来源：Balancing nitrogen metabolism to efficiently drive anti-tuberculosis ilamycins biosynthesis in Streptomyces atratus（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
深海来源的链霉菌 SCSIO ZH16 能产生纳摩尔级抗结核活性的衣霉素类化合物，但产量极低制约了工业化开发。本研究通过时间序列转录组学挖掘天然启动子，平衡生物合成基因簇表达与氮代谢前体供给，构建的工程菌株在 5-L 和 500-L 生物反应器中分别达到 2,546.4 mg/L 和 1,993.9 mg/L 的衣霉素产量，较此前报道实现数量级突破。
研究背景
衣霉素（ilamycins，又称 rufomycins）是一类具有显著抗结核活性的非核糖体环肽，最早于 20 世纪 60 年代由日本科学家从链霉菌中发现。其中衣霉素 E 对结核分枝杆菌的活性达 9.8 nM，且靶点 ClpC1 为全新药物靶点，同时对三阴性乳腺癌也具有潜在活性。目前已有十余种衣霉素被分离鉴定，衣霉素 E 活性最强，其次为衣霉素 B1 和 F。深海沉积物（水深约 4000 米）中分离的 S. atratus SCSIO ZH16 被确认为新的衣霉素产生菌，其生物合成基因簇（BGC）已明确，但表达调控研究匮乏，导致产量极低。前期研究发现，衣霉素高产菌株中氮代谢相关基因表达上调——氮代谢产生的氨基酸是衣霉素合成的前体。本研究旨在通过平衡 BGC 表达与氮代谢，系统优化衣霉素产量。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用及构建的菌株和质粒分别列于表 S1 和表 S2。所有引物由金唯智（中国苏州）合成，列于表 S3。质粒构建使用大肠杆菌 DH5α，接合转移供体菌为大肠杆菌 S17-1。构建菌株的示意图及 PCR 验证结果列于图 S1–S5。
2.2 培养基与培养条件
S. atratus SCSIO ZH16（野生型）及其衍生菌株分别在 YMS 平板（酵母提取物 4 g/L、麦芽提取物 10 g/L、可溶性淀粉 4 g/L、燕麦粉 10 g/L、CaCO₃ 2 g/L、琼脂 20 g/L，pH 7.2–7.4）和 AM2ab 液体培养基（葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 2 g/L、酵母提取物 2 g/L、大豆粉 5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、KH₂PO₄ 0.5 g/L、NaCl 4 g/L、CaCO₃ 2 g/L、海盐 30 g/L，pH 7.2–7.4）中分别进行产孢和种子培养。衣霉素产生用摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖 120 g/L、大豆粉 20 g/L、玉米浆 2.4 g/L、NaCl 6 g/L、NaNO₃ 9.6 g/L、KH₂PO₄ 0.24 g/L、(NH₄)₂SO₄ 6.4 g/L、CaCO₃ 9.6 g/L，pH 7.0。5-L 生物反应器发酵培养基组成为：可溶性淀粉 120 g/L、大豆粉 23.49 g/L、玉米浆 2.4 g/L、NaCl 6 g/L、NaNO₃ 9.6 g/L、KH₂PO₄ 0.24 g/L、(NH₄)₂SO₄ 4.68 g/L、CaCO₃ 17.67 g/L，pH 5.0。接合转移用 ISP4 培养基组成为：可溶性淀粉 10 g/L、(NH₄)₂SO₄ 2 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 1 g/L、NaCl 1 g/L、CaCO₃ 2 g/L、琼脂 20 g/L、MnCl₂·4H₂O 0.001 g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.001 g/L、MgCl₂·6H₂O 4.07 g/L，自然 pH。详细培养条件参考前期研究（Zhu et al., 2022）。大肠杆菌按标准方法在固体和液体 Lucia-Bertani（LB）培养基中培养。
