来源：LAMP-assisted CRISPR-Cas12a platform for detection of Bacillus anthracis spores in environmental samples（Analytica Chimica Acta）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
炭疽芽孢杆菌孢子可在土壤中存活数十年，构成持久的感染源。本研究开发了一套LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测平台，针对质粒编码的lef基因和染色体SNP位点CR5双靶标，在约70分钟内完成环境样本中炭疽芽孢杆菌孢子的灵敏检测。该方法检测限达10孢子/ml（lef靶标），在100份田间样本验证中取得91.7%灵敏度和100%特异性，为资源有限地区的炭疽监测提供了实用工具。
研究背景
炭疽病由炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）引起，是一种全球性的兽医公共卫生威胁。该菌为革兰氏阳性产孢菌，其休眠孢子可在恶劣环境条件下于土壤中存活数十年，构成长期感染库。据估计，全球每年有20,000至100,000例人间炭疽病例。传统检测方法依赖培养、镜检、生化鉴定及PCR等技术，但这些方法耗时较长，需要BSL-3级生物安全设施，且对操作人员和基础设施要求高。环境样本（尤其是土壤）中高达2×10⁹细菌/克的本底微生物负荷进一步限制了传统方法的适用性。因此，亟需开发快速、灵敏且适用于现场的检测工具。
研究方法
2.1 菌株与孢子制备
炭疽芽孢杆菌Sterne株（34F2）孢子从活孢子疫苗（IAHVB, Hebbal）中复苏。近缘芽孢杆菌属菌种获自印度Hisar的NCVTC。通过培养、染色和PCR确认菌株身份[23]，并使用VITEK-2系统（bioMérieux，法国）进行生化鉴定。炭疽芽孢杆菌及相关芽孢杆菌属孢子的制备和灭活按照此前描述的方法[24]在受控实验室生物安全条件下进行。灭活孢子分别储存在室温、4°C、0°C和−20°C，每周通过PCR评估其稳定性和DNA可扩增性。所有程序均经机构生物安全委员会（IBSC）批准，并在BSL-3生物安全柜（IMSET，印度孟买）中执行。
【数据】菌株：Bacillus anthracis Sterne 34F2；储存温度：室温、4°C、0°C、−20°C；评估频率：每周；生物安全等级：BSL-3
2.2 化学试剂
LAMP试剂（包括WarmStart® LAMP 2x Master Mix）购自New England Biolabs（英国）。甜菜碱、dNTPs、Bst聚合酶、缓冲液组分和MgSO₄购自Sigma-Aldrich。LAMP引物（F3、FIP、BIP、B3、LF、LB）由Eurofins（印度）合成。CRISPR-Cas12a试剂（EnGen® Lba Cas12a、NEBuffer r2.1）购自NEB，crRNA由IDT（美国）合成。侧向流动切割报告分子（/5’/6-FAM/TTATTATT/3′Bio）购自Eurofins Scientific India Pvt. Ltd.，TwistDx-Milenia HybriDetect 1试纸条购自TwistDx Ltd.，英国。
【数据】LAMP预混液：WarmStart® LAMP 2x Master Mix（NEB）；Cas12a：EnGen® Lba Cas12a；报告分子：/5’/6-FAM/TTATTATT/3′Bio；试纸条：HybriDetect 1
2.3 LAMP引物设计
炭疽芽孢杆菌Sterne 34F2株质粒编码的lef基因（NC_007322.2）和染色体CR5位点（CP019726.1）的靶序列从NCBI获取。LAMP引物（F3、B3、FIP、BIP、LF、LB）使用Primer Explorer V5（https://primerexplorer.jp/e/）按照标准指南设计[25]。在CR5 FIP连接区引入PAM兼容修饰（TTTC）以实现下游Cas12a激活，而lef天然含有合适的PAM序列（TTTG）。引物特异性通过NCBI Primer-BLAST验证。LAMP引物（lef和CR5位点）的详细信息见表1。
