来源：CRISPR-dCpf1 mediated whole genome crRNA inhibition library for high-throughput screening of growth characteristic genes in Bacillus amyloliquefaciens LB1ba02（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解淀粉芽孢杆菌LB1ba02是公认安全的工业酶生产菌株，但自溶现象和限制修饰系统导致的低转化效率阻碍了其高效基因编辑与高通量筛选。本研究构建了基于CRISPR/dCpf1的双质粒全基因组crRNA抑制文库，结合流式细胞术建立了高通量筛选体系，成功鉴定出7个影响细胞生长与自溶的基因位点。该文库为解淀粉芽孢杆菌功能基因挖掘提供了有力工具。
研究背景
解淀粉芽孢杆菌是公认安全（GRAS）的微生物宿主，也是工业酶制剂生产的重要宿主，广泛应用于农业、工业、食品和医药领域。作为枯草芽孢杆菌的近缘物种，解淀粉芽孢杆菌作为目标蛋白高效表达宿主的潜力尚未被充分开发。其存在的限制修饰系统会导致外源DNA被降解，缺乏快速高效的基因编辑工具进一步阻碍了研究进展。菌株LB1ba02是适合工业分泌中温α-淀粉酶的重要生产菌株。在生长后期和营养缺乏时，芽孢杆菌通常形成休眠孢子以规避恶劣环境。然而实际研究发现，LB1ba02不形成孢子，而是以自溶形式出现，逐渐溶解导致菌体死亡。自溶影响细菌生长，进而影响目标产物产量。Zhang等人（2022）发现解淀粉芽孢杆菌的细胞壁肽聚糖水解酶会影响细胞自溶。为高效挖掘影响LB1ba02生长和自溶的相关基因，亟需建立快速高效的高通量筛选方法。
研究方法
2.1 菌株与质粒
大肠杆菌Mach1-T1用于质粒构建。dam和dcm缺陷型大肠杆菌JM110用于质粒去甲基化。aprE、nprE、wprA和bamHIR基因缺陷的解淀粉芽孢杆菌LB1ba02△4作为全基因组crRNA文库测试的宿主菌。质粒pHTdCpf1-GFP用于表达无信号肽的dCpf1和GFP蛋白。质粒pWSP43-DR用于crRNA表达 cassette 的转录。
【数据】菌株：E. coli Mach1-T1、E. coli JM110、B. amyloliquefaciens LB1ba02△4；质粒：pHTdCpf1-GFP、pWSP43-DR
2.2 试剂与酶
Primer STAR Max DNA Polymerase购自Takara Bio（北京）有限公司。Green Taq™ Mix购自Vazyme Biotech Co., Ltd.。NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit购自New England Biolabs（北京）有限公司。HiPure Plasmid Micro Kit、HiPure DNA Pure Micro Kit和HiPure Gel Pure DNA Mini Kit购自Magen Bio Co., Ltd.（上海，中国）。DNA-Sanger测序、NGS测序和DNA引物合成由Sangon Biotech（上海）有限公司完成。Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR II和SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit购自Accurate Biotechnology（湖南，中国）有限公司。其他材料购自Sigma-Aldrich Biotech（上海，中国）有限公司。
【数据】试剂来源：Takara Bio、Vazyme、NEB、Magen、Sangon Biotech、Accurate Biotechnology、Sigma-Aldrich
2.3 培养基与培养条件
常规质粒构建、转化子鉴定和诱导培养在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl）中进行，温度37°C，转速220 rpm，根据需要添加不同浓度的抗生素（氯霉素（Cm）25 μg/mL、卡那霉素（Kan）50 μg/mL）。当重组菌株含有温度敏感型质粒时，培养温度为30°C。5-FU抗性筛选平板：LB培养基，添加1 mM 5-FU、Kan、Cm和50 μM IPTG。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；温度：37°C/30°C；转速：220 rpm；抗生素：Cm 25 μg/mL、Kan 50 μg/mL；5-FU平板：1 mM 5-FU、50 μM IPTG
2.4 质粒构建
为构建dCpf1诱导表达质粒，以pHT01质粒为模板，使用引物VT-pHT-F/R扩增载体片段，然后使用P43-GFP-F/R和dCpf1-F/R分别扩增P43-GFP（去除信号肽）和Pgrac-dCpf1表达 cassette。三个片段通过Infusion克隆连接，获得质粒pHTdCpf1-GFP（图1）。质粒pWSP43-DR源自pWSdCpf1。设计一对引物pWS-F/R去除Pgrac-dCpf1片段，剩余序列环化获得温度敏感型穿梭（大肠杆菌和芽孢杆菌）质粒pWSP43-DR。pWSP43-DR质粒用于crRNA的转录。本工作使用的所有引物见表S1。