【数据】YMS 培养基：酵母提取物 4 g/L、麦芽提取物 10 g/L、可溶性淀粉 4 g/L、燕麦粉 10 g/L、CaCO₃ 2 g/L、琼脂 20 g/L，pH 7.2–7.4；AM2ab 培养基：葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 2 g/L、酵母提取物 2 g/L、大豆粉 5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、KH₂PO₄ 0.5 g/L、NaCl 4 g/L、CaCO₃ 2 g/L、海盐 30 g/L，pH 7.2–7.4；摇瓶发酵培养基：葡萄糖 120 g/L、大豆粉 20 g/L、玉米浆 2.4 g/L、NaCl 6 g/L、NaNO₃ 9.6 g/L、KH₂PO₄ 0.24 g/L、(NH₄)₂SO₄ 6.4 g/L、CaCO₃ 9.6 g/L，pH 7.0；5-L 反应器培养基：可溶性淀粉 120 g/L、大豆粉 23.49 g/L、玉米浆 2.4 g/L、NaCl 6 g/L、NaNO₃ 9.6 g/L、KH₂PO₄ 0.24 g/L、(NH₄)₂SO₄ 4.68 g/L、CaCO₃ 17.67 g/L，pH 5.0；ISP4 培养基：可溶性淀粉 10 g/L、(NH₄)₂SO₄ 2 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 1 g/L、NaCl 1 g/L、CaCO₃ 2 g/L、琼脂 20 g/L、MnCl₂·4H₂O 0.001 g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.001 g/L、MgCl₂·6H₂O 4.07 g/L
2.3 分子生物学与基因工程操作
PCR 扩增使用 2× TransStart® FastPfu PCR SuperMix（−dye）（全式金，中国北京）。质粒提取和 DNA 产物纯化分别使用 TiANprep 和 TIANgel 纯化试剂盒（天根生化，中国北京）。DNA 测序由金唯智（中国苏州）完成。为替换 pIB139 中的抗生素筛选标记，使用 neoR-F/R 引物扩增编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH）的 neoR 片段（含 SacI 酶切位点），经 SacI 酶切后与同样经 SacI 酶切的 pIB139 用 T4 DNA 连接酶（Thermo Fisher Scientific，美国）连接，构建 pIBneoR。过表达菌株和靛蓝素报告质粒的构建中，使用特异性引物从基因组扩增目标基因片段。根据质粒设计，片段与线性化载体直接组装，或经特异性限制性内切酶（NsiI、NdeI、EcoRI、XbaI、NotI）酶切后组装。线性化载体通过对 pIBneoR、pBT 或本研究构建的某些质粒进行不同限制性内切酶酶切获得。过表达质粒中启动子替换采用反向 PCR，使用 PIB-F/R 引物线性化载体，随后用 ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme，中国南京）与各启动子片段进行体外同源重组。连接产物热激转化大肠杆菌 DH5α，涂布含阿普拉霉素或卡那霉素的 LB 琼脂平板。挑取单菌落，用 2× Hieff® Robust PCR Master Mix（翌圣生物，中国上海）进行菌落 PCR 验证，提取质粒测序。重组质粒先转化供体菌大肠杆菌 S17-1，再通过接合转移转入链霉菌。目标接合子用抗性标记筛选，并经菌落 PCR 和测序验证。pKCcas9dRS15910 和 pKCcas9dRS20605 质粒的构建参照前期报道（Jiang et al., 2023），预期的阿普拉霉素抗性缺失突变株 RS15910 和 RS20605 用引物对 knock15910-F/R 和 knock20605-F/R 进行 PCR 和测序验证，准确敲除的菌株命名为 ΔilaRΔRS15910 和 ΔilaRΔRS20605。
【数据】PCR 酶：2× TransStart® FastPfu PCR SuperMix；连接酶：T4 DNA 连接酶（Thermo Fisher Scientific）；同源重组试剂盒：ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme）；限制性内切酶：NsiI、NdeI、EcoRI、XbaI、NotI、SacI；抗生素：阿普拉霉素、卡那霉素；菌落 PCR 预混液：2× Hieff® Robust PCR Master Mix；PCR 验证引物：knock15910-F/R、knock20605-F/R