【数据】靶基因：lef（NC_007322.2）、CR5（CP019726.1）；PAM序列：lef为TTTG，CR5引入TTTC；设计工具：Primer Explorer V5
2.4 crRNA设计
针对lef和CR5靶基因的crRNA设计遵循IDT CRISPR指南及前期报道[22,26]。此外，使用CRISPOR（http://crispor.tefor.net）和RNAfold网络服务器（http://rna.tbi.univie.ac）两个软件工具辅助crRNA设计。在LAMP扩增子内鉴定TTTV PAM基序相邻的靶位点（20-24 bp），通过Primer-BLAST筛选特异性，并使用RNAfold评估二级结构。优化后的crRNA经合成用于下游检测（表1）。
【数据】crRNA靶位点长度：20-24 bp；PAM基序：TTTV；设计工具：CRISPOR、RNAfold
2.5 LAMP assay优化
LAMP反应在干式恒温器中针对引物浓度（0.10-2 μM）、温度（58-68°C）和孵育时间（20、45、60和90分钟）进行优化[19,27]。炭疽芽孢杆菌孢子DNA作为阳性对照，非靶标芽孢杆菌属DNA作为阴性对照。根据扩增效率和特异性选择优化条件，并用于后续CRISPR-Cas12a检测。
【数据】引物浓度范围：0.10-2 μM；温度范围：58-68°C；孵育时间：20、45、60、90 min
2.6 CRISPR-Cas12a检测优化
CRISPR-Cas12a检测按照Broughton等人2020年的方法进行优化[28]。LAMP assay中扩增的基因靶标作为阳性对照。系统评估了Cas12a（10、20、40、60 nM）、crRNA（20、40、60、80 nM）、报告分子（20-120 nM）和LAMP产物输入量（1-6 μl）。Cas12a-crRNA复合物（16至25 μL）在加入LAMP扩增子前预先孵育（1、3、5、7和10分钟）。在充分探索检测混合物与时间间隔的各种组合后，确定了产生一致结果的最优检测混合物和时间。
【数据】Cas12a浓度梯度：10、20、40、60 nM；crRNA浓度梯度：20、40、60、80 nM；报告分子：20-120 nM；LAMP产物：1-6 μl；预孵育时间：1、3、5、7、10 min
2.7 侧向流动试纸条读取
LAMP辅助CRISPR/Cas12a检测完成后，使用HybriDetect 1试纸条（TwistDx）进行结果可视化。首先在样品垫上测试不同上样体积（10、20、30和40 μl）。加样后，试纸条在室温下静置5分钟。随后，加载的试纸条再与Hybridetect缓冲液额外孵育5分钟，如前所述[29]。
【数据】上样体积：10、20、30、40 μl；室温静置：5 min；缓冲液孵育：5 min
2.8 CRISPR-Cas12a检测的灵敏度与特异性测定
使用系列稀释的UV灭活炭疽芽孢杆菌孢子（10⁶至10孢子/ml）测定CRISPR-Cas12a检测的灵敏度。针对近缘芽孢杆菌属（蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌）及其他革兰氏阳性病原体（金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌）评估特异性。为模拟自然环境条件，还测试了不同比例的炭疽芽孢杆菌与相关芽孢杆菌属混合孢子（10¹⁰孢子/ml，比例100:0、75:25、50:50、25:75、0:100）[23]。
【数据】孢子梯度：10⁶至10孢子/ml；测试菌种：5种近缘芽孢杆菌+2种革兰氏阳性病原体；混合比例：100:0、75:25、50:50、25:75、0:100；混合孢子浓度：10¹⁰孢子/ml
2.9 土壤/肉粉中加标芽孢杆菌孢子的回收
