来源：Rational metabolic engineering of Bacillus subtilis for the efficient production of L-valine（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-缬氨酸是人和脊椎动物无法自行合成的九种必需氨基酸之一，在饲料工业中需求巨大。本研究以饲料益生菌枯草芽孢杆菌ACCC11025为宿主，通过启动子替换、基因敲除等理性代谢工程策略，逐步强化L-缬氨酸生物合成途径、优化转运系统、重构丙酮酸代谢网络并阻断降解途径，最终获得一株兼具益生功能和L-缬氨酸生产能力的双功能菌株Bs-Val10.2。该菌株在5-L发酵罐中L-缬氨酸产量达43.7 ± 1.2 g/L，且未引入任何外源基因和抗性基因，为简化饲料生产工艺提供了新方案。
研究背景
L-缬氨酸可改善畜禽肉质、提高家禽产蛋率和家畜乳脂含量。然而，作为饲料主要原料的豆粕中L-缬氨酸含量偏低，且谷物加工过程中该氨基酸极易降解。因此，L-缬氨酸被称为低蛋白日粮中家禽和家畜的第五限制性氨基酸，被广泛添加于动物饲料中以平衡氨基酸组成、促进动物生长并提高饲料转化效率。据中国生物发酵产业协会数据，2025年全球L-缬氨酸市场规模预计约12.5亿美元，年增长率约6.8%；中国市场预计约45亿元人民币，年增长率约8.0%。目前工业上主要利用谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌及其衍生菌株发酵生产L-缬氨酸，但这些菌株作为饲料添加剂存在安全隐患。枯草芽孢杆菌是被公认的益生菌，本研究选择饲料益生菌枯草芽孢杆菌ACCC11025作为宿主，旨在构建兼具益生功能与L-缬氨酸生产能力的双功能菌株。
研究方法
2.1 菌株、引物与质粒
本研究所用主要菌株和质粒列于表1。枯草芽孢杆菌ACCC11025购自中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC），作为亲本菌株，该菌株在中国广泛用作饲料益生菌。大肠杆菌JM109用作质粒构建的宿主细胞。本研究所用引物列于表S1，由金唯智生物科技有限公司（中国苏州）合成。质粒pMA5用作枯草芽孢杆菌中的组成型表达载体，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。质粒pHTganA-Cpf1（Addgene；质粒#158647）用于CRISPR-Cas12a介导的枯草芽孢杆菌基因组编辑，该质粒由崔文静教授惠赠[20]。重组菌株和质粒的构建过程详见补充材料。为确保重组菌株和质粒的正确性，DNA测序由金唯智生物科技有限公司（中国苏州）完成。
【数据】宿主菌：B. subtilis ACCC11025；克隆宿主：E. coli JM109；表达载体：pMA5；基因编辑工具：pHTganA-Cpf1 (CRISPR-Cas12a)；引物合成与测序：GENEWIZ
2.2 生长培养基与培养条件
大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养用于细胞生长[21]。必要时，添加氨苄青霉素（Amp，100 mg/L）和卡那霉素（Km，50 mg/L）以筛选重组质粒和重组菌株。SPI培养基和SPII培养基用于制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，其中SPI培养基（/L）含有490 mL SPI-A溶液（即2 g/L Na₃C₆H₅O₇·2H₂O，4 g/L (NH₄)₂SO₄，12 g/L KH₂PO₄，28 g/L K₂HPO₄·3H₂O）、490 mL SPI-B溶液（即0.4 g/L MgSO₄·7H₂O）、10 mL 100×CAYE溶液（即20 g/L酪蛋白水解物，100 g/L酵母提取物）和10 mL 500 g/L葡萄糖；SPII培养基（/L）含有980 mL SPI培养基、10 mL 50 mmol/L CaCl₂和10 mL 250 mmol/L MgCl₂。批次培养在500-mL锥形瓶中进行，装液量50 mL，于37°C、100 rpm往复式摇床中培养。L-缬氨酸发酵培养基含有（g/L）：葡萄糖100.0，(NH₄)₂SO₄ 30.0，KH₂PO₄ 1.5，MgSO₄·7H₂O 1.0，FeSO₄·7H₂O 0.04，玉米浆10.0。添加30 g/L CaCO₃调节pH至7.0。