2.4 衣霉素定量与发酵液干重测定
发酵液用布氏漏斗进行固液分离，菌丝体用过量甲醇充分萃取。萃取液用旋转蒸发仪 N-1300（EYELA，日本）浓缩后重新溶解于 10 mL 甲醇中。分析在 Agilent Infinity 1290 HPLC 系统（Santa Clara, CA, USA）上进行，使用反相 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）。详细步骤参照前期描述（图 S6 和 S7）（Jiang et al., 2023）。由于培养基中存在不溶性物质，无法准确测定生物量，因此将在 50℃ 烘箱中彻底干燥的菌丝体干重作为干细胞重的替代指标（数据见表 S4），用以近似反映底物利用情况和链霉菌生长状态。所有实验设三次重复。
【数据】色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；HPLC 系统：Agilent Infinity 1290；干燥温度：50℃；复溶体积：10 mL 甲醇；重复次数：3 次
2.5 靛蓝素定量
为评估靛蓝素合成能力，接合子在摇瓶中培养 7 天（26℃，175 rpm）。每 24 小时间隔取样 300 µL，12,000 rpm 离心 10 min，取 100 µL 上清液于 96 孔板中测定 OD600（SpectraMax i3，Molecular Devices，中国上海）。所有实验设三次重复。
【数据】培养温度：26℃；转速：175 rpm；培养时间：7 天；取样量：300 µL；离心：12,000 rpm，10 min；OD600 测定体积：100 µL；重复次数：3 次
2.6 转录组学
突变株 S. atratus SCSIO ZH16ΔilaR 在发酵培养基中培养。分别在 24、36、48、72、96 和 120 h 收获菌丝体，12,000 rpm 离心 5 min，用 DEPC 水洗涤两次。沉淀在液氮中速冻后于 −80℃ 保存备用。RNA-seq 实验由金唯智（中国苏州）使用 Illumina HiSeq/Novaseq 仪器（Illumina, San Diego, CA, USA）完成，采用 2 × 150 双端（PE）测序配置。以 S. atratus SCSIO ZH16 基因组（GenBank: CP027306.1）为参考进行基因注释。差异表达分析使用 DESeq2 Bioconductor 包，校正 P 值（Padj）小于 0.05 的基因判定为差异表达基因。在 RStudio 中，使用 gplots 包对差异表达基因的并集进行聚类，基于 log10 转换的相对表达水平。计算 log10（FPKM + 1）值后，数据经中心化处理再进行热图可视化。
【数据】取样时间点：24、36、48、72、96、120 h；离心：12,000 rpm，5 min；测序平台：Illumina HiSeq/Novaseq；测序配置：2 × 150 PE；参考基因组：CP027306.1；差异基因阈值：Padj < 0.05
2.7 总 RNA 提取与 qRT-PCR
分别在发酵 24 和 72 h 收获菌丝体，12,000 rpm 离心 5 min，DEPC 水洗涤两次。菌丝体于 −80℃ 冷冻干燥后在液氮条件下研磨成粉末，使用 SimplyP 试剂盒（Bioer Technology，中国杭州）提取总 RNA。cDNA 合成和 qRT-PCR 详细步骤参照前期描述（Jiang et al., 2023）。以 hrdB 基因作为看家基因。
【数据】取样时间点：24、72 h；离心：12,000 rpm，5 min；RNA 提取试剂盒：SimplyP kit（Bioer Technology）；看家基因：hrdB
2.8 EMSA
EMSA 实验参照前期报道进行（Mao et al., 2024）。启动子探针以 SCSIO ZH16 基因组 DNA 为模板，用引物对 EP5-F/R 经 PCR 扩增获得。
【数据】引物对：EP5-F/R；模板：SCSIO ZH16 基因组 DNA
2.9 5-L 和 500-L 搅拌釜生物反应器放大
高产菌株在配备两层六叶 Rushton 盘式涡轮搅拌桨的 5-L 和 500-L 搅拌釜生物反应器（国强生化工程装备，中国上海）中进行放大培养。三个 500 mL 摇瓶，每瓶含 100 mL 种子培养基……
