来源：Combinatorial metabolic engineering enables efficient bioconversion of hesperidin into neohesperidin in Bacillus subtilis（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
新橙皮苷是一种具有重要应用价值的黄酮糖苷，目前工业上依赖化学半合成法生产，转化效率受限。本研究以枯草芽孢杆菌168为底盘，通过CRISPR-Cas9系统敲除内源β-葡萄糖苷酶基因、异源表达α-L-鼠李糖苷酶与鼠李糖基转移酶、强化UDP-鼠李糖合成途径、并结合转录组测序筛选天然启动子调控基因表达，最终工程菌株将新橙皮苷产量提升至652.84 mg/L，转化率达65.28%，为黄酮糖苷类化合物的微生物生产提供了可行路径。
研究背景
黄酮类化合物广泛分布于水果、蔬菜及药用植物中，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌和抗病毒等多种药理活性。新橙皮苷（橙皮素7-O-新橙皮糖苷）是柑橘类果实中含量丰富的黄酮糖苷，其橙皮素A环7位羟基连接新橙皮糖（鼠李糖-α-1,2-葡萄糖）。新橙皮苷不仅是具有多种生物活性的功能分子，更是合成新橙皮苷二氢查尔酮的前体——后者是一种甜度为蔗糖1500–1800倍、热量仅为蔗糖约千分之一至两千分之一的低热量甜味剂，在食品饮料行业应用广泛。
传统上新橙皮苷通过柚皮苷与异香兰素的化学半合成制备，但该方法存在转化效率低等问题。微生物合成法有望提供更高效的替代路径，但需要解决糖供体供给、糖基转移效率、底物降解等多重障碍。
研究方法
2.1 菌株与试剂
大肠杆菌turbo菌株作为质粒构建和保存的宿主菌，购自北京博迈德基因技术有限公司。枯草芽孢杆菌168作为所有工程菌株的初始菌株。本研究所用枯草芽孢杆菌菌株列于表S1，质粒列于表S2。橙皮苷（98%纯度）、新橙皮苷（98%纯度）购自成都欧康医药股份有限公司；橙皮素7-O-葡萄糖苷（98%纯度）购自上海源叶生物科技有限公司。色谱级溶剂甲醇、乙酸和乙腈购自上海麦克林生化科技有限公司。ClonExpress II一步克隆系统、Phusion高保真DNA聚合酶和Rapid Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。限制性内切酶DpnI购自美国New England Biolabs公司。PCR扩增用寡核苷酸引物由苏州金唯智生物科技有限公司定制合成，列于表S3。所有异源基因经密码子优化后由北京擎科生物科技有限公司合成，列于表S4。
【数据】菌株：E. coli turbo、B. subtilis 168；试剂纯度：98%；引物合成：GENEWIZ；基因合成：Tsingke Biotech
2.2 培养基与培养条件
大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在Luria–Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37°C、220 rpm条件下培养。所有固体培养基添加2%（w/v）琼脂。需要时添加卡那霉素（25 μg/mL）或氨苄青霉素（50 μg/mL）。发酵培养基组成如下：葡萄糖60 g/L、胰蛋白胨6 g/L、酵母提取物12 g/L、(NH₄)₂SO₄ 6 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 12.5 g/L、KH₂PO₄ 2.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 1 g/L。需要时添加氯霉素（10 μg/mL）。枯草芽孢杆菌在发酵培养基中于37°C、250 rpm条件下培养。发酵过程中在12 h补加300 g/L葡萄糖溶液至终浓度30 g/L，随后在24、36和48 h各补加15 g/L。