来源：Mining and characterization of a novel cytochrome P450 MaCYP71BG22 involved in the C4-stereoselective hydroxylation of 1-deoxynojirimycin biosynthesis in mulberry leaves（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
1-脱氧野尻霉素（DNJ）是桑叶中具有显著降糖活性的多羟基哌啶生物碱，其生物合成途径中从2-甲基哌啶到最终产物的羟基化步骤一直悬而未决。本研究通过转录组筛选锁定5个与DNJ含量显著相关的CYP450羟化酶基因，并首次克隆表征了MaCYP71BG22——该酶能够立体选择性地催化(R)-2-甲基哌啶C4位羟基化，生成(2R,4R)-2-甲基哌啶-4-醇。过表达与沉默实验证实其在DNJ积累中的关键作用，点突变G460E进一步提升催化效率。这是桑叶哌啶生物碱生物合成中CYP450羟化酶的首例报道。
研究背景
桑叶既是传统药材也是食品资源，自古用于糖尿病的防治。现代药理学证实其降糖功效主要源于多羟基生物碱成分DNJ。DNJ结构类似葡萄糖，以NH基团取代吡喃糖环上的氧原子，通过竞争性抑制肠道葡萄糖吸收、结合葡萄糖苷酶催化位点、减缓肝糖原转化及改善胰岛素抵抗等机制实现降糖效果。此外，DNJ还具备降脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤及增强肝功能等作用，且有证据表明α-葡萄糖苷酶抑制剂可用于治疗COVID-19。然而，桑叶中DNJ干重含量仅0.1%–0.5%，远不能满足市场需求。化学合成DNJ存在步骤繁琐、立体选择性控制困难等问题，因此阐明其生物合成途径、尤其是关键的羟基化步骤，对异源合成DNJ具有重要意义。本研究聚焦于桑叶DNJ生物合成中CYP450羟化酶的挖掘与功能验证。
研究方法
2.1 植物材料
桑叶样品采集自江苏大学桑树种植园。于2022年7月15日至11月15日期间，每月5日、15日、25日上午9:00采集桑树顶部第1至第3片嫩叶。每份样品一部分于−80°C保存用于RNA提取，其余部分干燥后用于DNJ含量测定。
【数据】采样地点：江苏大学桑园；采样时间：2022年7月15日至11月15日，每月5/15/25日9:00；样品部位：顶部第1-3片嫩叶；保存温度：−80°C
2.2 总RNA分离与cDNA合成
使用TRIzol试剂（Fubo Biotech，徐州，中国）提取不同时期桑叶总RNA。RNA浓度和质量分别通过ND-1000紫外分光光度计（Thermo，Madison，WI）和1%琼脂糖凝胶检测。第一链cDNA使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）合成。
【数据】RNA提取试剂：TRIzol；检测仪器：ND-1000紫外分光光度计、1%琼脂糖凝胶；cDNA合成试剂盒：Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit
2.3 DNJ生物合成途径中CYP450s羟化酶DEGs的发现
基于前期发现桑叶DNJ积累量在7月达到峰值、11月最低的研究结果[29,30]，利用Illumina HiSeq 2500平台（Sangon Biotech，上海，中国）对这两个时期的叶片样本进行转录组测序。原始转录组数据已提交至Sequence Read Archive（SRA，登录号SRP127713）。通过生物医学数据库对所有unigenes进行功能注释，筛选与CYP450s羟化酶相关的差异表达基因（DEGs）[29]。两组样本间的基因表达分析采用FPKM（每百万碱基对转录本片段数）方法，DEGs使用DEseq2鉴定（表达比率>2且P≤0.01）。
【数据】测序平台：Illumina HiSeq 2500；SRA登录号：SRP127713；DEGs筛选标准：表达比率>2且P≤0.01；比对方法：FPKM；分析软件：DEseq2
2.4 CYP450s羟化酶DEGs表达水平与DNJ含量的相关性分析