使用Ground Anthrax Bacillus Refined Isolation（GABRI）方法[30]从无菌土壤和肉粉基质[24]中回收孢子，以蔗糖-Tween 20为载体。具体操作：向加标土壤（10¹⁰孢子）中加入22.5 ml含水载体培养基（含0.5% Tween-20的蔗糖溶液，此前已确定[23,24]），涡旋剧烈混匀30分钟。涡旋和离心后，上清液分为两部分用于培养计数和DNA提取。所得上清液总体积的一半用于PLET琼脂上的孢子计数，另一半用于DNA提取，应用于优化后的LAMP辅助CRISPR Cas12a检测和WOAH推荐实时荧光定量PCR（qPCR）技术。孢子回收率 = 回收孢子数 / 加标孢子数 × 100
【数据】载体培养基：22.5 ml蔗糖+0.5% Tween-20；加标量：10¹⁰孢子；涡旋时间：30 min；计数培养基：PLET琼脂
2.10 优化后LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测的灵敏度与特异性
在加标土壤和肉粉（7.50 g）中，使用蔗糖-Tween 20作为载体培养基的GABRI技术，在宽孢子范围（10¹⁰至10⁰孢子）内评估优化后LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测的灵敏度和特异性。进行混合菌种（炭疽芽孢杆菌与近缘芽孢杆菌属，即蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌）加标实验以评估交叉反应性[23,24]。进一步地，为模拟环境条件并确保LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测的特异性，制备了含不同比例（100:0、75:25、50:50、25:75和0:100）炭疽芽孢杆菌和相关芽孢杆菌属的混合孢子悬液（10¹⁰/ml），加标到无菌土壤和肉粉样本中。回收孢子通过系列稀释在PLET琼脂上计数，DNA使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue试剂盒从UV灭活孢子中提取，并使用优化后的LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测（TwistDx-Milenia HybriDetect 1）进行评估。
【数据】样本量：7.50 g；孢子范围：10¹⁰至10⁰孢子；混合比例：100:0、75:25、50:50、25:75、0:100；混合孢子浓度：10¹⁰/ml；DNA提取：Qiagen DNeasy试剂盒
2.11 优化后LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测的田间样本验证
采用无放回简单随机抽样方法，从印度炭疽流行和暴发风险地区共采集100份田间样本（土壤和饲料补充剂各50份）（表2）。样本（50-100 g）在现场使用便携式UV灭菌器灭活，按照适当的生物安全规程安全运输，并使用GABRI方法处理。DNA提取物同时使用优化后的CRISPR-Cas12a检测和WOAH推荐的基于lef基因的qPCR[23]进行分析。CRISPR-Cas12a检测的诊断灵敏度和特异性以WOAH推荐qPCR为参照进行计算。
【数据】田间样本：100份（50份土壤+50份饲料）；样本量：50-100 g；采样地区：印度炭疽流行区；参照方法：WOAH推荐lef基因qPCR
2.12 统计分析
使用Cohen's kappa系数以及灵敏度、特异性的标准度量评估诊断一致性和性能。
【数据】统计方法：Cohen's kappa系数、灵敏度、特异性
研究结果
炭疽病作为一种重要的土壤传播人畜共患病，其传播动力源于炭疽芽孢杆菌孢子在环境中的长期持久性，尤其在流行地区[31]。在土壤等复杂环境基质中快速可靠地检测这些孢子，对监测、暴发预防和生物安全监控至关重要[7]。本研究的创新点在于开发了用于环境检测炭疽芽孢杆菌孢子的LAMP辅助CRISPR-Cas12a平台，以提高对近缘芽孢杆菌属的区分特异性。此外，UV照射可在保持DNA稳定性和可扩增性的同时实现完全孢子灭活[24]，在不影响下游检测性能的前提下确保生物安全。由此，该平台被系统评估为传统及PCR检测方法的快速、现场适应性替代方案。