橙皮苷、橙皮素7-O-葡萄糖苷和新橙皮苷分别溶于二甲基亚砜（DMSO）配制25 g/L储备液。底物以浓缩储备液形式按所需浓度加入培养基进行生物转化实验，DMSO终浓度不超过4%（v/v）以避免影响细胞生长（图S3）。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；发酵培养基：葡萄糖60 g/L、胰蛋白胨6 g/L、酵母提取物12 g/L、(NH₄)₂SO₄ 6 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 12.5 g/L、KH₂PO₄ 2.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 1 g/L；抗生素：卡那霉素25 μg/mL、氨苄青霉素50 μg/mL、氯霉素10 μg/mL；温度：37°C；转速：220 rpm/250 rpm；补糖：12 h加30 g/L，24/36/48 h各加15 g/L；DMSO终浓度≤4%
2.3 质粒与菌株构建
穿梭载体pJOE8999含有温度敏感型复制子和甘露糖诱导型CRISPR-Cas9系统，用于构建基因组编辑质粒。通过CRISPOR在线工具设计引导Cas9至靶位点的20核苷酸间隔序列。以枯草芽孢杆菌168染色体DNA为模板，PCR扩增靶序列两侧各约750 bp的同源片段，通过重叠延伸PCR组装用于整合至枯草芽孢杆菌基因组的表达盒并插入靶位点。使用ClonExpress II一步克隆试剂盒将同源臂和整合片段克隆至pJOE8999，操作按Vazyme说明书进行。质粒采用Spizizen化学转化法转化至枯草芽孢杆菌。对于CRISPR-Cas9系统，转化子涂布于含25 μg/mL卡那霉素和0.2%甘露糖的LB固体培养基，30°C培养14–16 h至菌落出现。阳性转化子经菌落PCR确认。随后，重组枯草芽孢杆菌单菌落接种于5 mL LB培养基，50°C、220 rpm培养12 h，培养物分别涂布于含或不含卡那霉素的LB固体培养基。在无抗生素LB平板上生长且不能在含卡那霉素平板上生长的菌落即为无质粒菌株，用于后续分析。
表达载体pHT43用作调控异源基因和表征启动子强度的初始质粒。所有内源启动子和终止子均以枯草芽孢杆菌168基因组为模板PCR扩增获得。启动子、绿色荧光蛋白（GFP）基因和异源基因按重叠延伸PCR程序组装为表达盒。各候选启动子克隆至GFP基因上游。
【数据】同源臂长度：约750 bp；CRISPR编辑：pJOE8999载体、20 nt间隔序列、0.2%甘露糖诱导；转化方法：Spizizen化学转化法；培养条件：30°C 14–16 h；质粒消除：50°C 12 h
2.4 转录组测序与数据分析
枯草芽孢杆菌菌株在发酵培养基中培养至稳定期。对照组不添加底物，实验组分别在发酵培养基中添加200 mg/L橙皮苷和1000 mg/L新橙皮苷。细胞离心收集，PBS洗涤三次。细胞沉淀保存于−80°C。使用RNAprep pure细胞/细菌试剂盒提取RNA。总RNA质量使用Agilent Bioanalyzer 2100系统评估。去除rRNA后，通过链特异性测序构建文库，并在Illumina NovaSeq平台上测序获得150 bp双端读段。使用Bowtie2将过滤后的干净读段比对至枯草芽孢杆菌168基因组。基因表达水平以FPKM值表示，使用HTSeq定量。
【数据】底物浓度：200 mg/L橙皮苷、1000 mg/L新橙皮苷；测序平台：Illumina NovaSeq；读段长度：150 bp双端；比对软件：Bowtie2；定量：HTSeq FPKM
2.5 启动子表征与荧光显微分析
含GFP的表达载体转化至枯草芽孢杆菌，在含200 mg/L橙皮苷的发酵培养基的96深孔板中培养至稳定期。随后收集细胞并用PBS缓冲液重悬。使用FACSAria Ⅲ进行流式细胞术分析。GFP相对荧光强度在激发波长490 nm和发射波长530 nm下测定，细胞光密度在600 nm波长下测定。初始门控用于排除粉尘颗粒、细胞团块和孢子聚集体。每个样品记录100,000个事件，用于GFP荧光和前向散射分析。流式细胞术结果使用FlowJo™ v10.8软件分析，对活细胞群和单细胞进行门控。
