养后，挑取单菌落分离质粒DNA并测序确认目标蛋白构建正确。引物序列见表S9。
【数据】突变方法：定点突变；聚合酶：Phusion高保真PCR Master Mix（HF Buffer）或Q5 Hot Start高保真DNA聚合酶；模板消化：DpnI（粘性末端）或KLD Enzyme Mix（平末端）；宿主菌：NEB 10-ß感受态大肠杆菌
P450酶及突变体的表达与纯化
P450Blt及其突变体的表达和纯化按先前描述的方法进行。RufO的表达和纯化使用相同方案。
【数据】表达纯化方案：参照已发表方法（文献34）
肽环化与硝化测定
环化测定按先前描述的方法进行。简要流程如下：HEPES（50 mM）、NaCl（50 mM）、P450（0.5 μM）、PuR（0.5 μM）、PuxB A105V突变体（2.5 μM）、葡萄糖（0.33%）、葡萄糖脱氢酶（0.033 mg/mL）、肽底物（50 μM）和NADH（2 mM）混合，30°C、300 rpm振摇过夜孵育。硝化反应额外以二乙胺NONOate（DEANO，0.5 mM）形式提供NO。使用连二亚硫酸钠的反应中，不添加PuR、PuxB A105V、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，代之以连二亚硫酸钠（200 μM）。使用过氧化氢酶或超氧化物歧化酶的反应中，酶终浓度为1,000 U/mL。使用过氧化氢的反应中，浓度为50 μM。纯化采用固相萃取（Bond Elute，Agilent），先用500 μL MeOH（0.1% FA）活化，再用1 mL水（0.1% FA）平衡。反应液用水（0.1% FA）稀释至1 mL后上柱，随后用1 mL水（0.1% FA）洗涤，最后用600 μL MeOH（0.1% FA）洗脱。甲醇洗脱级分用浓缩仪（Eppendorf）干燥，重新溶解于50 μL ACN/H2O（1:4，0.1% FA）后进行LC-MS分析。所有LC-MS分析在Shimadzu高效液相色谱系统耦合质谱仪LC-MS-2020（ESI，正负双模式）上进行，配备SPD-20A Prominence光电二极管阵列检测器和LC-20AD溶剂输送模块。分析分离使用Agilent ZORBAX 300SB-C18 5 μm色谱柱。所有环状五肽产物通过高分辨质谱（HRMS）确认。
【数据】环化体系：HEPES 50 mM、NaCl 50 mM、P450 0.5 μM、PuR 0.5 μM、PuxB A105V 2.5 μM、葡萄糖 0.33%、葡萄糖脱氢酶 0.033 mg/mL、肽底物 50 μM、NADH 2 mM；条件：30°C、300 rpm、过夜；硝化额外添加：DEANO 0.5 mM；连二亚硫酸钠替代体系：200 μM；过氧化氢酶/超氧化物歧化酶：1,000 U/mL；过氧化氢：50 μM；固相萃取：活化500 μL MeOH（0.1% FA）、平衡1 mL水、洗脱600 μL MeOH（0.1% FA）；色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB-C18 5 μm
NADH消耗测定
P450对NADH的消耗使用Jasco V-750分光光度计在30°C下测量。按上述方法设置环化或硝化测定体系，但不添加葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、NADH和肽底物。在添加NADH至终浓度100 μM之前先进行空白测量。随后在340 nm处测量吸光度2分钟获得背景斜率（Absback），然后加入肽底物（25 μM）并测量吸光度3分钟。确定NADH添加后曲线斜率（Abssamp）。Vmax和Kcat值使用NADH在340 nm处的摩尔消光系数及以下公式计算：Vmax = (Abssamp − Absback)/0.00622 × 1，Kcat = Vmax/[P450]。
【数据】温度：30°C；NADH终浓度：100 μM；肽底物：25 μM；检测波长：340 nm；背景测量：2 min；样品测量：3 min；计算公式：Vmax = (Abssamp − Absback)/0.00622 × 1
Michaelis-Menten动力学实验
在不同肽浓度（3.125–100 μM）下进行硝化反应，体系如上所述，含RufOWT（0.2 μM）、PuxB AV+（1 μM）、PuR（0.2 μM）和DEANO（为肽浓度的10倍）。在0、10、20和30分钟时间点取样，用含0.1% FA的甲醇淬灭反应。样品干燥后通过LC-MS分析以确定各肽浓度下的初始反应速率。将初始反应速率（v0）对底物浓度（[S]）作图，构建Lineweaver-Burk图，确定动力学参数KM、kcat及KM/kcat。