【数据】质粒：pHTdCpf1-GFP（12,233 bp）、pWSP43-DR（3578 bp）；克隆方法：Infusion cloning
2.5 全基因组crRNA文库设计
为降低脱靶概率，Zhu等人（2019）提高了CRISPR-Cpf1系统sgRNA的靶向效率和特异性。根据该方法，设计和选择crRNA时，根据程序提供的评分，为每个基因选择前两个crRNA序列。基于全基因组测序，预测了B. amyloliquefaciens LB1ba02的编码基因，共获得4053个基因。因此，共设计了8106条crRNA序列（补充表1）。8106条crRNA序列以引物池形式由GenScript ProBio在12k芯片上合成。
【数据】基因数：4053；crRNA序列数：8106；合成平台：12k芯片（GenScript ProBio）
2.6 全基因组crRNA文库构建流程
全基因组crRNA引物池浓度为42.4 ng/μL。随后使用Pool-F/R引物扩增文库片段（109 bp），文库片段两端含有20 bp与载体同源的碱基。质粒pWSP43-DR通过引物VT-pWS-F/R线性化。文库和载体片段通过Infusion克隆连接，转化至E. coli Mach1-T1（转化效率>文库数量的10倍，图S1）。收集质粒库，在含Kan的LB培养基中继续培养6–8小时以提取质粒库。随后使用Pool-F/R引物扩增文库片段，送至Sangon Biotech（上海）有限公司进行NGS测序以验证文库覆盖率。
【数据】引物池浓度：42.4 ng/μL；文库片段：109 bp；同源臂：20 bp；培养时间：6–8 h；培养基：LB + Kan
2.7 文库制备与NGS测序
特异性PCR产物送至Sangon Biotech（上海）有限公司进行测序文库制备和测序。简要流程如下：文库制备采用两步PCR。第一轮PCR反应体系：DNA（10 ng/μL）2 μL；扩增子PCR正向引物混合物（10 μM）1 μL；扩增子PCR反向引物混合物（10 μM）1 μL；2× PCR Ready Mix 15 μL（总计25 μL）（Kapa HiFi Ready Mix）。封板后在热循环仪（BIO-RAD, T100TM）中进行PCR，程序如下：98°C变性5分钟1个循环，然后8个循环的98°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸30秒，最后72°C延伸5分钟。PCR产物用1%（w/v）琼脂糖凝胶在TBE缓冲液（Tris、硼酸、EDTA）中进行电泳检测，SYBR Green I染色，紫外灯下观察。之后进行第二轮PCR。PCR反应体系：DNA（10 ng/μL）2 μL；带index的通用P7引物（10 μM）1 μL；带index的P5引物（10 μM）1 μL；2× PCR Ready Mix 15 μL（总计30 μL）（Kapa HiFi Ready Mix）。封板后在热循环仪（BIO-RAD, T100TM）中进行PCR，程序如下：98°C变性3分钟1个循环，然后5个循环的94°C变性30秒、55°C退火20秒、72°C延伸30秒，最后72°C延伸5分钟。随后文库进行定量和混合。在NovaSeq6000/MiSeq测序仪上以PE150/PE30模式（Illumina, San Diego, CA）进行双端测序。
【数据】第一轮PCR：98°C 5min变性，8循环（98°C 30s/60°C 30s/72°C 30s），72°C 5min延伸；第二轮PCR：98°C 3min变性，5循环（94°C 30s/55°C 20s/72°C 30s），72°C 5min延伸；测序平台：NovaSeq6000/MiSeq，PE150/PE30
2.8 数据质控与序列计算
原始读段按三个步骤过滤：1）如果读段含有接头序列，使用cutadapt（v 1.2.1）去除；2）使用PRINSEQ-lite（v 0.20.3）从读段3'到5'去除低质量碱基（Q < 20）；3）使用usearch软件（v11.0.667）以默认参数的de novo模式去除嵌合序列。剩余干净数据用于进一步分析。简要来说，使用python脚本在正向引物和反向引物完全匹配时挑选目标序列，然后计算唯一序列和总序列数。之后，前20条序列用于与参考序列进行多重比对以进行突变分析。R脚本用于绘图。
【数据】质控软件：cutadapt v1.2.1、PRINSEQ-lite v0.20.3、usearch v11.0.667；质量阈值：Q < 20
2.9 全基因组crRNA质粒文库转化