【数据】GFP激发波长：490 nm；发射波长：530 nm；OD测定：600 nm；事件数：100,000/样品；分析软件：FlowJo v10.8
2.6 生物量与分析方法
细胞光密度（OD）使用TU-1810分光光度计在600 nm波长下测定。残余葡萄糖使用S-10生物传感器定量。500 μL培养液与等体积甲醇（100% v/v）混合，涡旋20 min，然后12,000 rpm离心2 min。所得上清液经0.22 μm滤膜过滤。橙皮素7-O-葡萄糖苷、橙皮苷和新橙皮苷采用HITACHI HPLC系统定量，配备Thermo Fisher Scientific aQ-C18色谱柱（250 × 4.6 mm，粒径5 μm）和PDA检测器。流动相为含0.1%甲酸的水溶液和乙腈，流速1 mL/min。梯度程序如下：10–22%乙腈运行2 min，22–40%乙腈运行8 min，40–95%乙腈运行3 min，95%乙腈运行1 min，95–10%乙腈运行1 min，10%乙腈运行2 min。柱温维持在30°C，每个样品进样10 μL。检测波长为283 nm。
底物降解率根据底物浓度按以下公式计算：（1）降解率% = (C₀ − Cₜ)/C₀ × 100，其中C₀为初始底物浓度（mg/L），Cₜ为实验结束时的残余底物浓度（mg/L）。转化率按以下公式计算：（2）转化率% = C产物/C底物 × 100，其中C产物为产物浓度（摩尔），C底物为体系中底物总供给浓度（摩尔）。
【数据】HPLC色谱柱：aQ-C18 250×4.6 mm，5 μm；流速：1 mL/min；柱温：30°C；进样量：10 μL；检测波长：283 nm；离心：12,000 rpm 2 min
2.7 统计分析
实验独立进行三次，结果以平均值±标准差表示。采用Student's t检验评估两组间差异的显著性，P < 0.05被认为具有统计学意义。
【数据】统计方法：Student's t检验；显著性阈值：P < 0.05
研究结果
3.1 新橙皮苷生物转化途径的构建
前期研究已鉴定bglA、bglC和bglH基因编码的β-葡萄糖苷酶可水解枯草芽孢杆菌中的异黄酮糖苷。为检测枯草芽孢杆菌对黄酮糖苷的潜在降解能力，分别向培养基中添加橙皮苷、橙皮素7-O-葡萄糖苷和新橙皮苷。橙皮苷和新橙皮苷在发酵过程中未被明显降解，而橙皮素7-O-葡萄糖苷的浓度显著下降（图S1）。这表明枯草芽孢杆菌具有降解橙皮素7-O-葡萄糖苷的能力。
以枯草芽孢杆菌168（野生型）为底盘菌株，敲除bglA获得菌株BNH01（野生型，ΔbglA）。如图2A所示，当添加300 mg/L橙皮素7-O-葡萄糖苷时，BNH01中橙皮素7-O-葡萄糖苷的降解显著减弱。随后进一步敲除bglC和bglH，获得菌株BNH02（野生型，ΔbglAΔbglC）和BNH03（野生型，ΔbglAΔbglCΔbglH）。三基因敲除菌株BNH03显著降低了橙皮素7-O-葡萄糖苷的降解。BNH03中橙皮素7-O-葡萄糖苷在72 h时浓度为154.56 mg/L，较野生型高33.05%。菌株BNH01、BNH02和BNH03的生物量与野生型相当（图2B）。因此，选择BNH03用于进一步构建生物转化途径。
为测试UDP-Rha生物合成和鼠李糖基化的效果，将异源基因RHDER和RHAT整合至野生型、BNH01、BNH02和BNH03菌株的amyE位点，分别获得菌株BNH04（野生型，amyE::P_laps-RHDER-P_AE-RHAT）、BNH05（BNH01，ΔbglA，amyE::P_laps-RHDER-P_AE-RHAT）、BNH06（BNH02，ΔbglAΔbglC，amyE::P_laps-RHDER-P_AE-RHAT）和BNH07（BNH03，ΔbglAΔbglCΔbglH，amyE::P_laps-RHDER-P_AE-RHAT）。以250 mg/L橙皮素7-O-葡萄糖苷为底物时，RHDER和RHAT基因有效工作，BNH07在48 h时新橙皮苷产量最高，达86.68 mg/L（图2C），对应转化率26.37%。