【数据】肽浓度范围：3.125–100 μM；RufOWT：0.2 μM；PuxB AV+：1 μM；PuR：0.2 μM；DEANO：肽浓度的10倍；取样时间点：0、10、20、30 min
P450 CO差光谱
光谱使用Jasco V-750分光光度计在30°C下获得。酶用Tris-HCl（50 mM，pH 7.4）稀释至2.5 μM，获取基线光谱。加入少量硼烷碳酸二钠生成CO，P450用20 μL新鲜配制的饱和连二亚硫酸钠溶液还原。测量CO复合物的UV-vis光谱直至光谱稳定。
【数据】温度：30°C；酶浓度：2.5 μM；缓冲液：Tris-HCl 50 mM（pH 7.4）；还原剂：饱和连二亚硫酸钠溶液20 μL
P450/底物结合测定（UV-vis光谱法）
（原文此段内容不完整，未详述具体操作参数。）
【数据】原文未详述
研究结果
在我们搜索新型非经典biarylitide途径的过程中，一个发现引起了我们的注意：我们实验室保存的一株菌株Streptomyces atratus S3_m208_1（分离自比利时土壤样品）中，一个P450酶与RufO的序列一致性高达97.97%，其编码基因位于rufNO操纵子上游，紧邻一个编码MRYLH五肽的bytA同源基因（图1）。值得注意的是，这个biarylitide生物合成基因簇恰好位于rufomycin基因簇的中心位置，数据库中所有其他rufomycin基因簇中也鉴定到了同源酶（表S1；图S1和S2）。我们因此开始探索这条RiPP途径在rufomycin生物合成中的作用。
【数据】序列一致性：97.97%；菌株：Streptomyces atratus S3_m208_1（比利时土壤分离）；五肽序列：MRYLH；基因位置：rufNO操纵子上游
细胞色素P450 RufO催化RiPP前体肽硝化
我们对RufO功能的初步研究源于对其结构与我们最近表征的biarylitide交联酶P450Blt结构的比较。结构分析显示两者高度相似（氨基酸一致性41.6%，C-α RMSD 1.8 Å，比对至8SPC；图S3），但RufO中央I-螺旋的关键区段存在差异（图S4）。P450酶中的I-螺旋横跨酶活性位点内的血红素辅基（图S5，青色），关键残基——通常是保守的酸/醇对——参与P450催化循环中的氧活化。RufO中典型的酸/醇位置残基（P450Blt：Ser239、Val240；RufO：Val240、Pro241；图S4和S5）的差异暗示该P450催化的转化类型发生了重大改变（表S2）。
鉴于ruf基因簇中意外存在bytA RiPP前体基因，我们推测该五肽可能正是RufO的底物。为验证这一假设，我们表征了RufO与该候选五肽底物（Nle-RYLH [Nle-1]；其中正亮氨酸[Nle]替代甲硫氨酸以避免非酶催化的Met氧化；图2和S6–S11；表S3–S6）的相互作用。我们使用结合实验监测P450内铁的自旋态变化——通过UV/可见光谱在逐步增加底物肽浓度时监测——结果显示RufO对Nle-1的亲和力与P450Blt相当（0.31 μM vs. 1.1 μM；图S7），但结合后Soret最大吸收移至410 nm（图S7和S8）。如此紧密的结合有些出乎意料，因为体积庞大的Val残基替代了P450Blt活性位点中与底物肽形成关键氢键相互作用的Ser残基。
我们通过分子动力学模拟（MDS）进一步分析了这种结合改变的效应，比较了1与P450Blt及S239V/V240P突变体的相互作用。模拟显示，在突变体中1采取了一种构象，其C端残基背离I-螺旋方向。尽管模拟中Ser239突变为Val，Tyr-3残基的位置几乎未发生变化，这与Tyr-3是RufO活性位点的事实一致（图S12）。
接下来，我们通过P450催化转化实验来阐明RufO的活性（表S3–S6；图S13和S34）。使用标准细菌氧化还原伴侣蛋白（PuxB [铁氧还蛋白]/PuR [铁氧还蛋白还原酶]）与RufO一起尝试交联Nle-1未能成功，这与P450Blt在这些氧化还原伴侣存在下表现出的高水平交联活性形成鲜明对比（表S3）。基于缺乏交联活性以及RufO在rufomycin生物合成中的推定角色，我们接下来探索了RufO硝化肽Nle-1的可能性。使用报道的二酮哌嗪硝化P450 TxtE的方案（利用硝化试剂二乙胺NONOate [DEANO]），我们观察到Nle-1的显著硝化，HR-MS2及与标准品比对证明硝化仅发生在Nle-1的Tyr-3残基上（图2和S13；表S3）。反应动力学测定（表S4；图S14，KM 9.6 ± 2.0 μM，kcat 0.25 ± 0.02 min⁻¹）显示其数值与细菌和人类类固醇代谢P450酶的生物合成转化报道值一致，但比肽交联酶OxyB的报道值慢。
