来源：Surfactin, bacillibactin and bacilysin are the main antibacterial substances of Bacillus subtilis JSHY-K3 that inhibited the growth of VpAHPND (the main pathogen of acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp)（Aquaculture Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
对虾急性肝胰腺坏死病（AHPND）由携带pirA/pirB毒力基因的弧菌引起，给对虾养殖业造成重大经济损失。本研究利用CRISPR/Cas9技术对枯草芽孢杆菌JSHY-K3进行基因编辑，构建6株基因敲除突变株，通过拮抗实验、RT-PCR及高分辨质谱靶向定量分析，证实表面活性素（surfactin）、杆菌素（bacillibactin）和杆菌溶素（bacilysin）是该菌株抑制Vp^AHPND^生长的三种主要抗菌物质。
研究背景
急性肝胰腺坏死病是对虾的一种快速传染性、高致死率疾病，可对水产养殖业造成经济损失。该病由携带pirA和pirB毒力蛋白基因的特定弧菌群引起，最常见的是副溶血性弧菌（Vp^AHPND^）。当前，拮抗菌因环境友好、使用简便、丰度高且成本低，在对虾病害生物防治中引起广泛关注。其中，芽孢杆菌属是最常见的一类拮抗菌——分布广泛、能耐受多种极端环境、可产生多种广谱抑菌物质，还能调节水质并提高对虾免疫力。鉴定拮抗菌的抑菌物质，是研究拮抗菌抑菌机制的重要手段。
实验室前期通过全基因组测序及非靶向代谢组学分析，发现菌株JSHY-K3的抗菌物质可能包括表面活性素、aurantin B/C/D、丰原素、sublancin 168、杆菌素、subtilosin A、杆菌溶素、咖啡酸、磷霉素、米诺环素等，但具体抑菌物质尚不明确。本研究基于前期获得的基因组信息，利用CRISPR/Cas9技术对JSHY-K3进行基因编辑，构建6株基因敲除突变株，以明确其主要抑菌物质。
研究方法
2.1 菌株、质粒、培养基与培养条件
本研究所用菌株和质粒见表1。野生型枯草芽孢杆菌JSHY-K3作为基因组编辑的起始菌株。大肠杆菌DH5α用于基因克隆和质粒构建。穿梭载体pJOE8999（Altenbuchner, 2016）用于枯草芽孢杆菌JSHY-K3的基因组编辑。Vp^AHPND^ SHY1669作为指示菌，用于检测枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株对Vp^AHPND^的拮抗效果。
大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均在LB液体培养基中、30°C、200 rpm条件下培养24小时。固体培养基添加2%琼脂。拮抗菌抑制试验中，枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株、Vp^AHPND^ SHY1669在BHI固体培养基中、30°C培养72小时。枯草芽孢杆菌JSHY-K3感受态细胞按前述方法（Anagnostopoulos and Spizizen, 1961）使用SPI和SPII培养基制备。大肠杆菌转化子用50 µg/mL卡那霉素筛选，枯草芽孢杆菌转化子用25 µg/mL卡那霉素筛选。添加0.2% D-甘露糖诱导PmanP启动子表达Cas9蛋白（Gao et al., 2022）。
【数据】培养基：LB/BHI；温度：30°C；转速：200 rpm；时间：24-72h；琼脂：2%；卡那霉素：50 µg/mL（大肠杆菌）/25 µg/mL（枯草芽孢杆菌）；D-甘露糖：0.2%
2.2 质粒与菌株构建
以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pJOE8999为初始载体。首先，用Bsa I限制性内切酶（生工，中国）酶切pJOE8999质粒，产生线性化pJOE8999Gu片段。使用含有Bsa I酶切位点和构成sgRNA的20核苷酸序列的引物扩增sgRNA片段。将sgRNA片段通过Gibson组装连接至pJOE8999Gu，并转入大肠杆菌DH5α，获得pJOE-sgRNA质粒。
用Sfi I限制性内切酶（TaKaRa，中国）酶切pJOE-sgRNA质粒，产生线性化pJOE-sgRNAGu片段。以枯草芽孢杆菌JSHY-K3基因组为模板，使用带Sfi I酶切位点的引物扩增上下游同源臂。最后，将上下游同源臂通过Gibson组装连接至pJOE-sgRNAGu，并转入大肠杆菌DH5α，构建敲除质粒。本研究所用引物列于表S1，由擎科生物技术有限公司合成。敲除质粒构建的具体流程见图S1。
【数据】限制酶：Bsa I（生工）、Sfi I（TaKaRa）；组装方法：Gibson assembly；宿主菌：大肠杆菌DH5α；引物合成：擎科生物
2.3 感受态制备与转化
大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化步骤按制造商方案进行。枯草芽孢杆菌JSHY-K3感受态细胞按先前报道制备（Anagnostopoulos and Spizizen, 1961）。由于JSHY-K3菌株使用CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率很低，选择迭代基因组工程来提高编辑效率（So et al., 2017）。