使用Fast Start Essential DNA Green Master试剂盒（Roche，瑞士）和Light Cycler 96实时荧光定量PCR系统（Roche，Basel，瑞士）对CYP450s羟化酶DEGs进行qRT-PCR分析。基因特异性引物使用在线软件设计（http://primer3.ut.ee/），列于表S2。PCR程序如下：95°C变性300秒，随后45个循环的95°C 15秒、61°C 20秒、72°C 15秒，最后进行熔解循环。反应结束后确定阈值循环（Ct）值，以β-actin基因（GenBank登录号XM_010112836.2）为内参，采用2−ΔΔCt方法计算表达变化。桑叶中DNJ含量采用前期建立的方法测定——提取物经氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）衍生化后，用配备荧光检测器（FLD）的高效液相色谱（HPLC）分析[29]。每次测定设三次重复。
【数据】qRT-PCR试剂：Fast Start Essential DNA Green Master；仪器：Light Cycler 96；PCR程序：95°C 300s预变性，45循环（95°C 15s，61°C 20s，72°C 15s）；内参基因：β-actin；分析方法：2−ΔΔCt；DNJ衍生化试剂：FMOC-Cl；检测：HPLC-FLD；重复次数：3次
2.5 MaCYP71BG22的克隆与生物信息学分析
使用DreamTaq DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）通过PCR（35个循环：94°C 10秒，62°C 30秒，72°C 93秒）从cDNA中扩增CYP450羟化酶开放阅读框（ORF），克隆至pMD18-T载体（TaKaRa Biotechnology，大连，中国）。所有引物列于表S3。构建体转化至大肠杆菌（E. coli）DH5α感受态细胞（Tiangen Biotech，北京，中国），以氨苄青霉素抗性筛选。阳性克隆经PCR和测序确认（Sangon Biotech，上海，中国）。核苷酸和保守结构域分析使用国家生物技术信息中心（NCBI）数据库，蛋白序列提交至CYP450命名委员会（http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html）（表S1）。系统发育树和多重序列比对使用MEGA 5.0软件生成。MaCYP71BG22的理化特性通过ExPASy ProtParam工具（http://web.expasy.org/protparam/）检测，信号肽和跨膜螺旋的存在分别使用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）和SignalP 4.1服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测。二级和三级结构分别使用SOPMA二级结构预测方法（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/）预测。
【数据】PCR循环：35个循环（94°C 10s，62°C 30s，72°C 93s）；克隆载体：pMD18-T；宿主菌：E. coli DH5α；筛选标记：氨苄青霉素；分析工具：NCBI、MEGA 5.0、ExPASy ProtParam、TMHMM、SignalP 4.1、SOPMA、SWISS-MODEL
2.6 MaCYP71BG22的酵母表达与微粒体制备
将CYP450羟化酶ORF插入pESC-TRP载体（Zeye Biotechnology，上海，中国）的Xho I-Kpn I限制性酶切位点之间，使用相应的限制性内切酶。重组载体转化至含有拟南芥NADPH-CYP还原酶的酿酒酵母（S. cerevisiae）WAT11菌株，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research，Irvine，CA，USA）。pESC-TRP载体作为对照。转化子在不含色氨酸的固体合成完全培养基（SC-TRP）上培养以筛选阳性转化子，并经PCR确认。阳性转化子在100 mL含2%葡萄糖的SC-TRP培养基中、200 rpm、30°C培养16小时，然后在100 mL含2%半乳糖（替代葡萄糖）的SC-TRP培养基中、相同条件下培养12小时。富含MaCYP71BG22的微粒体按照Guo等人[31]的方法采用玻璃珠法分离。