3.1 LAMP assay优化
针对lef和CR5基因的LAMP检测在65°C下优化运行60分钟，引物浓度为0.20 μM（外引物）、1.60 μM（内引物）和0.40 μM（环引物）（图1）。这些条件与此前基于LAMP的炭疽芽孢杆菌及其他病原体检测系统一致[32,33]，表明扩增框架的稳健性。在分析灵敏度方面，靶向lef和CR5基因的LAMP分别达到10²和10³孢子/ml的检测限（图2A；补充图1），并具有高特异性（图2B；补充图2）。lef靶标的优越灵敏度可能反映了其质粒来源和相对于染色体靶标的更高拷贝数，这是核酸诊断中已知的优势。然而，CR5 SNP标记的引入为菌株区分提供了额外的特异性层面。
【数据】LAMP反应温度：65°C；时间：60 min；引物浓度：外引物0.20 μM、内引物1.60 μM、环引物0.40 μM；检测限：lef为10²孢子/ml，CR5为10³孢子/ml
3.2 CRISPR-Cas12a检测优化
CRISPR-Cas12a的整合显著提高了检测灵敏度和特异性。最优检测条件包括20 nM Cas12a、80 nM crRNA和80 nM报告分子（FAM-Biotin），4 μL LAMP产物在5分钟内产生清晰的侧向流动读值（图3）。在此条件下，LAMP-CRISPR联合检测相比单独LAMP将灵敏度提高了一个数量级（图3），可检测低至10孢子/ml（lef）和10²孢子/ml（CR5）（图2A；图4）。这一增强归因于Cas12a的序列特异性反式切割活性，减少了与非特异性LAMP扩增相关的假阳性[21]。该平台采用侧向流动终点读值而非荧光检测。在无模板对照（NTC）中未观察到可检测的背景信号或非特异性测试线形成，确认在无靶核酸时反式切割活性极低，支持优化条件下稳健的检测特异性。虽然基于CRISPR的检测在受控条件下已有单拷贝灵敏度的报道[29,34]，但此类性能往往依赖于样本。本研究中LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测的检测限略高，可能反映基质相关损失，强调了将样本处理与检测设计整合的重要性。
【数据】最优条件：Cas12a 20 nM、crRNA 80 nM、报告分子80 nM、LAMP产物4 μl；读值时间：5 min；检测限：lef为10孢子/ml，CR5为10²孢子/ml；灵敏度提升：1个数量级
3.3 加标土壤和肉粉基质中的孢子回收
基于GABRI的回收方案从土壤和肉粉基质中获得了一致的孢子回收效率，约为60-70%。该性能与早期采用蔗糖-去污剂系统的报道相当，该系统通过破坏亲水相互作用增强孢子从土壤颗粒上的解吸[23,24,35]。虽然完全回收仍具挑战性，但所达到的效率足以支持下游检测程序。值得注意的是，回收效率是环境诊断中决定整体检测灵敏度的关键因素，可能解释不同研究间的差异[36]。
【数据】孢子回收率：约60-70%；基质：土壤和肉粉；回收方法：GABRI（蔗糖-Tween 20载体）
3.4 加标环境样本中的性能
在加标土壤和肉粉样本中，LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测保持了与纯培养相当的检测性能。LAMP检测限保持在10²（lef）和10³（CR5）孢子/ml（图5A），而LAMP-CRISPR平台分别检测至10和10²孢子/ml（图5C）。重要的是，与近缘芽孢杆菌属或其他革兰氏阳性病原体未观察到交叉反应（图5B；5D），即使在混合微生物背景下也表现出高分析特异性（表3）。这些发现突显了结合质粒和染色体标记的双靶标策略的稳健性。与其他基于CRISPR的诊断平台（包括重组酶聚合酶扩增（RPA）-CRISPR和RT-LAMP-CRISPR系统[29,33]）相比，本检测表现出相当的特异性但灵敏度略低，可能反映环境基质的复杂性而非检测方法的内在局限。
【数据】加标样本检测限（LAMP）：lef为10²孢子/ml，CR5为10³孢子/ml；加标样本检测限（LAMP-CRISPR）：lef为10孢子/ml，CR5为10²孢子/ml；交叉反应：无
