来源：A fungal P450 enzyme from Fusarium equiseti HG18 with 7β-hydroxylase activity in biosynthesis of ursodeoxycholic acid（The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular ）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
熊去氧胆酸（UDCA）是治疗肝胆疾病的重要天然活性分子，传统来源受限于熊胆采集的伦理争议，化学合成则存在高能耗与废弃物问题。本研究从木贼镰刀菌（Fusarium equiseti HG18）中筛选并鉴定了新型P450羟化酶P450FE，通过全基因组与转录组测序结合毕赤酵母异源表达，证实其催化石胆酸（LCA）C7β-羟基化生成UDCA的能力。定点突变揭示Q112、V362和L363为关键活性残基，其中V362I突变体UDCA产量较野生型提高2.6倍且立体选择性更优，为绿色合成UDCA提供了新酶源。
研究背景
UDCA天然存在于熊胆中，获批用于胆囊炎、胆结石、胆汁淤积、原发性胆汁性肝硬化等多种肝胆疾病，并对COVID-19有一定疗效。直接从熊胆提取UDCA因违反人道主义而逐渐被禁止；以胆酸（CA）和鹅去氧胆酸（CDCA）为原料的化学合成虽成主流，却产生大量废弃物且能耗高。随着绿色生物制造发展，从CDCA生物合成UDCA因环保、高效、安全而受到关注。LCA作为猪、牛等家禽中丰富且廉价的废弃分离物，因毒性且缺乏可行利用途径而最终被丢弃。因此，以LCA为起始原料、通过酶法7β-羟基化合成UDCA是理想且绿色的路线。部分微生物如Fusarium quisrti、Gibberella zeae和放线菌具有将LCA转化为UDCA的潜力，但负责此过程的7β-羟化酶基因尚未明确鉴定。
研究方法
2.1 材料
LCA和UDCA购自中山百灵制药有限公司（中国中山）。2 × Phanta Flash Master Mix购自Vazyme（中国南京）。HiPure真菌RNA提取试剂盒、HiPure真菌DNA小提试剂盒和HiPure PCR纯化试剂盒购自广州美基生物科技有限公司（中国广州）。放线菌酮（cycloheximide）、氨基乙酰丙酸和SKF-525A购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。所有其他化学品和试剂均为分析级，通过商业途径获得。
【数据】LCA和UDCA来源：中山百灵制药；2 × Phanta Flash Master Mix：Vazyme；RNA/DNA提取试剂盒：广州美基生物；放线菌酮、氨基乙酰丙酸、SKF-525A：上海麦克林
2.2 菌株、培养基与培养条件
F. equiseti HG18保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，中国武汉），保藏编号为CCTCC M2023160。F. equiseti HG18在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（20 g/L马铃薯、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂）中、28°C、微需氧条件下培养5天。用含0.1% Tween 80的无菌蒸馏水洗涤后，将孢子悬浮液（6.5 × 10⁶孢子/mL，2 mL）无菌转接至50 mL种子培养基（20 g/L糊精、14 g/L胰蛋白胨、3 g/L KCl、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O、1 g/L酵母提取物）中，28°C、180 rpm培养48小时。随后，通过5000 rpm离心10分钟收集真菌菌丝体，液氮速冻后于−80°C保存。质粒构建和克隆实验使用Escherichia coli DH5α菌株，在37°C、Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、15 g/L琼脂，pH 7.0）中培养。P. pastoris菌株X33（Biobw，中国北京）作为表达真菌7β-羟化酶的底盘细胞，重组质粒通过醋酸锂转化的标准方案转入X33。
【数据】PDA培养基：20 g/L马铃薯、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂；培养温度：28°C；时间：5 d；孢子浓度：6.5 × 10⁶孢子/mL；接种量：2 mL/50 mL；种子培养基：20 g/L糊精、14 g/L胰蛋白胨、3 g/L KCl、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O、1 g/L酵母提取物；转速：180 rpm；时间：48 h；离心：5000 rpm、10 min；保存温度：−80°C；LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、15 g/L琼脂、pH 7.0；大肠杆菌培养温度：37°C；毕赤酵母转化方法：醋酸锂法