【数据】载体：pESC-TRP；酶切位点：Xho I-Kpn I；宿主菌：S. cerevisiae WAT11；转化试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit；筛选培养基：SC-TRP；第一阶段培养：100 mL SC-TRP+2%葡萄糖，200rpm，30°C，16h；第二阶段培养：100 mL SC-TRP+2%半乳糖，200rpm，30°C，12h；微粒体提取：玻璃珠法
2.7 MaCYP71BG22体外酶活性测定
微粒体悬浮于含50 mM Tris-HCl（pH=7.5）、1 mM EDTA和20%（v/v）甘油的储存缓冲液中。初始体外羟基化测定在500 μL反应体系中进行，包含100 mM Tris-HCl（pH=7.5）、250 μg微粒体蛋白、5 mM (R)-2-甲基哌啶（CAS: 1722-95-8；Aladdin，上海，中国）和1 mM NADPH。反应在30°C振荡孵育4小时，然后立即在−80°C冷冻终止，预冻6小时后转移至真空冷冻干燥机（ALPHA 1–2 LD，Marin Christ，Osterode，德国）。产物用400 μL甲醇重新溶解，经0.22 μm滤膜过滤，通过气相色谱-质谱联用（GC–MS）分析。
【数据】储存缓冲液：50mM Tris-HCl（pH=7.5）+1mM EDTA+20%甘油；反应体系：500μL（100mM Tris-HCl pH=7.5，250μg微粒体蛋白，5mM (R)-2-甲基哌啶，1mM NADPH）；反应条件：30°C振荡4h；终止：−80°C冷冻；冻干：预冻6h后真空冷冻干燥；复溶：400μL甲醇；过滤：0.22μm滤膜
2.8 MaCYP71BG22摇瓶培养
将验证过的重组质粒转化至S. cerevisiae WAT11菌株，获得表达菌株MaCYP71BG22/pESC-TRP/WAT11。该菌株按前述方法在300 mL培养基中培养。诱导细胞离心后重悬于300 mL含2%半乳糖的SC-TRP诱导培养基中，30°C、200 rpm培养5小时以诱导重组蛋白表达。随后向培养物中加入(R)-2-甲基哌啶至终浓度5 mM，继续培养48小时。发酵液离心收集。收集的发酵液真空浓缩，重悬于1 mL甲醇中用于下述LC/MS分析。为获得足够化学结构分析的酶产物量，使用相同配方的摇瓶培养放大至3 L体积。
【数据】培养体积：300mL（放大至3L）；诱导：300mL SC-TRP+2%半乳糖，30°C，200rpm，5h；底物添加：(R)-2-甲基哌啶终浓度5mM；诱导培养：48h；产物处理：真空浓缩后重悬于1mL甲醇
2.9 GC–MS、LC/MS、NMR分析
GC–MS分析使用配备Rtx-5毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）的SHIMADZU GC–MS系统。氦气为载气，流速1 mL/min，进样口温度250°C。升温程序：60°C保持5分钟，以10°C/min升至100°C保持3分钟，再以20°C/min升至280°C保持5分钟。分流比1:30。质谱采用电子轰击（EI）电离模式，离子源温度230°C，接口温度250°C，扫描范围50–200 m/z。MaCYP71BG22酶产物首先通过二氯甲烷/甲醇（10:1）洗脱、硅胶柱色谱从甲醇重悬残留物中分离，随后——
【数据】色谱柱：Rtx-5（30m×0.25mm×0.25μm）；载气：氦气，1mL/min；进样口温度：250°C；升温程序：60°C 5min→10°C/min至100°C 3min→20°C/min至280°C 5min；分流比：1:30；电离模式：EI；离子源温度：230°C；接口温度：250°C；扫描范围：50-200 m/z；分离方法：硅胶柱色谱，二氯甲烷/甲醇（10:1）
