来源：Nutritional and functional insight into novel probiotic lycopene-soy milk by genome edited Bacillus subtilis（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
豆基饮品在全球食品产业中增长迅速，但口感差、风味单一、物质种类有限等问题制约其营养均衡性与多功能性。本研究利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，将番茄红素生物合成操纵子整合至枯草芽孢杆菌WB800N染色体，开发出兼具益生菌与番茄红素双重功能的新型豆乳。该豆乳在理化性质、抗氧化能力、异黄酮生物利用度及感官评价方面均显著优于传统豆乳，为功能性植物基饮品开发提供了新路径。
研究背景
植物基饮品作为牛奶替代品正获得全球消费者的广泛关注。大豆凭借其高产、低成本及富含优质蛋白、脂肪酸、维生素和异黄酮等生物活性成分的优势，成为理想的植物基原料。然而，传统豆乳存在感官品质差、抗营养因子残留及致敏性等问题，限制了其作为均衡营养食品的应用价值。本研究旨在通过代谢工程手段，利用基因组编辑的枯草芽孢杆菌发酵豆乳，同时实现益生菌强化与番茄红素生物合成，系统评估所得豆乳的营养品质、抗氧化功能及感官接受度。
研究方法
2.1 培养基、试剂与菌株
本研究所用化学试剂均为分析纯级，购自阿拉丁工业公司（中国上海）。大肠杆菌DH5α的平板培养及摇瓶发酵使用LB培养基（生工生物，中国上海），并添加100 mg/L氨苄青霉素、50 mg/L卡那霉素或34 mg/L氯霉素用于质粒维持与筛选。枯草芽孢杆菌WB800N同样培养于含5%葡萄糖的LB培养基中，添加5 mg/L卡那霉素或氯霉素进行筛选。
【数据】试剂级别：分析纯；LB培养基；氨苄青霉素：100 mg/L；卡那霉素：50 mg/L（大肠杆菌）/5 mg/L（枯草芽孢杆菌）；氯霉素：34 mg/L（大肠杆菌）/5 mg/L（枯草芽孢杆菌）；葡萄糖：5%
2.2 质粒构建
本研究所用全部构建体列于表S1。基因组DNA和质粒提取使用SteadyPure细菌基因组提取试剂盒（精准生物，中国长沙），操作按制造商说明书进行。PCR扩增使用Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，质粒重组采用一步克隆试剂盒（Vazyme Biotech，中国南京）。pCas（addgene #42876）与pTarget参照Jiang等（2016）的设计，构成双质粒基因编辑系统，其中pCas携带cas9和λ-Red，pTarget携带sgRNA及P43启动子，N20序列由在线服务器设计并选取高评分序列（http://www.rgenome.net/cas-designer/）。
【数据】基因组提取试剂盒：SteadyPure；PCR聚合酶：Phanta Max Super-Fidelity；重组试剂盒：一步克隆试剂盒；编辑系统：pCas+pTarget双质粒
2.3 电转感受态细胞制备
首先将pCas质粒电转入枯草芽孢杆菌WB800N以制备pCas感受态细胞。挑取pCas感受态细胞单克隆，于LB液体培养基中过夜培养，随后以1%接种量转接至含5 mg/L卡那霉素的液体培养基中（200 rpm，37°C）。当OD600达到约0.15时，加入10 mM阿拉伯糖诱导cas9蛋白表达。持续培养至OD600为0.6后，立即将细胞置于冰上10–15 min，并用预冷的电转缓冲液ETM（0.5 M山梨醇、0.5 M甘露醇、10%甘油）洗涤。4°C下5000 rpm离心8 min，重复去除上清三次。最后将感受态细胞重悬于ETM中，分装后于−80°C保存。