【数据】反应器：5-L 和 500-L 搅拌釜；搅拌桨：两层六叶 Rushton 盘式涡轮；种子培养：3 × 500 mL 摇瓶，每瓶 100 mL
研究结果
3.1 验证 ila BGC 关键基因以提高衣霉素产量
为提高衣霉素产量，最初的工作聚焦于过表达基因簇内基因。IlaB 属于链霉素生物合成操纵子调控因子（StrR）家族蛋白，是衣霉素生物合成中的正调控因子。ABC 转运蛋白 IlaJ 和 ABC-2 型转运蛋白 IlaK 在衣霉素外排中发挥关键作用。衣霉素生物合成基因簇包含 20 个基因（图 2A），其中 ilaL、ilaQ 和 ilaT 的功能尚未完全阐明。本研究通过生物信息学分析预测了上述三个基因的功能：ilaL 编码细胞色素 P450，ilaQ 编码 F420 依赖性还原酶，ilaT 编码 L-内酰胺酶脱氢酶。因此，过表达这些基因可能提高衣霉素产量（图 2B）。据此，含有上述基因表达 cassette（由 P ermE 驱动）的六个重组质粒分别导入工程菌株 ΔilaR，构建相应的工程菌株（图 S1A）。在所有工程菌株中，过表达 IlaB 的 ΔilaR 菌株衣霉素产量显著提高。由于培养基中存在大豆粉，难以通过 OD 或干重（DW）准确测定细胞生长，因此使用 Biomass Monitor 220（Aber，英国）测定发酵液中活菌质量。该设备利用探针上的两组电极在交变电压下极化并测定活菌电容值，有效排除发酵液中不溶性组分造成的干扰。测得电容与细菌生物量成正比。细胞密度以 1.00 pF/cm 的介电常数表示，介电常数值反映细菌生长趋势（图 2C）。衣霉素产量从 106.2 mg/L 显著提升至 207.1 mg/L（图 2D 和 2E）。上述结果表明调控因子 IlaB 在衣霉素生物合成中发挥关键作用。作为 ila BGC 内唯一的正调控因子，IlaB 的表达对整个生物合成基因簇的转录动态产生复杂影响。因此，通过启动子工程调控 IlaB 的表达可能是提高衣霉素产量的有效策略。鉴于 S. atratus SCSIO ZH16 缺乏标准化的遗传表达元件，首先评估了异源启动子以选择合适的启动子调控 ilaB（表 S5）。P kasO 被认为是链霉菌研究中最强的启动子之一。因此，选取 P kasO 及 6 个不同强度的 P kasO 突变体（SP 23、SP 42、SP 44、P kasO R15、SRL 2-4、SRL 10-7），这些启动子来源于 S. venezuelae ISP5230、S. lividans TK24 和 S. albus J1704 中已鉴定的组成型启动子库。这些启动子分别插入 ilaB 上游并整合至 ΔilaR 的 φC31 位点。不同启动子控制下的发酵结果差异显著。值得注意的是，在多个强启动子驱动 ilaB 转录的突变株中，衣霉素产量明显下降，尤其是 ΔilaR::SP 44-ilaB（图 2F）。同时，ΔilaR::SP 42-ilaB 和 ΔilaR::SRL 10-7-ilaB 的衣霉素产量略高于 ΔilaR::P ermE -ilaB，分别达到 216.7 mg/L 和 211.2 mg/L。然而，与其他链霉菌物种中的进化启动子相比，SP 42 和 SRL 10-7 的转录水平并非最高。对代表性启动子 P ermE 和 P kasO 的转录分析（图 S8）表明，异源启动子在 S. atratus SCSIO ZH16 中的强度可能与其他链霉菌不同，揭示了该宿主独特的转录动态。此外，IlaB 表达增强与衣霉素产量之间没有显著的正相关关系。
【数据】衣霉素产量：ΔilaR 中 IlaB 过表达后从 106.2 mg/L 提升至 207.1 mg/L；ΔilaR::SP 42-ilaB：216.7 mg/L；ΔilaR::SRL 10-7-ilaB：211.2 mg/L；BGC 基因数：20 个；细胞密度表示：1.00 pF/cm
3.2 基于组学分析获得 S. atratus SCSIO ZH16 天然启动子文库用于平衡氮代谢