研究结果
3.1 基于转录组数据的CYP450s羟化酶DEGs发现
通过对桑叶转录组中所有unigenes的功能注释分析，共筛选到514个编码CYP450s羟化酶的基因。其中31个DEGs显著下调（图2B，C）。这些下调基因与桑叶中DNJ含量的变化趋势一致——7月表达量最高，11月最低。桑叶中DNJ含量是否与这31个CYP450s羟化酶DEGs的表达水平相关，需要进一步研究。前期研究已对这31个CYP450s羟化酶DEGs中的部分差异基因进行了qRT-PCR分析[29]。本研究对其中13个CYP450s羟化酶DEGs进行qRT-PCR，这些基因来自前期的差异分析和转录组谱的进一步筛选。这13个初始DEGs的Unigene基因（Gene_id）及对应FPKM值、qRT-PCR特异性引物见表S2。
【数据】CYP450s羟化酶基因总数：514个；显著下调DEGs：31个；qRT-PCR验证DEGs：13个
3.2 DNJ含量与CYP450s羟化酶DEGs表达水平的相关性研究
桑叶中DNJ含量在不同时间点的动态变化如图1B所示。7月15日含量最高，为4.51 ± 0.11 mg/g；11月15日含量最低，为1.44 ± 0.01 mg/g，从7月到11月呈持续下降趋势。两个样本间的差异具有统计学意义（P < 0.001）。这一趋势与前期研究结果一致[29,30]。不同时间点CYP450s羟化酶DEGs表达值分析显示，c21932_g1（R = 0.747，P < 0.01）、c35175_g1（R = 0.742，P < 0.01）、c36241_g1（R = 0.858，P < 0.001）和c82220_g1（R = 0.694，P < 0.01）在7月和8月表达水平较高，11月表达水平最低，且这些基因的表达水平与DNJ含量呈显著正相关，如图1B和表1所示。c27835_g1（R = −0.618，P < 0.05）在7月表达较低，11月表达较高，其表达水平与DNJ含量呈显著负相关（图1B，表1）。其他基因的表达水平与DNJ含量的变化无相关性（图S1，表1）。这种差异可能源于CYP450s具有多种催化功能，调控多种次生代谢产物的合成。因此，推测候选基因c21932_g1、c35175_g1、c36241_g1、c82220_g1和c27835_g1可能在桑叶DNJ生物合成中发挥作用。DNJ作为多羟基化生物碱，其生物合成途径可能由多种CYP450s羟化酶催化。本研究选择c21932_g1进行体外和体内功能表征，其他酶基因正在研究中。
【数据】DNJ最高含量：4.51±0.11 mg/g（7月15日）；DNJ最低含量：1.44±0.01 mg/g（11月15日）；统计差异：P<0.001；正相关基因及系数：c21932_g1（R=0.747，P<0.01）、c35175_g1（R=0.742，P<0.01）、c36241_g1（R=0.858，P<0.001）、c82220_g1（R=0.694，P<0.01）；负相关基因及系数：c27835_g1（R=−0.618，P<0.05）
3.3 MaCYP71BG22的分子克隆与生物信息学分析
c21932_g1核苷酸序列已提交GenBank（登录号OQ874782.2）并提交至CYP450命名委员会，被命名为MaCYP71BG22。分离的MaCYP71BG22 cDNA克隆包含1446个核苷酸，编码481个氨基酸的多肽。该多肽的理论分子式为C2458H3834N680O711S20，分子量（Mw）为54.92 kDa，等电点（pI）为6.00。包含59个带正电荷残基（Arg + Lys）和69个带负电荷残基（Asp + Glu）。多重序列比对表明MaCYP71BG22具有真核CYP450保守结构域：螺旋K区EXXR、螺旋I区（A/G）GX(D/E)T和血红素结合区FGXGXXXCXG（图2D，图S5）。系统发育分析显示MaCYP71BG22与川桑（Morus notabilis）的MnCYP71A1亲缘关系最近（99.01%同一性），其次是 Cannabis sativa 的CsCYP450（77.48%同一性）和 Trema orientale 的ToCYP450（77.21%同一性）（图2A）。