将0.5–1 µg敲除质粒加入500 µL枯草芽孢杆菌JSHY-K3感受态细胞中，混匀，于37°C、100 rpm孵育30分钟。然后继续在30°C、200 rpm孵育2小时。将菌液转移至5 mL含0.2% D-甘露糖和25 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于200 rpm、30°C培养48小时。取5 µL菌悬液接种至相同条件的LB液体培养基中，在相同条件下培养24小时。此过程重复4–5次，然后取100 µL菌液用无菌水梯度稀释1 × 10^4^倍。将稀释菌液涂布于含0.2% D-甘露糖和25 µg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，于30°C培养24小时。
【数据】敲除质粒：0.5–1 µg；感受态细胞：500 µL；37°C、100 rpm、30 min；30°C、200 rpm、2h；D-甘露糖：0.2%；卡那霉素：25 µg/mL；培养：30°C、200 rpm、48h；传代：5 µL接种、重复4–5次；稀释：1×10^4^倍；涂布培养：30°C、24h
2.4 转化子验证
采用聚合酶链式反应（PCR）验证大肠杆菌和枯草芽孢杆菌转化子。使用预先设计的验证引物进行菌落PCR，检查敲除质粒是否成功构建。PCR阳性的转化子样品送至擎科生物技术有限公司测序，以验证敲除质粒序列的准确性。
从LB固体培养基上挑取枯草芽孢杆菌转化子的单菌落，接种至含0.2% D-甘露糖和25 µg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，于37°C培养12小时。挑取生长出的转化子，加入含100 µL无菌水的1.5 mL无菌离心管中，振荡混匀。沸水浴10分钟，然后12,000 × g离心10分钟。取10 µL上清液，用验证引物进行PCR反应。PCR阳性的转化子样品送至擎科生物技术有限公司进行测序分析，检查基因编辑是否成功。
【数据】培养：37°C、12h；无菌水：100 µL；煮沸：10 min；离心：12,000 × g、10 min；PCR模板：10 µL上清液
2.5 枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株对Vp^AHPND^的拮抗效果
将枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株、Vp^AHPND^ SHY1669分别接种于100 mL BHI液体培养基中，于30°C、200 rpm培养24小时。用无菌水将Vp^AHPND^ SHY1669菌液浓度稀释至1.0 × 10^6^ CFU/mL。随后，取100 µL稀释后的SHY1669悬液涂布于BHI固体培养基上。自然干燥后，将无菌药敏纸片贴附于培养基表面。然后分别取10 µL枯草芽孢杆菌JSHY-K3或其衍生菌株菌液滴加于培养基上的药敏纸片，以10 µL新鲜无菌BHI液体培养基作为空白对照。于30°C培养72小时后，用游标卡尺测量抑菌圈直径。
【数据】培养：30°C、200 rpm、24h；SHY1669浓度：1.0 × 10^6^ CFU/mL；涂布量：100 µL；菌液滴加量：10 µL；空白对照：10 µL BHI；抑菌圈测定：30°C、72h、游标卡尺
2.6 枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株无细胞培养液对Vp^AHPND^的拮抗效果
制备枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株的无细胞培养液，测定其对Vp^AHPND^的拮抗效果，步骤如下。Vp^AHPND^ SHY1669在5 mL BHI液体培养基中、30°C培养24小时。枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株在6 mL BHI液体培养基中、30°C培养24小时（OD600 = 3.47 ± 0.21）。将枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株的菌液在4°C、8000 × g离心5分钟，上清液经0.22 µm孔径滤膜过滤，获得5 mL无细胞培养液。
将等体积的SHY1669菌液接种至5 mL枯草芽孢杆菌JSHY-K3或其衍生菌株的无细胞培养液中，初始OD600为0.15–0.20。将等体积SHY1669菌液加入等体积新鲜无菌BHI液体培养基中作为空白对照。接种后的SHY1669菌液于30°C、200 rpm培养24小时，用分光光度计测定OD600。测定OD600后，从每组收集1 mL SHY1669菌液，保存用于后续pirA基因相对表达水平检测。最后，从每组取100 µL SHY1669菌液，分别梯度稀释10^3^、10^4^、10^5^、10^6^、10^7^、10^8^、10^9^和10^10^倍。取各稀释梯度100 µL涂布于TCBS固体培养基上，于30°C培养24小时，用菌落计数器（力辰，中国）记录各平板上的总菌落数。