【数据】接种量：1%；转速：200 rpm；温度：37°C；OD600诱导点：0.15；阿拉伯糖浓度：10 mM；OD600收集点：0.6；冰浴时间：10–15 min；ETM缓冲液：0.5 M山梨醇+0.5 M甘露醇+10%甘油；离心：5000 rpm、8 min、4°C；保存温度：−80°C
2.4 基因组编辑
本研究所用引物列于表S2。以枯草芽孢杆菌WB800N基因组为模板，用up-F/R和down-F/R引物对扩增上、下游同源臂。EBI片段以pAC-LYC质粒为模板，用EBI-F/R引物对扩增。PCR产物经回收纯化后，用nested-F/R引物对通过重叠PCR连接各片段，获得靶向片段。电转时，将50 μL细胞、100 ng pTarget DNA和200 ng靶向片段于冰上混合，随后加入预冷电转杯（1 mm）中电击一次（2.0 kV）。电击后加入1 mL恢复培养基RM（含0.5 M山梨醇和0.38 M甘露醇的LB培养基），于37°C、200 rpm复苏3 h，然后涂布平板。使用5 mg/L卡那霉素和氯霉素筛选阳性克隆，以up-F和down-R引物扩增后测序验证。
【数据】电转体系：50 μL细胞+100 ng pTarget DNA+200 ng靶向片段；电转杯间距：1 mm；电压：2.0 kV；恢复培养基：LB+0.5 M山梨醇+0.38 M甘露醇；复苏条件：37°C、200 rpm、3 h；筛选抗生素：5 mg/L卡那霉素+氯霉素
2.5 豆乳发酵
选取100 g优质大豆（苏豆20品种，秋季采自江苏省农业科学院试验站），要求籽粒饱满、无霉变、无劣质。大豆经清洗后于室温浸泡20 h，用0.5%（w/v）NaHCO₃溶液热烫6 min，加入干豆重量四倍的去离子水磨浆。双层纱布过滤后，豆乳中添加10%蔗糖，于105°C灭菌15 min。基因组编辑的枯草芽孢杆菌WB800N在含5%（v/v）葡萄糖的LB液体培养基中、37°C、200 rpm培养48 h。将枯草芽孢杆菌种子液以5%接种量接种至无菌豆乳中，于摇床（200 rpm）37°C培养24 h。
【数据】大豆品种：苏豆20；浸泡时间：20 h；NaHCO₃浓度：0.5%（w/v）；热烫时间：6 min；磨浆比例：1:4（豆:水）；蔗糖添加量：10%；灭菌条件：105°C、15 min；种子培养：37°C、200 rpm、48 h、5%葡萄糖；接种量：5%；发酵条件：37°C、200 rpm、24 h
2.6 番茄红素含量测定
HPLC分析样品先于−20°C预冻24 h后冷冻干燥，用氯仿:甲醇（2:1，v/v）提取，N₂吹干，最后以氯仿复溶。HPLC分析使用YMC C30色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），参照Luo等（2023）的方法进行。
【数据】预冻：−20°C、24 h；提取溶剂：氯仿:甲醇=2:1（v/v）；色谱柱：YMC C30（4.6 mm × 250 mm，5 μm）
2.7 pH测定
pH直接用pH计测量，每个样品重复三次分析取平均值。
【数据】重复次数：3次
2.8 总蛋白含量测定
将豆乳样品稀释100倍后，使用BCA蛋白检测试剂盒（生工生物，中国上海）按说明书操作测定总蛋白含量。
【数据】稀释倍数：100倍；试剂盒：BCA蛋白检测试剂盒
2.9 总酚含量测定
取1.0 mL豆乳溶液，加入5 mL蒸馏水和1.0 mL福林酚试剂，充分混匀后加入3.0 mL质量分数为7.5%的Na₂CO₃溶液。混匀后在室温避光反应2 h，以50%乙醇为空白对照，于765 nm波长处测定吸光度。总酚含量以没食子酸当量表示（mg GAE/g）。