【数据】培养温度：37°C；LB培养基；Amp浓度：100 mg/L；Km浓度：50 mg/L；SPI/SPII培养基配方：详见原文；发酵培养基：葡萄糖100 g/L，(NH₄)₂SO₄ 30 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.04 g/L，玉米浆10 g/L；CaCO₃：30 g/L；pH：7.0；摇瓶装液量：50 mL/500 mL；转速：100 rpm
2.3 5-L生物反应器补料分批发酵
补料分批发酵在5-L生物反应器中进行，工作体积2 L，温度37°C。通过自动添加氨水将pH控制在7.0。通过级联搅拌（100～600 rpm）将溶解氧维持在约20%。初始葡萄糖浓度设定为50 g/L，间歇补加浓缩葡萄糖溶液（700 g/L），使整个发酵过程中葡萄糖浓度维持在约5 g/L。所用发酵培养基与摇瓶培养所述培养基相同（见2.2节）。
【数据】反应器体积：5-L；工作体积：2 L；温度：37°C；pH：7.0（氨水自动调节）；溶解氧：约20%；搅拌转速：100～600 rpm；初始葡萄糖：50 g/L；补料葡萄糖浓度：700 g/L；维持葡萄糖：约5 g/L
2.4 益生特性测定
2.4.1 抗菌活性测定
采用牛津杯法测定抗菌活性，操作步骤参照文献[22]所述。将指示菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌）均匀涂布于固体培养基表面。将牛津杯置于培养基表面，向每个杯中加入适量待测菌株的培养上清液。培养后测量抑菌圈直径，以评价菌株的抗菌能力。
【数据】指示菌：E. coli、S. aureus、Salmonella spp.；方法：牛津杯法；检测指标：抑菌圈直径
2.4.2 孢子形成效率测定
孢子形成效率参照先前方法[23]测定。将待测菌株培养至产孢阶段，随后进行热处理（80°C，10 min）以杀死营养细胞。将热处理后的培养液涂布于固体培养基上计数活菌落数，计算孢子形成率。孢子形成效率以热处理后的活细胞数表示。
【数据】热处理：80°C，10 min；检测指标：热处理后活菌落数
2.4.3 DPPH自由基清除能力测定
DPPH自由基清除能力参照文献[24]所述方法测定。将待测菌株的培养上清液与DPPH溶液混合，在黑暗中反应一定时间。然后测定反应溶液在517 nm处的吸光度，计算自由基清除率，用于评价菌株的抗氧化能力。
【数据】检测波长：517 nm；方法：DPPH法；检测指标：自由基清除率
2.4.4 蛋白酶和纤维素酶活性测定
蛋白酶和纤维素酶活性参照先前方法[25]测定。将待测菌株的培养上清液与相应底物（如酪蛋白或羧甲基纤维素钠）反应。通过测定反应产物（如酪氨酸或还原糖）的量计算酶活单位，以评价菌株的胞外酶分泌能力。
【数据】底物：酪蛋白（蛋白酶）、羧甲基纤维素钠（纤维素酶）；检测产物：酪氨酸、还原糖
2.5 酶活测定
细胞通过10,000 ×g离心10 min收集，然后用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤细胞沉淀三次。随后，使用超声波破碎仪（Sonics VCX750，美国）在冰浴中破碎细胞以获得粗酶液。4°C下10,000 ×g离心30 min后，取无细胞上清液（即粗酶液）用于酶活分析。酶活和蛋白质浓度分析均设三次重复。