2.3 基因组DNA提取、测序、组装与基因注释
使用真菌DNA提取试剂盒按照制造商说明书从真菌菌丝体中提取基因组DNA。F. equiseti HG18的全基因组测序由北京诺禾致源生物信息科技有限公司（中国北京）使用Illumina NovaSeq PE150测序平台和Nanopore测序平台完成。低质量读段通过SMRT Link v5.0.1过滤，过滤后的读段组装成一条无缺口contig。详细操作如下：
（1）初步组装：原始数据经初步过滤去除一定比例低质量读段（小于500 bp）获得干净数据，然后利用SMRT portal软件的自动纠错功能选择长读段（大于6000 bp）作为种子序列，其他短读段通过BlasR比对到种子序列以进一步提高种子序列准确性，组装获得能初步反映基因组情况的组装结果。
（2）初步组装结果校正：使用SMRT Link软件中的Variant Caller模块，利用arrow算法对初步组装结果中的变异位点进行校正和计数。
基因组组分预测包括编码基因、重复序列和非编码RNA的预测。使用Augustus v2.7程序检索相关编码基因。散在重复序列使用RepeatMasker（http://www.repeatmasker.org/）预测。串联重复序列通过TRF（Tandem repeats finder）分析。转移RNA（tRNA）基因由tRNAscan-SE预测。核糖体RNA（rRNA）基因通过rRNAmmer分析。sRNA、snRNA和miRNA通过与Rfam数据库BLAST比对预测。基因序列通过八个数据库进行功能注释，分别为Gene Ontology（GO）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、Clusters of Orthologous Groups（KOG）、Non-Redundant Protein Database（NR）、Transporter Classification Database（TCDB）、Protein Family Database（Pfam，http://pfam.xfam.org/）、Cytochrome P450 Database（P450）和Swiss-Prot。分泌蛋白通过Signal P数据库预测。同时，次级代谢基因簇通过antiSMASH软件（v5.1）分析。使用Pathogen Host Interactions（PHI）和Database of Fungal Virulence Factors（DFVF）进行致病性和耐药性分析。碳水化合物活性酶通过Carbohydrate-Active enzymes Database（CAZy）预测。使用BLAST+2.13.0（Basic Local Alignment Search Tool）将预测基因与各功能数据库进行比对以完成序列注释。功能注释程序如下：（1）通过全基因组BLAST搜索（BLASTp，E值小于1e−5，最小比对长度百分比大于40%）将预测基因与各功能数据库比对；（2）BLAST结果过滤：对每条BLAST结果序列，选择得分最高（一致性≥ 40%，覆盖率≥ 40%）的序列进行注释。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq PE150 + Nanopore；组装软件：SMRT Link v5.0.1；种子序列长度：>6000 bp；低质量读段过滤阈值：<500 bp；注释数据库：GO、KEGG、KOG、NR、TCDB、Pfam、P450、Swiss-Prot；BLASTp参数：E值<1e−5，最小比对长度>40%；注释过滤阈值：identity ≥ 40%，coverage ≥ 40%
2.4 抑制剂对酶活性的影响
F. equiseti HG18菌株在生长培养基（糊精20 g/L、蛋白胨15 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、酵母提取物1 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、KCl 3 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.036 g/L，pH 7.5）中、28°C、180 rpm培养48小时。通过5000 rpm离心5分钟收集F. equiseti HG18菌丝体，然后用无菌水冲洗两次。洗涤后，将菌体沉淀（5 g湿重）重悬于20 mL无菌水中，以20%接种量接种至发酵培养基B（糊精20 g/L、蛋白胨15 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、酵母提取物1 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、KCl 3 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.036 g/L，pH 7.0）。发酵在含/不含1 mM抑制剂（细胞色素P450抑制剂SKF-525A）和0.5 g/L LCA的条件下、28°C、180 rpm振荡培养12小时。对于蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX），发酵液含0.5 g/L LCA在28°C、180 rpm培养12小时（L-0 h），然后加入1 mM CHX（溶于1%体积/体积DMSO）继续培养12小时（L+CHX-12 h）。同时设置CHX未处理组（L-CHX-12 h）。每组进行三个平行实验。生物转化活性通过高效液相色谱（HPLC）监测。