【数据】样品量：1.0 mL；福林酚：1.0 mL；Na₂CO₃：3.0 mL、7.5%（w/v）；反应条件：室温避光2 h；检测波长：765 nm；空白对照：50%乙醇；单位：mg GAE/g
2.10 总异黄酮含量测定
总黄酮含量参照Woisky和Salatino（1998）的方法略作修改测定。取3 mL豆乳样品与0.5 mL 5%亚硝酸钠试液混匀，静置6 min。然后加入0.5 mL 10%硝酸铝和4.0 mL 4%氢氧化钠，混匀后静置10 min。以50%乙醇为空白，于509 nm波长处测定黄酮-铝络合物的吸光度，结果以芦丁当量表示（mg Rutin/g）。
【数据】样品量：3 mL；亚硝酸钠：0.5 mL、5%；静置：6 min；硝酸铝：0.5 mL、10%；氢氧化钠：4.0 mL、4%；静置：10 min；检测波长：509 nm；单位：mg Rutin/g
2.11 还原糖测定
取30 mL发酵豆乳于100 mL容量瓶中，加入5 mL乙酸锌溶液和5 mL亚铁氰化钾溶液，振摇后定容。静置30 min后，培养液经滤纸过滤。收集滤液，用3,5-二硝基水杨酸比色法测定（Miller, 1987）。
【数据】样品量：30 mL；乙酸锌：5 mL；亚铁氰化钾：5 mL；静置：30 min；检测方法：DNS比色法
2.12 DPPH自由基清除能力测定
取5 mL豆乳样品，加入等体积蒸馏水混匀，立即离心（10,000 rpm，10 min）。取1 mL离心上清液，加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基乙醇溶液（避光保存），室温避光反应30 min。反应10 min后，样品于4000 rpm离心，取上清于517 nm波长处测定吸光度。
【数据】样品量：5 mL；离心：10,000 rpm、10 min；上清量：1 mL；DPPH浓度：0.2 mmol/L；反应条件：室温避光30 min；二次离心：4000 rpm；检测波长：517 nm
2.13 ABTS清除能力测定
工作液配制：将7 mM ABTS与过硫酸钾等体积混合，室温避光反应12–16 h，使用前以1:55比例稀释（适当比例），调整吸光度值至约0.700 ± 0.002。然后取20 µL豆乳样品与180 µL ABTS工作液混合，室温避光反应60 min。以蒸馏水为空白对照，于734 nm波长处测定吸光度。
【数据】ABTS浓度：7 mM；反应条件：室温避光12–16 h；稀释比例：1:55；吸光度：0.700 ± 0.002；样品量：20 µL；ABTS工作液：180 µL；反应：室温避光60 min；检测波长：734 nm
2.14 羟基自由基清除能力测定
采用比色法测定羟基自由基清除能力。取0.5 mL豆乳样品，加入3.5 mL蒸馏水、0.5 mL 9.1 mM水杨酸-乙醇溶液和0.5 mL 9 mM FeSO₄溶液。最后加入5 mL 88 mM H₂O₂，充分振摇，于510 nm波长处测定吸光度。
【数据】样品量：0.5 mL；水杨酸-乙醇：0.5 mL、9.1 mM；FeSO₄：0.5 mL、9 mM；H₂O₂：5 mL、88 mM；检测波长：510 nm
2.15 体外胃肠消化
体外消化参照Gorusupudi等（2013）的方法并作适当修改。体外消化过程在……（原文此处未完整呈现）。
【数据】方法来源：Gorusupudi等（2013），适当修改
研究结果
3.1 枯草芽孢杆菌基因组编辑生产番茄红素