TxtE的机制已被研究，被认为是由血红素铁(III)-过氧亚硝酸盐活性物种催化的，该物种是P450单电子还原的产物。这与典型P450化学不同——典型P450主要依赖高亲电性的铁(IV)-氧代卟啉阳离子自由基物种（化合物I）的活性，其形成需要氧化还原伴侣提供两个电子。为探索RufO的硝化活性是否涉及类似中间体，我们还测试了在DEANO和连二亚硫酸盐（单电子还原剂）存在下、不添加氧化还原伴侣蛋白时的Nle-1硝化（表S5；图S15–S17）。这些测定中检测到了Nle-1的硝化，过氧化物也能维持RufO的硝化活性，尽管水平远低于氧化还原伴侣支持的活性。因此，虽然RufO的硝化机制可能在化合物I形成之前发生、与TxtE报道的机制类似，但仍需进一步实验明确验证。值得注意的是，尽管RufO和TxtE具有相似的反应性，这两种P450在其保守催化残基上并不含有相同的突变（表S2）。
为进一步探索RufO的活性，我们接下来生成了一系列修饰的五肽底物（2–6，图S18–S22）并测试了该P450对它们的接受度。肽2中His-5替换为Trp-5（MRYLW）后，该酶的活性发生逆转——检测不到硝化活性，取而代之的是酶对2表现出交联活性（表S7；图S23）。这支持了MD模拟中观察到的1与P450Blt突变体之间改变的肽结合模式对肽C端的关键作用。由于肽第5位芳香族残基仅对此类P450的交联活性至关重要，我们还测试了His-5替换为非芳香族残基（Asn和Gln）是否仍能支持硝化（表S7；图S24和S25）。然而，这两个探针（3和4）的转化实验显示硝化活性大幅降低，表明中心Tyr-3残基的正确定位部分依赖于His-5的存在。这可能也解释了rufomycin基因簇中MRYLH肽序列的严格保守性（表S8）。将中心Tyr-3残基替换为Phe-3（5）导致硝化活性完全丧失（表S7；图S26），最可能的原因是酚羟基对催化至关重要；而将Leu-4替换为Tyr-4（6）后，尽管该肽中额外出现了一个Tyr残基，硝化仍特异于Tyr-3，但该残基体积增大导致6的交联活性增加（表S7；图S27和S28）。
在观察到RufO与肽2（以及一定程度上的6）之间发生的化学活性切换后，我们接下来测试了将RufO中改变的I-螺旋残基突变为交联酶P450Blt中对应残基的效果。单个Val240突变为Ser的突变体无法以可溶形式产生（提示该突变导致结构不稳定），但Val240Ser/Pro241Val（RufO_SV）双突变体可以成功产生，尽管产量有所降低。该双突变的效果是将活性从Nle-1的硝化逆转为交联（20
【数据】序列一致性：41.6%（RufO与P450Blt）；C-α RMSD：1.8 Å；Nle-1结合亲和力：RufO 0.31 μM、P450Blt 1.1 μM；Soret最大吸收：410 nm；动力学参数：KM 9.6 ± 2.0 μM、kcat 0.25 ± 0.02 min⁻¹；硝化位点：Tyr-3；底物特异性：His-5→Trp-5逆转活性为交联、His-5→Asn/Gln大幅降低硝化、Tyr-3→Phe-3完全丧失硝化、Leu-4→Tyr-4硝化仍特异于Tyr-3；突变体：V240S单突变不可溶、V240S/P241V双突变可产生但产量降低、双突变将硝化逆转为交联
讨论与解读
天然产物生物合成展现了非凡的生物合成智慧。特定生物合成途径本身已能产生化学复杂度极高的化合物，而组装线的协同——如NRPS/PKS杂合系统——能带来更大的结构多样性。尽管已在多种途径中鉴定到越来越多的协同实例，核糖体与非核糖体肽生物合成的整合一直难以捉摸。本研究阐明了rufomycin生物合成中对抗结核活性至关重要的非经典3-NO2-Tyr的产生机制，证明了两类途径如何协同为复杂肽类天然产物提供非经典氨基酸构件（图4）。
近期结合核糖体肽生物合成与其他途径的实例包括：多环萜烯部分添加至RiPP构件，以及肽-氨基酰tRNA连接酶（PEARL）——后者以ATP和tRNA依赖方式催化氨基酸连接至支架肽C端。Rufomycin的生物合成代表了此类生物合成智慧的又一新实例，是首个完整RiPP生物合成途径嵌入非核糖体肽生物合成的报道。
编译者解读
该研究的核心价值在于揭示了一条"核糖体肽先行修饰、NRPS后装配"的全新生物合成逻辑——核糖体合成的小分子五肽充当"硝化平台"，P450酶RufO在其上完成位点特异性硝化后，硝化酪氨酸被释放并接入NRPS组装线。这种"两条肽合成路线交叉供料"的策略在天然产物生物合成中极为罕见。值得关注的是，仅两个活性位点突变即可将RufO的催化活性从硝化切换为交联，这为P450酶的催化多样性演化提供了极佳模型，也为通过酶工程定向改造硝化/交联活性、创制新型抗菌环肽分子开辟了可操作的策略空间。
参考来源
Padva L. Ribosomal pentapeptide nitration for non-ribosomal peptide antibiotic precursor biosynthesis. Chem, 2025. DOI: 10.1016/j.chempr.2025.102438
DOI: 10.1016/j.chempr.2025.102438