【数据】生长培养基：糊精20 g/L、蛋白胨15 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、酵母提取物1 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、KCl 3 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.036 g/L、pH 7.5；培养条件：28°C、180 rpm、48 h；离心：5000 rpm、5 min；菌丝体用量：5 g湿重/20 mL无菌水；接种量：20%；SKF-525A浓度：1 mM；LCA浓度：0.5 g/L；CHX浓度：1 mM（溶于1% DMSO）；发酵时间：12 h；平行实验：3组
2.5 LCA诱导*F. equiseti* HG18的7β-羟化酶活性
将真菌菌丝体以20%接种量接种至培养基B中，分别加入0.5 mg/mL LCA培养12小时、24小时、36小时和48小时。将LCA和CHX同时加入真菌培养物中，终浓度分别为1 mg/mL和0.03 mg/mL（溶于1%体积/体积DMSO），在28°C、180 rpm条件下继续培养12小时，对照组仅加入等体积DMSO。同时，诱导后收集培养液样品作为空白对照。最后，取培养发酵液（1 mL）用1 mL乙酸乙酯萃取三次。合并有机相，用氮吹仪处理并重新溶解于1 mL甲醇中，然后用HPLC分析。
【数据】接种量：20%；LCA诱导浓度：0.5 mg/mL；诱导时间：12、24、36、48 h；LCA终浓度：1 mg/mL；CHX终浓度：0.03 mg/mL（溶于1% DMSO）；继续培养：28°C、180 rpm、12 h；萃取：1 mL乙酸乙酯×3次；复溶：1 mL甲醇
2.6 RNA样品制备、完整性检测与RNA测序
在培养基B中，含/不含0.5 g/L LCA培养24小时的真菌菌丝体收集后保存于液氮中，送往诺禾致源（中国北京）使用illumina NovaSeq 6000（illumina，美国）进行转录组测序。使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent RNA 6000 Nano Kit）、电泳和NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Scientific，美国）分别测定RNA完整性、纯度和浓度。每组三个生物学重复用于RNA样品制备、完整性检测和RNA测序。
【数据】LCA浓度：0.5 g/L；诱导时间：24 h；测序平台：illumina NovaSeq 6000；RNA检测：Agilent 2100 Bioanalyzer + NanoDrop 1000；生物学重复：3次/组
2.7 RNA测序数据分析与基因挖掘
原始序列通过去除含adaptor或poly-N的读段以及低质量读段进行预处理。
【数据】原文未详述
2.8 候选基因的克隆与突变
原文未详述。
【数据】原文未详述
2.9 重组质粒在*P. pastoris* X33中的表达
原文未详述。
【数据】原文未详述
2.10 重组*P. pastoris*全细胞生物转化
原文未详述。
【数据】原文未详述
2.11 HPLC分析条件
原文未详述。
【数据】原文未详述
2.12 同源建模与分子对接
原文未详述。
【数据】原文未详述
2.13 定点突变
原文未详述。
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 *F. equiseti* HG18基因组数据评估
#### 3.1.1 F. equiseti HG18基因组的组装与分析
F. equiseti HG18基因组环状图信息如图S1所示。基因组组装和注释统计汇总见表1。组装过程产生14个contig，估计基因组大小为38,645,260 bp，GC含量为48.08%。N50长度为3,843,907 bp。预测蛋白编码基因共11,904个，估计总长度为18,665,816 bp，占F. equiseti HG18基因组总长度的48.30%。RNA方面，预测到451个RNA基因，包括355个tRNA和96个rRNA（含5 S rRNA 78个、18 S rRNA 8个、28 S rRNA 10个）（表S2）。散在核元件和串联重复序列的长度分别为187,603 bp和175,926 bp（表S3和S4）。目前，F. equiseti物种的另一个基因组已有报道，部分信息可在美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中获取。23个F. equiseti基因组的组装统计汇总于表S5。其中，本研究的F. equiseti HG18和F. equiseti D25–1表现出相似的GC含量但基因组大小明显不同。此外，F. equiseti HG18菌株的contig数量少于全部22个F. equiseti菌株（表S5）。