来自欧文氏菌（Erwinia uredovora）和成团泛菌（Pantoea ananatis）的类胡萝卜素合成基因（crtI编码八氢番茄红素脱饱和酶；crtB编码八氢番茄红素合成酶；crtE编码牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶）负责微生物中的番茄红素合成。本研究将这些基因整合至枯草芽孢杆菌染色体中实现番茄红素积累，为外源表达 cassette 的维持提供了稳定方案，避免了质粒不稳定性问题。由于异源蛋白的表达和稳定性受降解影响，研究选取蛋白酶缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB800N进行整合。按照基因替换的标准流程，构建靶向α-淀粉酶基因（amyE，枯草芽孢杆菌高效编辑位点）的重组质粒，将含有融合簇（P43-crtE-crtB-crtI）的片段的上、下游同源臂插入载体，用于CRISPR-Cas9介导的枯草芽孢杆菌基因工程。经PCR和测序验证后，获得阳性菌株B. subtilis::P43-crtE-crtB-crtI。
据报道，前体物质（异戊烯基焦磷酸IPP和二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP）可被crtI、crtE和crtB催化生成番茄红素。结果显示，B. subtilis::P43-crtE-crtB-crtI发酵后呈现明显的粉红色，且细胞生长模式与野生型枯草芽孢杆菌相似。将所得菌株以豆粉为底物进行液体培养生产番茄红素。与野生型枯草芽孢杆菌发酵的乳白色豆乳相比，B. subtilis::P43-crtE-crtB-crtI使豆乳呈现粉红色。最终通过HPLC分析验证了粉红色豆乳中的番茄红素成分。已有文献报道，crtI、crtE和crtB基因可由Pspac启动子启动，通过枯草芽孢杆菌基因组表达系统生产番茄红素。本研究的結果强有力地证实，在P43启动子控制下，代谢工程枯草芽孢杆菌基因组中的番茄红素生物合成cassette可高效生产番茄红素，为枯草芽孢杆菌染色体中番茄红素合成基因的高效表达提供了新方向。
【数据】整合基因：crtI、crtB、crtE；宿主菌株：B. subtilis WB800N（蛋白酶缺陷型）；编辑位点：amyE；启动子：P43；验证方法：PCR+测序
3.2 番茄红素产量发酵条件分析
为获得高产番茄红素，研究在液体发酵过程中重点分析了接种比例和温度的影响。如图2所示，在不同接种比例和温度条件下测定了基因组工程枯草芽孢杆菌发酵的番茄红素含量。
在不同温度下，均在5%接种比例条件下获得最高番茄红素产量，表明5%为最佳接种比例，这一结果与枯草芽孢杆菌质粒表达系统生产番茄红素的研究略有不同。同时，在所有接种比例下，37°C均获得最高番茄红素产量，表明37°C为最佳温度。然而，该结果与已报道的枯草芽孢杆菌基因组表达系统在30°C下获得高番茄红素产量的研究不一致，这可能与枯草芽孢杆菌的不同基因型有关。令人惊讶的是，摇瓶中番茄红素浓度达到25.73 ± 1.57 mg/g DCW，明显高于枯草芽孢杆菌质粒表达系统的最佳值。同样，其番茄红素积累性能甚至优于由Pspac启动子控制的枯草芽孢杆菌基因组表达系统，这可能与基因表达的相关性有关。基于上述结果，本研究的基因组表达系统产番茄红素模式有望成为豆乳中强化番茄红素的潜在有效途径。
【数据】最佳接种量：5%；最佳温度：37°C；最高产量：25.73 ± 1.57 mg/g DCW；对比体系：质粒表达系统、Pspac启动子基因组表达系统
3.3 益生菌番茄红素豆乳的理化特性表征