首先，将质粒pHTdCpf1-GFP转化至B. amyloliquefaciens LB1ba02△4，然后将重组菌株LB1ba02△4/pHTdCpf1-GFP制成感受态细胞用于crRNA文库的转化。随后，将全基因组crRNA文库转化至E. coli JM110进行去甲基化。最后，将去甲基化的质粒文库转化至重组菌株LB1ba02△4/pHTdCpf1-GFP。B. amyloliquefaciens的电转化按照Zakataeva等人的方法进行。加入质粒DNA的感受态细胞在Eppendorf Eporator下以12.5 kV/cm场强进行单次电脉冲，持续4.5–6 ms。每次转化效率要求达到[原文此处截断]。
【数据】电转化条件：12.5 kV/cm，4.5–6 ms；感受态细胞：LB1ba02△4/pHTdCpf1-GFP
研究结果
3.1 解淀粉芽孢杆菌LB1ba02中全基因组crRNA文库的构建
为构建全基因组crRNA文库，建立了双质粒CRISPRi系统（图1），即pHTdCpf1-GFP（12,233 bp）和pWSP43-DR（3578 bp）。其中，质粒pHTdCpf1-GFP用于dCpf1和GFP的表达，而质粒pWSP43-DR仅用于crRNA的转录。将8106条crRNA序列插入质粒pWSP43-DR中，通过NGS测序进一步验证文库覆盖率。结果显示，共检测到7647条crRNA，文库覆盖率为7647/8106 = 94.33%（图S1）。成功构建的质粒文库转化至E. coli JM110进行去甲基化，进一步转化至B. amyloliquefaciens LB1ba02△4/pHTdCpf1-GFP。获得的文库菌液保存在−80°C冰箱中，用于后续实验。
【数据】质粒大小：pHTdCpf1-GFP 12,233 bp、pWSP43-DR 3578 bp；检测crRNA数：7647；文库覆盖率：94.33%（7647/8106）；保存温度：−80°C
3.2 全基因组crRNA文库的功能验证
为验证全基因组crRNA文库是否能发挥功能，首先将其用于筛选有毒化学物质5-FU的抗性基因。将文库转化至B. amyloliquefaciens LB1ba02△4/pHTdCpf1-GFP，含有文库的菌液涂布在5-FU抗性平板上，30°C培养36小时。如图S2所示，由于添加了有毒化学物质5-FU，涂布在平板上的对照菌株死亡；然而在文库筛选平板上观察到单菌落生长。然后，以单菌落为模板，通过质粒pWSP43-DR上crRNA两端的通用引物YZ-crRNA-F/R直接扩增片段进行DNA测序，通过crRNA的N23靶向序列定位相关的5-FU抗性基因。测序结果如表S2所示。理论上，尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因（upp）缺陷菌株可以对5-FU的毒性免疫。然而，全基因组crRNA抑制文库并未筛选到upp相关位点，筛选到最多的位点是磷酸核糖焦磷酸激酶（prs）。在42条测序的N23序列中，7条位于prs基因中。嘌呤核苷酸生物合成的第一步由磷酸核糖焦磷酸激酶催化，该酶与ATP反应产生5-磷酸核糖-α-焦磷酸（PRPP）。在此反应中，ATP的焦磷酸直接转移到5-磷酸核糖的C1位。PRPP也是嘧啶核苷酸、组氨酸和色氨酸合成的前体。本实验证明抑制prs基因的表达也可以使菌株对5-FU的毒性免疫。此外，还筛选到其他位点如bioA、yxdM、bI1和yqxK。这些结果表明全基因组crRNA抑制文库可以在B. amyloliquefaciens LB1ba02中发挥功能，可应用于后续实验。
【数据】筛选条件：5-FU抗性平板，30°C，36 h；测序N23序列数：42；prs基因位点：7条；5-FU浓度：1 mM
3.3 利用CRISPRi验证必需基因
进一步尝试使用CRISPRi验证必需基因。对必需基因扩增子进行NGS测序，计算crRNA序列的read counts。结果显示，共检测到7129个crRNA位点，并对read counts的分布进行了统计分析。如图S3所示，read counts在200至799范围内的crRNA数量达到44.99%（3207），设定一个crRNA的read counts中位数约为500。枯草芽孢杆菌作为与解淀粉芽孢杆菌亲缘关系最近的菌株，其必需基因已被鉴定。因此，使用来自枯草芽孢杆菌数据库（http://subtiwiki.uni-goettingen.de/）的253个必需基因进行验证，并计算相应的read counts（表S4）。结果显示，71.9%（182个）的基因read counts低于100，其中43.5%（110个）的基因read counts低于50。14.2%（36个）的基因read counts在100至200之间，10.3%（26个）的基因read counts在200至500之间，另有9个基因read counts超过500。这些结果表明CRISPRi可用于筛选必需基因。当必需基因的表达被抑制时，菌株无法生长和分裂，通过NGS进一步测序，其crRNA的read counts显著低于中位数。然而，CRISPRi在筛选必需基因时也可能存在偏差。首先，crRNA的脱靶和结合效率会影响read counts的大小。其次，细菌中大量存在的多顺反子会干扰必需基因的定位。当crRNA靶向多顺反子时，必需基因可能存在于靶位点的上游或下游。例如，本实验中read counts显著超过500的9个必需基因，其上游或下游相邻基因的read counts低于100，其read counts远高于中位数可能是由于脱靶所致。