【数据】基因组大小：38,645,260 bp；GC含量：48.08%；N50长度：3,843,907 bp；contig数：14个；蛋白编码基因：11,904个（总长18,665,816 bp，占48.30%）；RNA基因：451个（tRNA 355个、rRNA 96个：5S 78个、18S 8个、28S 10个）；散在核元件：187,603 bp；串联重复序列：175,926 bp
#### 3.1.2 基因与功能注释
F. equiseti HG18基因组中所有候选基因与多个蛋白质数据库的注释结果见表S6。在F. equiseti HG18蛋白编码基因中（表1），有11,723个基因在NR数据库中获得注释，其中排名前三的物种为Fusarium flagelliforme（7398个基因）、Fusarium coffeatum（2678个基因）和Fusarium clavum（479个基因），占所有候选基因的98.48%（图S2）。Swiss-prot和Pfam数据库中的注释基因数分别为3554和7770个，分别占预测基因的29.86%和65.27%。为更好理解F. equiseti HG18的遗传功能，分别有2056、770、732和496个基因注释到PHI、CAZy、TCDB和DFVF数据库。总体而言，11,802个基因通过BLAST获得至少一种功能注释，占F. equiseti HG18基因组总预测基因的99.14%。有2148个预测蛋白归属KOG类别（图S3）。KOG数据库注释显示，参与“翻译后修饰、蛋白质周转和分子伴侣”（235个）、“翻译、核糖体结构和生物发生”（201个）和“氨基酸转运和代谢”（200个）的基因数量最多。这些发现表明存在多种蛋白质代谢和能量代谢功能，可能有利于底物的转化。GO数据库注释到7770个基因，分布于三大类：生物学过程（24个亚类）、细胞组分（11个亚类）和分子功能（13个亚类）。功能分类如图S4所示，GO数据库基因最丰富的类别是生物学过程中的细胞过程（4130个基因）和代谢过程（4247个基因）。细胞组分中，有3092个编码基因参与细胞和细胞部分，其次有1311个编码基因参与细胞器。分子功能中，结合和催化活性占主导地位，分别有4143和4024个编码基因。通过KEGG比对，11,040个预测蛋白归属KEGG分类，占所有候选基因的92.74%（图S5），其中代谢类基因数量最多（2842个），最丰富的是“全局和概览图谱”（1048个基因），其次是“碳水化合物代谢”（396个）和“氨基酸代谢”（337个）。P450数据库注释结果如图S6所示。在F. equiseti HG18基因组中共鉴定出172个候选P450基因，包括十个主要类别。其中，大多数基因（65个）编码E-class P450 group I，其次是E-class P450 group IV（42个基因）；细胞色素P450（14个基因）；豌豆素脱甲基酶样（10个基因）；P450 CYP52（10个基因）；E-class P450 CYP2D（3个基因）；E-class P450 CYP2A（2个基因）；线粒体P450 CC24（1个基因）和B-class P450（1个基因）。
【数据】NR注释基因：11,723个（98.48%）；Swiss-prot注释：3554个（29.86%）；Pfam注释：7770个（65.27%）；PHI注释：2056个；CAZy注释：770个；TCDB注释：732个；DFVF注释：496个；至少一种注释：11,802个（99.14%）；KOG注释蛋白：2148个；GO注释基因：7770个；KEGG注释蛋白：11,040个（92.74%）；P450候选基因：172个（E-class group I 65个、E-class group IV 42个、CYP 14个、 Pisatindemethylase-like 10个、CYP52 10个、CYP2D 3个、CYP2A 2个、线粒体CC24 1个、B-class 1个）
3.2 抑制剂对LCA生物转化中酶活性的影响
研究发现丝状真菌可参与大量复杂的生物转化，如烷烃、萜烯、脂肪酸、黄酮类、甾醇的羟基化以及外源物质的解毒。其中，CYP450作为广泛使用的生物催化剂可能负责这些生物过程，包括羟基化、环氧化、脱烷基、脱氨基和脱卤反应。为更好理解参与LCA生物转化的酶，评估了抑制剂SKF-525A和CHX对酶活性的影响。SKF-525A是已知的CYP450抑制剂，结果显示SKF-525A能显著抑制LCA生物转化为UDCA的酶活性（图1A），表明CYP450可能负责LCA到UDCA的催化过程。此外，CHX是真核生物蛋白质合成抑制剂，CHX处理组（L+CHX-12 h）的酶活性与空白组（L-0 h）基本相同，且低于CHX未处理组（L-CHX-12 h），表明CHX也能显著抑制催化LCA转化为UDCA的7β-羟基化活性（图1B）。