为通过水解橙皮苷生产橙皮素7-O-葡萄糖苷，使用来自多形拟杆菌VPI-5482的α-L-鼠李糖苷酶（BtRha）测试底物特异性。将BtRha表达载体转化至BNH03获得BNH66，分别向培养基中添加橙皮苷和新橙皮苷。结果表明，BtRha在12 h时通过水解橙皮苷产生212.11 mg/L橙皮素7-O-葡萄糖苷，转化率达95.06%，而新橙皮苷几乎不被水解（图S2）。这说明BtRha对橙皮苷的α-1,6糖苷键具有高度特异性，对新橙皮苷的α-1,2糖苷键无活性，与已有体外研究结果一致。
因此，使用BtRha将橙皮苷水解为橙皮素7-O-葡萄糖苷，再经RHAT以UDP-Rha为糖供体通过鼠李糖基化转化为新橙皮苷。BtRha分别在强组成型启动子P₄₃和人工组成型启动子P_lapS下表达，整合至lytC位点——该位点被认为是营养生长过程中主要的自溶酶编码基因——获得菌株BNH08（BNH07，lytC::P₄₃-BtRha）和BNH09（BNH07，lytC::P_lapS-BtRha）。以200 mg/L橙皮苷为底物时，BNH09中P_lapS驱动的BtRha表达比BNH08表现出更高的生物转化效率（图2D）。BNH09在48 h时产生79.62 mg/L新橙皮苷，转化率39.81%。值得注意的是，橙皮苷在24 h时已完全耗尽，而中间产物橙皮素7-O-葡萄糖苷发生积累，表明BtRha对橙皮苷的水解速率超过了RHAT对橙皮素7-O-葡萄糖苷的鼠李糖基化速率。
为提高鼠李糖基化效率，在BNH09的cwlK位点整合另一个RHAT拷贝构建BNH10。然而，新橙皮苷产量并未显著增加（图2D），提示增加RHAT拷贝数未能提升产量可能是由于糖供体限制，也可能与RHAT酶活性低、定位问题、翻译后修饰或产物抑制有关。
【数据】底物：300 mg/L橙皮素7-O-葡萄糖苷；BNH03残余浓度：154.56 mg/L（72 h）；较野生型提高：33.05%；BNH07产量：86.68 mg/L（48 h）；转化率：26.37%；BtRha水解产物：212.11 mg/L橙皮素7-O-葡萄糖苷（12 h）；转化率：95.06%；BNH09产量：79.62 mg/L（48 h）；转化率：39.81%；橙皮苷耗尽时间：24 h
3.2 UDP-Rha供给的强化
提高细胞内UDP-Rha（由UDP-Glc衍生）的供给对于提升橙皮苷向新橙皮苷的生物转化效率至关重要。参与UDP-Glc生物合成的pgcA和gtaB基因在BNH09中过表达，分别将pgcA整合至cwlK位点、gtaB整合至skfA位点，获得菌株BNH11（BNH09，ΔbglACH，过表达pgcA）和BNH12（BNH09，ΔbglACH，过表达gtaB）。如图3A所示，菌株BNH11和BNH12产生的新橙皮苷均高于BNH09，差异显著。随后，在BNH13（BNH09，ΔbglACH，过表达pgcA和gtaB）中共同过表达pgcA和gtaB，获得最高新橙皮苷产量117.17 mg/L，转化率58.59%。结果表明，增强UDP-Glc合成提高了鼠李糖基化效率并大幅提升了新橙皮苷产量，糖供体供给是鼠李糖基化的潜在限制因素。
细菌还利用UDP-Glc作为前体通过eps操纵子合成胞外多糖。删除eps基因簇可能减少UDP-Glc消耗并增加UDP-Rha的可用性。通过从菌株BNH11、BNH12、BNH13中分别删除16 kb的eps操纵子（epsA–epsO），构建了BNH14（BNH11，过表达pgcA，Δeps）、BNH15（BNH12，过表达gtaB，Δeps）和BNH16（BNH13，过表达pgcA和gtaB，Δeps）。出乎意料的是，所有这些菌株的新橙皮苷产量均显著下降（图3B）。此外，eps操纵子缺失菌株表现出更高的生物量（图3C）。为进一步评估培养状态，检测了发酵过程中的残余葡萄糖浓度（图S4）。eps操纵子缺失菌株（BNH16）与BNH13相比葡萄糖消耗增加，表明碳利用向细胞生长方向增强，这与BNH16中新橙皮苷产量下降一致。同时，eps缺失可能影响细胞包膜完整性、应激反应或群体感应，从而影响异源途径表达或中间产物转运。