通常，益生菌枯草芽孢杆菌会将复杂化合物分解为小分子，从而改变豆乳的理化性质。pH与牛奶中营养素的稳定性及消费者对牙齿健康的偏好相关。因此，研究首先探究了番茄红素豆乳整个发酵过程中的pH变化。随着发酵时间的延长，添加枯草芽孢杆菌和工程菌的豆乳pH值均略有下降。由于微生物代谢生长过程中可产生有机酸，检测到的pH下降可能与枯草芽孢杆菌菌株有关，这与先前的研究一致。值得注意的是，轻微的下降趋势并未导致强酸性pH，表明其具有令人满意的可接受度。
为考察所有豆乳中化合物随时间的变化，研究检测了发酵过程中还原糖含量。如表1所示，所有豆乳发酵过程中还原糖含量均呈明显下降趋势。与豆乳对照相比，枯草芽孢杆菌和工程菌发酵24 h的豆乳产品中还原糖含量更低，这可解释为枯草芽孢杆菌形成的水解酶的作用。值得注意的是，工程菌发酵的豆乳还原糖含量最低，这与多种积极健康效应相关。
此外，研究监测了豆乳发酵过程中的总蛋白含量。随着发酵时间延长，总蛋白含量逐渐下降。有趣的是，枯草芽孢杆菌和工程菌发酵获得的总蛋白含量下降速率更高。特别是，工程菌发酵的豆乳总蛋白含量最低，表明枯草芽孢杆菌和番茄红素可通过蛋白质降解为豆乳带来良好风味。
酚类化合物是大豆中特有的植物化学物质，具有积极的健康活性。因此，研究测定了发酵过程中的总酚含量。在枯草芽孢杆菌和工程菌发酵过程中，总酚含量随发酵时间延长逐渐增加，均显著高于未添加枯草芽孢杆菌的对照组。这一结果与先前研究表明枯草芽孢杆菌可提高豆粕总酚含量一致。令人惊讶的是，工程菌发酵提供番茄红素的豆乳总酚含量最为显著，表明工程菌与番茄红素对提高总酚含量具有正向叠加效应。
作为豆制品中最著名的酚类化合物之一，研究同时监测了异黄酮含量。与总酚相同的上升趋势一致，枯草芽孢杆菌和工程菌发酵的豆乳中异黄酮含量随发酵时间增加而增加，也远高于对照组。值得注意的是，工程菌发酵结束阶段的异黄酮最终含量与枯草芽孢杆菌发酵相似，这证实了枯草芽孢杆菌在异黄酮含量方面的同样理想效果。
【数据】pH：随发酵时间略有下降；还原糖：24 h发酵后含量最低（工程菌组最低）；总蛋白：随发酵时间逐渐下降（工程菌组最低）；总酚：随发酵时间逐渐增加（工程菌组最高）；异黄酮：随发酵时间增加（工程菌与枯草芽孢杆菌最终含量相近）
讨论与解读
本研究成功构建了产番茄红素的基因组编辑枯草芽孢杆菌，并将其应用于豆乳发酵，开发出兼具益生菌与番茄红素双重功能的新型豆乳产品。与传统豆乳相比，该产品在pH、还原糖、蛋白质、总酚和异黄酮等理化指标上表现出更均衡的营养品质。功能评价显示，所得豆乳具有更强的抗氧化能力和更高的异黄酮生物利用度。感官评价中，该豆乳在口味、外观和整体接受度方面均获得高分。这是首次利用基因组编辑枯草芽孢杆菌同时实现豆乳的益生菌强化与番茄红素强化，为食品应用中提升营养价值和功能性提供了叠加效应的新证据。
编译者解读：本研究将CRISPR-Cas9基因组编辑技术与传统发酵食品开发巧妙结合，选择蛋白酶缺陷型菌株WB800N作为宿主，有效解决了异源蛋白表达不稳定的瓶颈问题。P43组成型启动子的使用避免了诱导剂添加的额外成本，更贴近工业化应用场景。值得关注的是，基因组整合策略获得的番茄红素产量（25.73 mg/g DCW）反超质粒表达系统，这提示染色体多位点整合或启动子优化仍有更大潜力。然而，研究尚未涉及番茄红素在豆乳储藏期间的稳定性及体内生物利用度验证，后续可结合动物实验与人体临床试验，为功能性食品的循证应用提供更充分支撑。
参考来源
Luo H. Nutritional and functional insight into novel probiotic lycopene-soy milk by genome edited Bacillus subtilis. Food Chemistry, 2023. DOI: 10.1016/j.foodchem.2023.136973
DOI: 10.1016/j.foodchem.2023.136973