链霉菌次级代谢产物生物合成的调控机制高度复杂，通常涉及前体积累（初级代谢阶段）与次级代谢产物快速合成（次级代谢阶段）之间的代谢转换期。这一转换期在生理上将初级代谢与次级代谢分隔。在代谢转换期，次级代谢产物前体积累形成代谢池，供次级代谢阶段合成目标次级代谢产物使用。因此，如果在次级代谢阶段前体合成相关基因与次级代谢产物生物合成基因簇（BGC）之间的平衡未得到良好调控，而仅简单地使用强组成型启动子增强目标 BGC，往往适得其反。遗传元件是代谢工程和合成生物学应用的关键组成部分。鉴于不同宿主间生物元件需要兼容性，研究重点转向通过时间序列转录组学挖掘调控氮代谢的元件——这可为 ilaB 提供更天然兼容的转录谱，无需人工诱导物。此外，由于细胞生长约在 120 h 趋于稳定，转录组分析在六个时间点（24、36、48、72、96 和 120 h）进行，以监测衣霉素高产菌株 ΔilaR 中基因表达的时序变化。考虑到 S. atratus SCSIO ZH16 基因组中基因数量庞大，层次聚类被用作筛选启动子的高效方法（图 3A）。转录组分析鉴定出 8,530 个基因，两两比较揭示了不同发酵阶段的转录水平差异。该分析共鉴定出 4,503 个在不同时间点表达显著变化的基因（fold change ≥ 2，P ≤ 0.05）（图 S9）。层次聚类通过计算数据间相似性进行分类，将表达模式相似的基因归为一组。4,503 个基因被分为六个簇，其 FPKM 值经对数转换后中心化处理（每个基因的 log 转换转录水平减去均值）。各簇内基因的整体表达趋势如图 3B 所示。六个簇的转录谱可分为三类：第一类包括簇 1（2,528 个基因）和簇 3（1,309 个基因），在 24 至 120 h 的整个发酵过程中变化不显著；第二类包括簇 4（185 个基因），转录水平从 24 至 72 h 稳步下降；第三类包括簇 2（10 个基因）、簇 5（44 个基因）和簇 6（427 个基因），转录水平从 24 至 72 h 逐渐上升。考虑到次级代谢阶段 IlaB 过表达元件的强度更为关键，第三类基因的调控元件更适合调控衣霉素生物合成……
【数据】转录组基因总数：8,530 个；差异表达基因：4,503 个（fold change ≥ 2，P ≤ 0.05）；簇 1：2,528 个基因；簇 2：10 个基因；簇 3：1,309 个基因；簇 4：185 个基因；簇 5：44 个基因；簇 6：427 个基因；取样时间点：24、36、48、72、96、120 h
3.3 启动子 P 15910 和 P 20605 的挖掘及所调控基因对衣霉素产量的功能分析
（后续结果内容——包括 P 20605 的鉴定、P 20605-400 截短变体的构建、phoP 共过表达策略以及 5-L 和 500-L 反应器放大数据）
【数据】5-L 反应器衣霉素产量：2,546.4 mg/L；500-L 反应器衣霉素产量：1,993.9 mg/L；产量提升倍数：十余倍
讨论与解读
本研究系统挖掘并验证了一系列调控 S. atratus SCSIO ZH16 中 ila BGC 表达的天然调控元件。通过逐步优化衣霉素代谢调控网络，构建了高效产衣霉素菌株 ΔilaR::P 20605-400-ilaB::P ermE* -phoP。最终，该工程菌株在 5-L 生物反应器中达到 2,546.4 mg/L、在 500-L 生物反应器中达到 1,993.9 mg/L 的衣霉素产量，无需任何代谢重构即展现了显著的工业化应用潜力。然而，本研究仍存在一定局限，例如缺乏代谢重构方面的努力。后续研究将聚焦于增强代谢流和解除阻遏，包括优化氮源利用和解除 IlaA 的阻遏——两者均已被证明是提高衣霉素产量的有效途径。
编译者解读
本研究的一个突出策略是"以组学数据驱动元件挖掘"——不依赖异源强启动子，而是从宿主自身的时序转录组中筛选与次级代谢阶段匹配的天然启动子，这种"顺势而为"的思路在放线菌天然产物高产改造中具有推广价值。P 20605-400 的截短优化和 phoP 共过表达的设计体现了"调控基因表达"与"前体供给"双轮驱动的理念。值得关注的是，5-L 与 500-L 反应器放大数据（2,546.4 与 1,993.9 mg/L）验证了该策略的工业可行性。不足之处在于，氮代谢平衡与衣霉素合成之间的分子机制仍偏"黑箱"，后续若结合代谢流分析或更精细的调控网络解析，有望进一步释放该菌株的生产潜力。
参考来源
Gaofan Zheng 等. Balancing nitrogen metabolism to efficiently drive anti-tuberculosis ilamycins biosynthesis in Streptomyces atratus. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133099
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133099