丙酮酸激酶（PK）活性参照Pan等[26]的方案测定。测定在室温下进行，1 mL反应混合物含有31 mM K₂HPO₄（pH 7.5）、6.7 mM MgSO₄、2 mM ADP、0.24 mM NADH、22个单位乳酸脱氢酶（LDH）、10 mM磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和100 µL粗细胞提取物。通过加入PEP启动反应，通过追踪340 nm处吸光度的下降来监测NADH氧化。一个PK活性单位定义为每分钟氧化1 µmol NADH所需的酶量。
苹果酸酶（MleA）活性参照Netzer等[27]的方法测定。测定在30°C下进行，1 mL反应混合物含有120 mM HEPPS（pH 7.8）、5 mM MgCl₂、1 mM NADP⁺、40 mM D,L-苹果酸二钠盐和适量粗提取物（通常20–50 µL）。以苹果酸启动反应，通过追踪340 nm处吸光度的增加来监测NADPH的生成。一个MleA活性单位定义为每分钟催化生成1 µmol NADPH所需的酶量。
【数据】细胞收集：10,000 ×g离心10 min；洗涤：磷酸盐缓冲液(pH 7.0)×3次；破碎：超声(Sonics VCX750)，冰浴；粗酶液制备：4°C、10,000 ×g离心30 min；PK活性测定：31 mM K₂HPO₄(pH 7.5)、6.7 mM MgSO₄、2 mM ADP、0.24 mM NADH、22 U LDH、10 mM PEP、100 µL粗酶液，室温，340 nm；MleA活性测定：120 mM HEPPS(pH 7.8)、5 mM MgCl₂、1 mM NADP⁺、40 mM苹果酸、20–50 µL粗酶液，30°C，340 nm
2.6 RT-qPCR分析
为评估目标基因的转录水平，在摇瓶培养期间于指定时间点收集发酵液样品。离心后，细胞沉淀立即在液氮中速冻以保持RNA完整性。使用细菌RNA提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）提取总RNA。通过微量分光光度法评估RNA纯度和浓度，通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。使用HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行基因组DNA去除和cDNA合成。以cDNA为模板，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行实时荧光定量PCR（qPCR）。热循环程序包括95°C初始变性30 s，随后40个循环（95°C 10 s，60°C 30 s），最后进行熔解曲线分析以验证扩增特异性。qPCR所用引物列于表S1。以16S rRNA基因作为内参进行归一化，目标基因（pdhA、pyk和mleA）的转录水平采用2^−ΔΔCt方法计算[28]。
【数据】RNA提取试剂盒：Vazyme；反转录试剂盒：HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)；qPCR试剂：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix；qPCR程序：95°C 30 s；40×(95°C 10 s, 60°C 30 s)；内参基因：16S rRNA；计算方法：2^−ΔΔCt
2.7 分析方法
每4小时从摇瓶中取出适量发酵液，其中一半用于分析——原文此处内容截断，后续分析方法细节原文未完整呈现。
【数据】取样间隔：4 h；原文未完整呈现其余分析方法细节
研究结果
3.1 过表达ilvBHCD和ilvEK（即ybgE和ywaA）以增加L-缬氨酸末端生物合成途径的碳通量