【数据】SKF-525A浓度：1 mM；CHX浓度：1 mM（溶于1% DMSO）；LCA浓度：0.5 g/L；培养时间：12 h；SKF-525A效果：显著抑制酶活性；CHX处理组酶活性≈空白组<未处理组
3.3 LCA诱导*F. equiseti* HG18的7β-羟化酶
此前研究发现F. equiseti HG18能将LCA转化为UDCA。如图2所示，LCA诱导培养物在12小时、24小时、36小时和48小时培养后，其7β-羟基化活性均明显高于未诱导对照组。F. equiseti HG18中负责LCA 7β-羟基化的酶的可诱导性得到证实。与其他诱导结果相比，UDCA产量的增加表明12小时间隔内24小时诱导水平最高。因此，选择24小时诱导的样品进行转录组测序。
【数据】LCA诱导浓度：0.5 mg/mL；诱导时间：12、24、36、48 h；最佳诱导时间：24 h（UDCA产量最高）；统计显著性：p < 0.01，*p < 0.001；数据表示：mean ± SEM（n = 3）
3.4 转录组数据分析与挖掘
去除adaptor相关或poly-N读段及低质量读段后，干净读段数为40.26–45.18百万（表S7）。各组的测序错误率约为0.03%，Q20和Q30值均超过93%，GC含量无偏倚。超过97%的干净读段比对到F. equiseti HG18参考基因组（表S8）。这些数据表明F. equiseti HG18的RNA-seq数据可靠，可用于下游分析。根据差异显著性标准，使用调整后倍数变化≥ 2.0和padj ≤ 0.05作为阈值来鉴定LCA诱导组和对照组之间的DEGs。如图3所示，比较中共有47个DEGs，包括37个上调基因和10个下调基因。为探索上调基因的功能，对F. equiseti HG18进行了24小时LCA诱导的比较转录组分析。上调基因中鉴定出25个显著富集的GO条目（图S7），功能主要涉及胞内膜结合细胞器、初级活性跨膜转运蛋白复合物和ATPase活性。KEGG分析揭示了上调基因中20条显著富集的KEGG通路（图S8），主要涉及生物转化过程中的次级代谢产物生物合成、碳代谢和类固醇生物合成，表明LCA激活了生物合成和特定代谢过程。
【数据】干净读段数：40.26–45.18百万；测序错误率：约0.03%；Q20/Q30：>93%；比对率：>97%；DEGs：47个（37个上调、10个下调）；阈值：|log2FoldChange| ≥ 2.0、padj ≤ 0.05；显著GO条目：25个；显著KEGG通路：20条
3.5 候选P450基因的筛选与功能验证
原文未详述。
【数据】原文未详述
3.6 P450FE的同源建模与结构分析
原文未详述。
【数据】原文未详述
3.7 分子对接分析
原文未详述。
【数据】原文未详述
3.8 定点突变验证关键氨基酸残基
原文未详述。
【数据】原文未详述
讨论与解读
甾体衍生物的选择性羟基化是多种甾体药物工业化合成的关键步骤。细胞色素P450酶因其广泛的底物范围和优异的催化多功能性，在甾体羟基化中发挥重要作用。真菌基因组含有丰富的P450基因，是巨大的P450酶库。因此，开发真菌来源的P450酶用于甾体药物工业化已成为近年研究热点。尽管已发现多种真菌能催化甾体不同位点的羟基化，但编码甾体羟化酶的基因鉴定仍然较少。例如，来自Thanatephorus cucumeris、Curvularia sp.VKM F-3040、Absidia orchidis的真菌中发现了甾体的7α-/7β-、2β-、11α-/11β-、19β-羟化酶，如CYP5150AP3、CYP5150AN1、P450cur、CYP5150AP2、CYP68J5和CYP5311B2。通过区域和立体选择性羟基化LCA生物合成UDCA是一种优势策略，在替代天然动物来源的熊去氧胆酸方面具有良好应用前景。研究团队通过菌株筛选发现F. equiseti HG18对LCA具有7β-羟化酶活性。基于此发现，首次对F. equiseti HG18进行基因组测序，通过比较差异表达基因获取相关P450酶的基因组信息。
编译者解读：本研究展示了从基因组挖掘到功能验证的完整P450酶发现流程——以全基因组和转录组测序锁定候选基因，以毕赤酵母异源表达确认催化功能，再以同源建模、分子对接和定点突变解析结构-功能关系。这种"组学筛选+生化验证+蛋白工程"的组合策略，为从真菌资源中开发工业用甾体羟化酶提供了可复制的范式。V362I突变体2.6倍的活性提升提示，基于结构信息的理性改造在提高P450催化效率和立体选择性方面潜力可观。后续研究若能进一步提升UDCA产量并解析底物通道的动态调控机制，将推动LCA绿色生物合成UDCA的工业化进程。
参考来源
Zhou Zhen-Ru. A fungal P450 enzyme from Fusarium equiseti HG18 with 7β-hydroxylase activity in biosynthesis of ursodeoxycholic acid. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2024. DOI: 10.1016/j.jsbmb.2024.106507
DOI: 10.1016/j.jsbmb.2024.106507