为进一步将碳通量导向UDP-Rha，删除了参与葡萄糖-1-磷酸竞争途径的pgi和zwf基因。出乎意料的是，BNH17（BNH13，过表达pgcA和gtaB，Δpgi）和BNH18（BNH13，过表达pgcA和gtaB，Δzwf）均未产生新橙皮苷，且未检测到橙皮苷和橙皮素7-O-葡萄糖苷（图3D）。BNH17和BNH18的生物量显著下降，表明pgi或zwf的缺失严重损害了细胞生长。pgi缺失阻断了葡萄糖-6-磷酸向果糖-6-磷酸的转化，严重损害细胞生长，可能限制了生物转化并最终阻止了新橙皮苷的产生。zwf缺失影响了磷酸戊糖途径和NADPH的生成，可能损害细胞氧化还原平衡和UDP-Rha的生物合成能力，从而阻止了有效的生物转化。
随后，删除了将UDP-Glc转化为UDP-GlcUA用于多糖生物合成的UDP-葡萄糖6-脱氢酶基因tuaD。在菌株BNH19（BNH13，过表达pgcA和gtaB，ΔtuaD）中，tuaD的缺失对新橙皮苷生物合成没有影响。随后将RHDER和RHAT的拷贝数增加至两个，获得BNH20和BNH21。额外拷贝的RHDER增强了鼠李糖基化效率，BNH20在24 h时将新橙皮苷产量提升至117.52 mg/L，较BNH13高31.91%，并在48 h时产生120.05 mg/L新橙皮苷。
【数据】BNH13产量：117.17 mg/L；转化率：58.59%；eps操纵子长度：16 kb（epsA–epsO）；BNH20产量：117.52 mg/L（24 h）；较BNH13提高：31.91%；BNH20产量：120.05 mg/L（48 h）；BNH17/BNH18：未检测到产物
3.3 启动子筛选优化橙皮苷生物转化途径
【数据】原文未详述本节具体数值
3.4 RHDER、pgcA、gtaB在表达载体中的组合表达
【数据】原文未详述本节具体数值
3.5 表达调控增强鼠李糖基化效率
【数据】原文未详述本节具体数值
3.6 补料分批策略优化生物转化过程
【数据】原文未详述本节具体数值
讨论与解读
本研究通过CRISPR-Cas9系统在枯草芽孢杆菌168中建立了将橙皮苷转化为新橙皮苷的生物转化途径。通过过表达内源基因和删除竞争途径基因优化了UDP-Glc合成途径，BNH13产生117.17 mg/L新橙皮苷，生物转化率58.59%。随后基于转录组测序表征了天然启动子的强度，筛选出三个启动子用于改善RHDER的表达。最终，BNH61通过启动子组合调控表现出最高的转化效率，将1000 mg/L橙皮苷转化为652.84 mg/L新橙皮苷，转化率达65.28%。该工作为橙皮苷向新橙皮苷的微生物生物转化建立了新途径，为未来新橙皮苷的生物合成奠定了基础。
编译者解读
该研究展示了典型的组合代谢工程策略——从阻断底物降解、异源表达合成途径、强化糖供体供给到启动子精细调控，层层递进地解决问题。值得注意的是，eps操纵子敲除和pgi/zwf敲除的"意外"负面结果恰恰说明，代谢工程中碳通量的重定向并非总是按预期工作，细胞生长与产物合成之间的平衡需要更精细的调控。启动子组合优化和补料分批策略的引入体现了从"能不能产"到"产得多不多"的工程思维转变。65.28%的转化率在黄酮糖苷微生物转化中已属较高水平，但距离工业化应用仍有距离——底物投料浓度、DMSO用量和发酵周期等参数仍有优化空间。
参考来源
Wang Y. Combinatorial metabolic engineering enables efficient bioconversion of hesperidin into neohesperidin in Bacillus subtilis. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2026.110203
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110203