基于枯草芽孢杆菌168基因组（NC_000964）的描述[31]，参与支链氨基酸（BCAAs）生物合成的七个基因（即ilvBHCleuABCD；ilv-leu操纵子）构成一个基因簇并共享同一启动子[32,33]。参与BCAAs生物合成的其他基因（即ilvA、ilvD、ybgE和ywaA）为独立表达[32]。然而，上述基因（包括ilv-leu操纵子和单顺反子转录单元）的表达受到全局调控因子CodY的负调控，因为CodY可以结合到这些基因的启动子上[34,35]。
为增强L-缬氨酸末端合成途径的碳通量，对参与L-缬氨酸生物合成的关键基因（即ilvBHCD、ybgE和ywaA）进行了过表达。具体操作是，将菌株B. subtilis ACCC11025中ilvB、ilvD、ybgE和ywaA的上游区域（不含核糖体结合位点）替换为强组成型启动子P p43[36]（图2a）。
从图2b可以看出，所得菌株Bs-Val1.1（即8.7 ± 0.9 g/L）与原始菌株ACCC11025（即0.2 ± 0.2 g/L）相比，L-缬氨酸滴度显著提高，其次是Bs-Val1.2（即3.2 ± 0.3 g/L）。菌株Bs-Val1.3和Bs-Val1.4没有显著积累L-缬氨酸（图2b），但对细胞生长无不利影响（图2c）。值得注意的是，在菌株Bs-Val1.1中替换ybgE和ywaA的启动子可明显提高L-缬氨酸产量（图2b）。此外，在菌株Bs-Val1.1中同时替换ybgE和ywaA的启动子后，L-缬氨酸滴度进一步提高，所得菌株Bs-Val3.1产生11.1 ± 0.4 g/L的L-缬氨酸（图2b）。这些结果表明，乙酰羟酸合酶（AHAS，由枯草芽孢杆菌中的ilvBH编码）催化BCAAs生物合成途径的第一步，在L-缬氨酸生物合成中发挥重要作用[1,29,37]。此外，先前报道也指出，氨基转移酶（如枯草芽孢杆菌中的YbgE和YwaA）将2-酮异戊酸转化为L-缬氨酸的过程限制了枯草芽孢杆菌[17]、大肠杆菌[1,29]和谷氨酸棒杆菌[38]中L-缬氨酸的生产速率。
为进一步增强L-缬氨酸生物合成途径的碳通量，在菌株Bs-Val3.1中将ilvD的启动子替换为强组成型启动子P p43，构建菌株Bs-Val4.1。奇怪的是，菌株Bs-Val4.1的L-缬氨酸产量没有明显提高（图2b）。先前报道中也发现了类似结果[17]。这可能是因为AHAS的活性受到L-缬氨酸的抑制[37]。为解决这一问题，将L-缬氨酸不敏感的AHAS（即ilvB L22E/A129V/A207S/A226G/V371P/S408T/K555E ilvH G151D/Q60L/N29H）[39]替换菌株Bs-Val4.1中的野生型AHAS，构建菌株Bs-Val4.2。如预期所料，菌株Bs-Val4.2的L-缬氨酸产量提高至12.7 ± 0.4 g/L，比菌株Bs-Val4.1（即11.3 ± 1.1 g/L）高12.4%（图2b）。这些结果证实，AHAS的活性受到胞内L-缬氨酸水平的负调控[40]，从而限制了L-缬氨酸的生产。值得注意的是，菌株Bs-Val4.1还积累了一定量的L-亮氨酸（2.8 ± 0.1 g/L）和L-异亮氨酸（2.1 ± 0.2 g/L），而在菌株Bs-Val4.2中引入L-缬氨酸不敏感型AHAS变体后，L-亮氨酸（2.3 ± 0.2 g/L）和L-异亮氨酸（1.0 ± 0.3 g/L）的积累量有所减少（图S1）。这些发现表明，改造后的AHAS成功缓解了碳通量向亮氨酸和异亮氨酸分支的分散，这一结果与先前研究[39]的观察一致。
【数据】Bs-Val1.1产量：8.7 ± 0.9 g/L；ACCC11025产量：0.2 ± 0.2 g/L；Bs-Val1.2产量：3.2 ± 0.3 g/L；Bs-Val3.1产量：11.1 ± 0.4 g/L；Bs-Val4.1产量：11.3 ± 1.1 g/L；Bs-Val4.2产量：12.7 ± 0.4 g/L（提高12.4%）；Bs-Val4.1副产物：L-亮氨酸2.8 ± 0.1 g/L、L-异亮氨酸2.1 ± 0.2 g/L；Bs-Val4.2副产物：L-亮氨酸2.3 ± 0.2 g/L、L-异亮氨酸1.0 ± 0.3 g/L；启动子：P p43