【数据】检测crRNA位点数：7129；read counts 200–799比例：44.99%（3207）；必需基因验证：253个（B. subtilis数据库）；read counts <100：71.9%（182个）；read counts <50：43.5%（110个）；read counts 100–200：14.2%（36个）；read counts 200–500：10.3%（26个）；read counts >500：9个
3.4 生长和自溶基因的高通量筛选
为探索B. amyloliquefaciens LB1ba02的生长和自溶基因，建立了基于流式细胞术的高通量筛选系统（图2）。此外，为高效筛选快速生长菌株，对文库菌液进行了传代培养。快速生长的菌株在传代过程中进一步富集。如图3所示，经过15代传代培养后，文库菌液的荧光强度显著高于第1代文库和对照。此外，观察到第15代文库菌液的OD600在后期下降最快（图3d），这可能是由于快速生长加速了细胞自溶速率，进一步导致胞内荧光强度急剧下降（图3c）。将第15代和第1代文库菌液用于快速生长和自溶基因的高通量筛选（图4）。基于流式细胞术高通量分选600个高荧光表达的细胞。首先，使用96孔深孔板预筛出50株荧光强度高于对照的菌株。进一步通过48孔细胞培养板复筛出21株与对照相比生长差异显著的菌株。对这21株菌株进行DNA测序以定位相应的靶基因位点（表S3）。结果显示，21株菌株中共鉴定出7个不同的基因位点。其中，8株菌株位于ATP结合盒转运蛋白基因oppD。oppD抑制菌株生长最快，最高细胞密度OD600是对照菌株的1.15倍。此外，6株菌株位于鞭毛特异性ATP合酶基因flil，flil抑制菌株的生长速率显著高于对照菌株，但弱于oppD位点。另外，观察到压力响应结构域的dabb位点（GE03231）被抑制后，菌株的OD600在后期显著下降，自溶速率增加（图4f）。还比较了抑制菌株的荧光强度变化（图4g），结果显示oppD位点抑制菌株中GFP表达水平最高，其他抑制菌株（flil、tuaA、prmA、sigO和hslU）均高于对照。这些实验结果表明全基因组crRNA抑制文库可以很好地应用于B. amyloliquefaciens LB1ba02。
【数据】传代次数：15代；分选细胞数：600个；预筛菌株数：50株；复筛菌株数：21株；基因位点数：7个；oppD菌株数：8株；flil菌株数：6株；oppD抑制菌株OD600：对照的1.15倍
3.5 Opp系统对解淀粉芽孢杆菌生长的影响
为进一步确认Opp系统对B. amyloliquefaciens LB1ba02生长的影响，测定了多顺反子oppA-oppB-oppC-oppD-oppF上5个基因的转录水平。将oppD位点抑制菌株和对照菌株接种[原文此处截断]。
【数据】检测基因：oppA、oppB、oppC、oppD、oppF（转录水平测定）
讨论与解读
解淀粉芽孢杆菌是公认安全（GRAS）的微生物宿主，广泛应用于农业、工业、食品和医药领域。作为工业α-淀粉酶生产菌株，LB1ba02在生长后期存在自溶缺陷。自溶影响细菌生长，进而影响目标产物产量。为高效挖掘影响LB1ba02生长和自溶的相关基因，需要快速高效的高通量筛选方法。全基因组crRNA文库对转化效率要求极高。LB1ba02中存在的限制修饰系统导致转化效率低，且质粒大小也影响转化效率——较大的质粒通常导致较低的转化效率。经过多次实验，建立了双质粒系统pHTdCpf1-GFP（12,233 bp）和pWSP43-DR（3578 bp），分别用于dCpf1/GFP表达和crRNA转录。
编译者解读
本研究将CRISPR-dCpf1干扰系统与流式细胞术结合，在解淀粉芽孢杆菌中实现了全基因组规模的功能基因筛选，方法学上具有显著创新性。双质粒设计巧妙规避了限制修饰系统带来的转化瓶颈，94.33%的文库覆盖率为筛选可靠性提供了保障。筛选出的Opp系统对菌株生长影响最为显著，为工业菌株改造提供了明确靶点。不过，CRISPRi筛选存在固有脱靶风险，且多顺反子结构可能干扰必需基因定位，后续仍需通过互补实验和精细表征加以验证。该策略可推广至其他功能基因的挖掘，具有广阔应用前景。
参考来源
Qinglong Xin et al. CRISPR-dCpf1 mediated whole genome crRNA inhibition library for high-throughput screening of growth characteristic genes in Bacillus amyloliquefaciens LB1ba02. International Journal of Biological Macromolecules, 2023. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2023.127179
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2023.127179