3.5 田间验证及与WOAH推荐qPCR的诊断评估
对来自炭疽流行地区（安得拉邦、卡纳塔克邦、泰米尔纳德邦、特伦甘纳邦和马哈拉施特拉邦）的100份样本（土壤和饲料样本各50份）的田间评估显示，优化后的LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测与WOAH推荐qPCR之间具有高度一致性。虽然饲料样本均未检测阳性，但qPCR检测出12份土壤样本阳性，其中11份被LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测正确识别（图6）。相对于WOAH推荐qPCR，LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测出现的单一假阴性结果可能归因于两种方法在分析灵敏度上的差异。qPCR检测表现出更高的灵敏度，能够检测孢子负荷极低的样本，甚至可能接近单孢子水平，而所开发的LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测在优化条件下的检测限约为10²孢子。因此，不一致的样本可能含有接近或低于检测阈值的炭疽芽孢杆菌孢子。此外，土壤等环境基质可能含有残留抑制物质，包括腐殖质化合物和有机碎片，这些物质可能干扰核酸扩增效率，进一步降低低负荷样本中的检测灵敏度[37]。由于CRISPR-Cas12a检测依赖于上游LAMP扩增的成功进行，扩增效率的轻微降低可能在田间条件下导致偶发假阴性结果。该检测实现了91.7%的灵敏度、100%的特异性以及近乎完美的一致性（κ = 0.95）（表4）。这些数值与此前报道的基于CRISPR的传染病诊断方法相当[28,34,35]。单一假阴性结果可能归因于接近检测阈值的低孢子负荷或基质相关抑制。值得注意的是，采用lef靶标的LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测持续优于CR5检测，进一步验证了质粒靶标在灵敏检测中的优势。然而，CR5在确证特异性方面仍然具有价值。
【数据】田间样本总数：100份；qPCR阳性：12份土壤样本；LAMP-CRISPR阳性：11份；灵敏度：91.7%；特异性：100%；κ值：0.95；检测限：约10²孢子
讨论与解读
本研究开发的LAMP辅助CRISPR-Cas12a检测平台在约70分钟内完成炭疽芽孢杆菌孢子的环境检测，检测限达10孢子/ml（lef靶标）和10²孢子/ml（CR5靶标）。该平台在加标土壤和肉粉基质中保持稳定性能，孢子回收率约60-70%。田间验证中，以WOAH推荐qPCR为参照，检测灵敏度91.7%、特异性100%（κ = 0.95）。尽管qPCR仍是分析灵敏度更高的参考方法，但本平台在设备需求、检测时间（约70分钟）和操作简便性方面具有实际优势，适用于资源受限和流行地区的初步环境筛查。未来优化方向包括多重检测和一管式反应格式，有望在"同一健康"框架下进一步提升炭疽监测能力。
编译者解读： 该研究巧妙地将LAMP的等温扩增能力与CRISPR-Cas12a的序列特异性识别相结合，在保持操作简便性的同时显著提升了检测特异性。双靶标策略（质粒lef+染色体CR5）兼顾了灵敏度与菌株区分能力，设计思路值得借鉴。60-70%的孢子回收率提示环境样本前处理仍是此类检测的瓶颈环节。对合成生物学应用而言，该平台展示了如何将CRISPR诊断工具从实验室推向田间，其模块化设计也为针对其他环境病原体的检测开发提供了可复制的技术范式。
参考来源
Borse Rushikesh Sanjay. LAMP-assisted CRISPR-Cas12a platform for detection of Bacillus anthracis spores in environmental samples. Analytica Chimica Acta, 2026.
DOI: 10.1016/j.aca.2026.345904
DOI: 10.1016/j.aca.2026.345904