3.2 改造L-缬氨酸输出系统以促进L-缬氨酸分泌
如上所述，菌株Bs-Val4.2在发酵液中积累了12.7 ± 0.4 g/L的L-缬氨酸，但胞内L-缬氨酸达到1.1 ± 0.4 g/L（图3a）。先前报道指出，在大肠杆菌[29,41]和谷氨酸棒杆菌[38]中过表达BCAA输出蛋白（如YgaZH和BrnFE）可降低胞内L-缬氨酸水平。为降低胞内L-缬氨酸水平并缓解L-缬氨酸的反馈抑制，在菌株Bs-Val4.2中过表达了枯草芽孢杆菌中与L-缬氨酸相关的关键通透酶（由bcaP编码）。具体操作是将菌株Bs-Val4.2中bcaP起始密码子上游214 bp区域替换为强组成型启动子P p43，构建菌株Bs-Val5.1。然而，与菌株Bs-Val4.2相比，过表达bcaP并未使胞外L-缬氨酸滴度增加（图3a）。相反，过表达bcaP对细胞生长没有帮助（图3b）。先前报道中也发现了类似结果[17,42]。
亮氨酸响应蛋白（Lrp）是一种全局调控因子，影响多种基因的转录，包括大肠杆菌[43]和谷氨酸棒杆菌[44]中的BCAAs转运基因。例如，谷氨酸棒杆菌的Lrp激活编码BCAAs输出系统的brnFE操纵子的表达，从而促进BCAAs的分泌[44]。在枯草芽孢杆菌中，存在一种Lrp样蛋白（即AzlB），由azlB编码，负调控BCAAs转运蛋白（由azlBCDEF编码）的表达[45]。先前报道表明，失活AzlB可提高枯草芽孢杆菌中L-亮氨酸的产量[46]。因此，在菌株Bs-Val4.2和菌株Bs-Val5.1中分别敲除编码AzlB的azlB基因，构建菌株Bs-Val5.2和Bs-Val6.1。图3a中的摇瓶发酵结果表明，在菌株Bs-Val4.2中失活AzlB（即所得菌株Bs-Val5.2）显著提高了L-缬氨酸产量，滴度达到16.3 ± 1.2 g/L。然而，需要注意的是，在菌株Bs-Val5.1中失活AzlB（即所得菌株Bs-Val6.1）仍未明显提高L-缬氨酸产量（图3a），因为与菌株Bs-Val5.1相比，菌株Bs-Val6.1培养物中的生物量（即OD600）也有所下降（图3b）。这些结果表明，除L-亮氨酸高产菌株外[46]，AzlB也可用于改造构建BCAAs高产菌株。
【数据】Bs-Val4.2胞外产量：12.7 ± 0.4 g/L；胞内L-缬氨酸：1.1 ± 0.4 g/L；bcaP启动子替换区域：起始密码子上游214 bp；启动子：P p43；Bs-Val5.2产量：16.3 ± 1.2 g/L；Bs-Val6.1产量：未见明显提高
3.3 重构丙酮酸代谢途径以丰富L-缬氨酸生物合成的前体供应
丙酮酸是中心碳代谢中的关键代谢物，被认为是枯草芽孢杆菌高效生产L-缬氨酸的主要限制因素[1,17]。然而，丙酮酸也用作生产L-丙氨酸[47]、乳酸[48]和乙酸[49]的前体，并进入三羧酸循环（TCA）[50]（图1）。为丰富胞内丙酮酸水平，首先通过敲除和/或敲低关键酶来阻断丙酮酸的其他代谢分流。具体操作是，在菌株Bs-Val5.2中敲除丙酮酸氧化酶编码基因poxB和L-乳酸脱氢酶编码基因ictE，分别阻断乙酸和乳酸的积累。所得菌株Bs-Val7.1产生17.3 ± 1.5 g/L的L-缬氨酸，比菌株Bs-Val5.2（16.2 ± 1.3 g/L）高6.8%（图4a）。值得注意的是，菌株Bs-Val7.1的细胞生长（OD600）与菌株Bs-Val5.2相似，但菌株Bs-Val7.1积累的乙酸和乳酸少于菌株Bs-Val5.2（图4b、c）。这些结果与先前报道[51]一致，即降低poxB和ictE的表达水平对L-缬氨酸生产有积极影响。在此基础上，在菌株Bs-Val7.1中敲除丙酮酸羧化酶编码基因pycA以减少TCA中的碳通量，得到菌株Bs-Val7.2。菌株Bs-Val7.2的L-缬氨酸滴度没有明显——原文此处内容截断，后续结果数据未完整呈现。