【数据】JSHY-K3培养：6 mL BHI、30°C、24h、OD600=3.47±0.21；离心：8000 × g、5 min、4°C；滤膜：0.22 µm；初始OD600：0.15–0.20；培养：30°C、200 rpm、24h；稀释梯度：10^3^–10^10^；涂布：100 µL；TCBS培养：30°C、24h
2.7 RT-PCR检测pirA基因相对表达量
采用RT-PCR检测经枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株无细胞培养液处理的SHY1669菌株中pirA基因的相对表达量。使用Spin Column Bacteria Total RNA Purification Kit（生工，中国）从上述实验中保留的1 mL SHY1669菌液中提取总RNA。使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（天根，中国）合成第一链cDNA。以合成的cDNA为模板进行实时定量RT-PCR。RT-PCR反应在StepOne Plus Real-Time PCR系统（ABI，中国）上进行。
【数据】RNA提取试剂盒：生工Spin Column Bacteria Total RNA Purification Kit；反转录试剂盒：天根FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix；仪器：StepOne Plus Real-Time PCR System（ABI）；样品量：1 mL菌液
图1 纸片琼脂扩散法检测枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其敲除突变株对Vp^AHPND^ SHY1669的拮抗作用。（A-F）敲除突变株ΔsrfAB-AC、ΔppsA-B、ΔsunI-T、ΔdhbC、Δsbo和ΔbacA对SHY1669的拮抗效果。（G）枯草芽孢杆菌JSHY-K3的抑菌圈
研究结果
3.1 敲除突变株的构建与验证
将敲除质粒转入野生型菌株JSHY-K3，用验证引物对筛选的转化子进行PCR反应，检测敲除是否成功。部分转化子的片段小于野生型菌株JSHY-K3，片段大小符合预期（图S2B）。测序结果显示，阳性转化子序列与参考序列匹配，敲除突变株构建成功。
【数据】PCR验证：部分转化子片段小于野生型；测序：阳性转化子序列与参考序列匹配
3.2 枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株对Vp^AHPND^的拮抗效果
以Vp^AHPND^ SHY1669为指示菌，测定枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其敲除突变株对Vp^AHPND^的拮抗效果，具体结果见图1。与枯草芽孢杆菌JSHY-K3相比，菌株ΔsrfAB-AC、ΔdhbC和ΔbacA对SHY1669的拮抗效果显著降低，其中ΔbacA菌株的降低最为明显。枯草芽孢杆菌JSHY-K3的抑菌圈为3.00 ± 0.06 cm，菌株ΔsrfAB-AC为2.42 ± 0.08 cm，菌株ΔdhbC为2.40 ± 0.12 cm，菌株ΔbacA为1.75 ± 0.10 cm。其余敲除突变株对SHY1669的拮抗效果与枯草芽孢杆菌JSHY-K3无显著差异。
【数据】抑菌圈直径：JSHY-K3为3.00±0.06 cm；ΔsrfAB-AC为2.42±0.08 cm；ΔdhbC为2.40±0.12 cm；ΔbacA为1.75±0.10 cm
图2 枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株无细胞培养液对Vp^AHPND^的拮抗效果。（A）通过测定Vp^AHPND^ SHY1669的OD600检测枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其敲除突变株无细胞培养液对Vp^AHPND^的拮抗效果。（B）枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株无细胞培养液对Vp^AHPND^的拮抗效果
3.3 枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株无细胞培养液对Vp^AHPND^的拮抗效果
枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其敲除突变株在BHI中的无细胞培养液对Vp^AHPND^ SHY1669的生长具有显著的拮抗效果（图2）。与JSHY-K3相比，菌株ΔsrfAB-AC、ΔdhbC和ΔbacA的无细胞培养液对SHY1669生长的拮抗效果显著降低，其中ΔbacA菌株对SHY1669的拮抗效果降低最为明显。
如图2A所示，SHY1669菌株在JSHY-K3无细胞培养液中、30°C培养24小时后的OD600为1.17 ± 0.07；在ΔsrfAB-AC和ΔdhbC无细胞培养液中分别为2.57 ± 0.07和2.34 ± 0.04；在ΔbacA无细胞培养液中为3.86 ± 0.08；空白对照组OD600为6.45 ± 0.04；其余敲除突变株无细胞培养液中SHY1669的OD600与JSHY-K3无细胞培养液中的基本相同。