预测分析表明MaCYP71BG22基因编码的蛋白缺乏跨膜结构域和信号肽，确认其不是分泌蛋白（图S2，S3）。二级结构和结构域预测显示，该蛋白46.57%为α-螺旋，延伸链12.68%，β-转角5.82%，无规卷曲34.93%（图S4）。进一步的结构域预测在目标序列中鉴定出CYP450特异性结构域。使用SWISS-MODEL以细胞色素P450 71A1样晶体结构（PDB登录号：A0A443NOR3.1.A）为模板进行MaCYP71BG22三维结构的同源建模，GMQE值为0.90，序列覆盖率为98%，相似度为52%（图S6）。
【数据】cDNA长度：1446个核苷酸；编码氨基酸：481个；分子式：C2458H3834N680O711S20；分子量：54.92kDa；等电点：6.00；正电荷残基：59个；负电荷残基：69个；与MnCYP71A1同一性：99.01%；与CsCYP450同一性：77.48%；与ToCYP450同一性：77.21%；二级结构：α-螺旋46.57%、延伸链12.68%、β-转角5.82%、无规卷曲34.93%；建模GMQE：0.90；序列覆盖率：98%；相似度：52%
3.4 MaCYP71BG22体外酶活性测定
提取MaCYP71BG22微粒体进行体外酶活性测定，以(R)-2-甲基哌啶为底物，100 mM Tris-HCl为缓冲体系。GC–MS结果显示，MaCYP71BG22微粒体蛋白能够催化(R)-2-甲基哌啶（RT = 11.22 min）的羟基化反应，产物保留时间为11.98 min，质谱碎片为m/z = 115（图3A，B）。空载体转化的酵母在该保留时间未观察到活性（图3A）。DNJ在哌啶环C2位有羟甲基、C3、C4和C5位有羟基，这增加了羟基化位点确定的复杂性。为确定MaCYP71BG22在哌啶环上的具体羟基化位置，在放大摇瓶培养后，使用制备型LC和硅胶柱色谱纯化氧化产物。
【数据】底物保留时间：11.22min；产物保留时间：11.98min；产物质谱碎片：m/z=115；缓冲液：100mM Tris-HCl；底物：(R)-2-甲基哌啶
3.5 MaCYP71BG22在酿酒酵母WAT11菌株中的表达与生化检测
通过LC/MS检测MaCYP71BG22酵母工程菌的羟基化产物。结果显示，在携带MaCYP71BG22的酵母工程菌提取物中，保留时间17.12 min处检测到一个新产物，而空载体转化的酵母（对照）中不存在该产物。质谱数据在正离子模式下显示新产物的分子离子为m/z = 116（图4B，C，S7）。为获得足量化合物用于NMR分析，将该转基因酵母进行3 L规模培养。随后，通过制备型LC分离获得2.8 mg (2R, 4R)-2-甲基哌啶-4-醇，高分辨质谱（HRMS）确定其精确质量分子式为m/z = 116.1071（图4D）。这些研究表明，酿酒酵母全细胞生物催化系统可用于桑叶CYP450s羟化酶的功能表征。
【数据】产物保留时间：17.12min；分子离子峰：m/z=116（正离子模式）；培养规模：3L；分离产量：2.8mg (2R,4R)-2-甲基哌啶-4-醇；HRMS精确质量：m/z=116.1071
3.6 NMR数据
发酵产物经制备型LC和硅胶柱色谱获得后，溶解于DMSO‑d6中进行一维NMR（1H NMR和13C NMR）和二维NMR（1H 1H COSY、HSQC、HMBC和NOESY）分析。波谱数据将该化合物鉴定为(2R, 4R)-2-甲基哌啶-4-醇，所有NMR信号如下（图4E）。13C化学位移（δ 65.1）确认C4为氧承载位点，H-3的H-5氢原子化学位移的分裂表明C4位的羟基具有立体构型（图S8，S9）。(2R, 4R)-2-甲基哌啶-4-醇：1H NMR（400 MHz，DMSO‑d6）：δ 3.60–3.53（m，1H），3.17–3.12（m，1H），3.02–2.96（m，1H），2.78–2.71（m，1H），1.91–1.82（m，2H），1.40（tdd，J = 13.3, 10.9, 4.4 Hz，1H），1.23（t，J = 12.3 Hz，1H），1.18（d，J = 6.4 Hz，3H）。13C NMR（101 MHz，DMSO‑d6）：δ 65.1, 50.4, 41.9, 40.3, 31.7, 19.1。其HSQC谱显示了同一CH原子的相关性（图S10），HMBC和1H 1H COSY谱进一步确认了C3-C4-C5原子的连接性（图S11，S12）以及哌啶环上羟基的位置。其NOESY谱显示H-7（δH = 1.19）与——