【数据】Bs-Val7.1产量：17.3 ± 1.5 g/L（比Bs-Val5.2提高6.8%）；Bs-Val5.2产量：16.2 ± 1.3 g/L；敲除基因：poxB、ictE、pycA
3.4 强化丙酮酸生物合成途径以增加丙酮酸库并改变L-缬氨酸产量
原文此节内容在提供的节选中未完整呈现，仅保留了图4的图注信息：图4展示了敲除pyk和mleA基因对L-缬氨酸产量和细胞生长的影响（a）、不同重组菌株中pyk和mleA的转录水平（b）以及酶活性（c）等数据。
【数据】原文此节内容未完整呈现
3.5 切断L-缬氨酸降解途径以增强L-缬氨酸积累
原文此节内容在提供的节选中未完整呈现，仅保留了图5的图注信息：图5展示了不同重组菌株中的L-缬氨酸滴度（a）、不同重组菌株的细胞生长（b）以及菌株Bs-Val10.2在5-L生物反应器中的补料分批发酵（c）。每个数据点均进行了两次或三次重复测量，误差线表示标准差。
【数据】原文此节内容未完整呈现
3.6 亲本菌株ACCC11025（Bs-Val0）与工程菌株Bs-Val10.2的益生功能评价
原文此节内容在提供的节选中未完整呈现，仅保留了图6的图注信息：图6展示了菌株Bs-Val0和Bs-Val10.2的孢子形成效率（a）、蛋白酶和纤维素酶活性（b、c）以及培养物的抗菌活性（d）等益生功能评价数据。
【数据】原文此节内容未完整呈现
讨论与解读
本研究首次构建了一株同时实现高水平L-缬氨酸生产并基本保留益生功能的重组枯草芽孢杆菌菌株。尽管碳通量大量转向L-缬氨酸生物合成导致胞外酶分泌与亲本菌株ACCC11025相比有所降低，但菌株Bs-Val10.2仍表现出显著的这些有益活性，支持其作为双功能饲料添加剂的潜力。菌株Bs-Val10.2在补料分批发酵中产生43.7 ± 1.2 g/L的L-缬氨酸，而亲本菌株ACCC11025几乎不积累L-缬氨酸。此外，菌株Bs-Val10.2还表现出与亲本菌株ACCC11025相当的益生功能。在整个菌株Bs-Val10.2的构建过程中，未引入任何外源基因和抗性基因。因此，菌株Bs-Val10.2作为饲料益生菌使用不构成安全风险。与传统动物饲料加工技术相比，这种新型饲料生产工艺只需添加菌株Bs-Val10.2，而无需同时添加L-缬氨酸和饲料益生菌，因为菌株Bs-Val10.2同时具有益生功能和L-缬氨酸生产能力。因此，从工业饲料应用的经济角度出发，这种双功能菌株Bs-Val10.2相对于传统策略（即单独添加纯化L-缬氨酸和益生菌）具有显著的成本优势。
编译者解读：本研究展示了典型的"一菌多用"合成生物学策略——将益生菌宿主与氨基酸生产相结合，直接面向饲料工业的降本增效需求。技术路线上采用CRISPR-Cas12a进行无标记基因组编辑，全程不引入外源基因和抗性标记，从法规和公众接受度角度具有明显优势。值得注意的是，研究中对AHAS进行L-缬氨酸不敏感突变以解除反馈抑制，以及通过失活AzlB调控因子来激活内源转运系统，体现了对代谢调控网络的精细理解。局限在于，43.7 g/L的产量与工业用谷氨酸棒杆菌相比仍有差距，且碳通量重分配对益生功能（如胞外酶分泌）的削弱程度需要更系统的评估。后续若能在发酵工艺优化和产酶能力恢复方面进一步改进，该双功能菌株的产业化前景值得期待。
参考来源
Wang, K. (2026). Rational metabolic engineering of Bacillus subtilis for the efficient production of L-valine. Biochemical Engineering Journal. DOI: 10.1016/j.bej.2026.110368
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110368