【数据】NMR溶剂：DMSO-d6；13C化学位移（C4）：δ65.1；1H NMR和13C NMR信号：已归属；二维NMR：COSY、HSQC、HMBC、NOESY
3.7 MaCYP71BG22在桑叶中的生理功能
【数据】原文未详述
3.8 MaCYP71BG22羟化酶潜在底物识别位点预测及单残基突变对催化活性的影响
【数据】原文未详述
讨论与解读
DNJ具有(2R, 3R, 4R, 5S)-2-(羟甲基)-3,4,5-三羟基哌啶的结构式，其立体中心（C2α、C3、C4和C5）对阐明下游生物合成途径至关重要[37–39]。生物合成途径中烃骨架的高效氧化通常由CYP450s完成，被认为是生物工程和合成生物学的主要参与者。特别是CYP71家族是sarpagan[40]、strychnos[41]、akuammilan[42]、aspidosperma[43]和spirooxindole[44]等生物碱生物合成多样化的关键驱动力。Van Laere K团队鉴定CYP71亚家族为菊苣（Cichorium intybus var. sativum）倍半萜内酯（SLs）苦味化合物生物合成途径中的关键酶基因，通过调控其表达影响SL积累[45]。值得注意的是，CYP450s羟化酶在氧化CH键时对立体化学和区域化学表现出高选择性[46,47]。在甜罗勒（Ocimum basilicum）中，CYP716A252和CYP716A253催化α-香树脂醇和β-香树脂醇C-28位的连续三步氧化，分别产生熊果酸和齐墩果酸。在紫杉醇生物合成中，5α-、10β-、13α-、7β-和2α-羟化酶（TcCYP725A4、TcCYP725A1、TcCYP725A2、TcCYP725A5和TcCYP725A6）分别立体选择性地氧化二萜骨架的C5、C10、C13、C7和C2位[48–52]。
本研究首次报道了参与桑叶哌啶生物碱生物合成的CYP450羟化酶，证明MaCYP71BG22在DNJ生物合成中选择性催化(R)-2-甲基哌啶的C4位立体选择性羟基化。这一发现填补了DNJ生物合成途径中从2-甲基哌啶到最终产物之间羟基化步骤的认知空白。研究还通过点突变鉴定出关键残基G460，G460E突变增强了酶的催化效率，为后续酶工程改造提供了靶点。同时，酿酒酵母全细胞生物催化系统的成功应用也为其他植物CYP450s羟化酶的功能表征提供了可行方案。
编译者解读：本研究的意义不仅在于填补了DNJ生物合成途径的空白，更在于展示了从转录组挖掘到功能验证的完整CYP450研究范式。将植物来源的膜结合P450酶转入酵母系统进行表征，并利用全细胞生物催化实现产物制备，这一策略对合成生物学中植物天然产物的异源生产具有直接参考价值。G460E突变增强催化效率的发现提示，通过理性设计可以进一步优化该酶的催化性能，为DNJ的微生物异源合成奠定基础。不过，目前酶催化效率仍处于较低水平，后续研究若能在蛋白质工程和代谢通量优化方面持续深入，有望推动DNJ的绿色生物制造。
参考来源
Liao Y, et al. Mining and characterization of a novel cytochrome P450 MaCYP71BG22 involved in the C4-stereoselective hydroxylation of 1-deoxynojirimycin biosynthesis in mulberry leaves. International Journal of Biological Macromolecules, 2024. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.136941
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.136941