此外，实验发现对照组中SHY1669菌株的密度为1.89 × 10^10^ CFU/mL，而JSHY-K3及其敲除突变株无细胞培养液中SHY1669菌株的密度显著降低（图2B）。SHY1669菌株在JSHY-K3无细胞培养液中、30°C培养24小时后的密度为1.93 × 10^7^ CFU/mL；在ΔsrfAB-AC和ΔdhbC无细胞培养液中分别为5.91 × 10^8^ CFU/mL和5.63 × 10^8^ CFU/mL；在ΔbacA无细胞培养液中为8.43 × 10^9^ CFU/mL；其余敲除突变株无细胞培养液中SHY1669菌株的密度与JSHY-K3无细胞培养液中的基本相同。
【数据】OD600（24h）：JSHY-K3组1.17±0.07；ΔsrfAB-AC组2.57±0.07；ΔdhbC组2.34±0.04；ΔbacA组3.86±0.08；空白对照6.45±0.04。菌落数：对照组1.89×10^10^ CFU/mL；JSHY-K3组1.93×10^7^ CFU/mL；ΔsrfAB-AC组5.91×10^8^ CFU/mL；ΔdhbC组5.63×10^8^ CFU/mL；ΔbacA组8.43×10^9^ CFU/mL
图3 经JSHY-K3及其敲除突变株无细胞培养液处理后Vp^AHPND^ SHY1669中pirA基因的相对表达量。数据间差异采用单因素方差分析比较。*：p < 0.05，**：p < 0.01
3.4 RT-PCR检测pirA基因相对表达量
采用RT-PCR检测经枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株无细胞培养液处理24小时后Vp^AHPND^ SHY1669菌株中pirA基因的相对表达量，结果见图3。与空白对照组相比，经枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其敲除突变株无细胞培养液处理后，SHY1669中pirA基因的转录水平显著下调。与JSHY-K3无细胞培养液处理组相比，经ΔsrfAB-AC、ΔdhbC、ΔbacA无细胞培养液处理后，SHY1669中pirA基因的转录水平显著上调，其中ΔbacA无细胞培养液处理组的上调最为明显。
【数据】pirA表达：JSHY-K3处理组显著下调；ΔsrfAB-AC、ΔdhbC、ΔbacA处理组显著上调（vs JSHY-K3组）；ΔbacA组上调最明显；统计方法：单因素方差分析；显著性：p < 0.05，p < 0.01
3.5 高分辨HPLC-MS靶向检测表面活性素、杆菌素和杆菌溶素
通过高分辨HPLC-MS检测，在枯草芽孢杆菌JSHY-K3发酵上清液中成功检测到三种抗菌肽：表面活性素A、杆菌素和杆菌溶素。值得注意的是，结合高分辨一级和二级质谱结果，发现有两种疑似杆菌素的物质，这两种物质的分子量均为883.3 Da，在HPLC中的保留时间分别为7.375分钟和7.564分钟。此外，在7.564分钟洗脱的化合物的质谱中检测到的所有碎片离子，在7.375分钟的化合物中也均能检测到（图S3）。
为对这3种抗菌肽进行相对定量，基于高分辨一级和二级质谱信息建立了这3种抗菌肽的MRM通道并优化了参数，提取离子色谱图（XIC）如图4所示。根据XIC，确定了这3种抗菌肽的最佳MRM通道，其最佳MRM通道的离子对信息见表2。
【数据】杆菌素疑似物质：两种，分子量883.3 Da，HPLC保留时间7.375 min和7.564 min
图4 枯草芽孢杆菌JSHY-K3发酵上清液中表面活性素A、杆菌素和杆菌溶素的多个MRM通道对应的提取离子色谱图（XIC）。（A-C）依次为表面活性素、杆菌素和杆菌溶素对应的多个MRM通道XIC
3.6 枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株来源的三种抗菌肽的三重四极杆定量
利用表面活性素、杆菌素和杆菌溶素的最佳MRM通道，建立了三重四极杆相对定量方法。通过三重四极杆定量分析发现，菌株ΔsrfAB-AC发酵上清液中表面活性素A在HPLC中的峰面积显著小于野生菌株，而杆菌素和杆菌溶素两种抗菌肽在HPLC中的峰面积与野生菌株无显著差异。菌株ΔdhbC发酵上清液中杆菌素在HPLC中的峰面积显著小于野生菌株，而表面活性素A和杆菌溶素两种抗菌肽在HPLC中的峰面积与野生菌株无显著差异。值得注意的是，ΔbacA发酵上清液中表面活性素A和杆菌溶素在HPLC中的峰面积均较野生菌株显著降低，而杆菌素在HPLC中的峰面积与野生菌株无显著差异。三种抗菌肽在枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株发酵上清液中HPLC的具体峰面积和图谱见表3和图5。
【数据】ΔsrfAB-AC：surfactin A峰面积显著降低，bacillibactin和bacilysin无显著差异；ΔdhbC：bacillibactin峰面积显著降低，surfactin A和bacilysin无显著差异；ΔbacA：surfactin A和bacilysin峰面积均显著降低，bacillibactin无显著差异
图5 枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株发酵上清液中表面活性素、杆菌素和杆菌溶素的HPLC图谱。（A-C）分别为枯草芽孢杆菌JSHY-K3发酵上清液中表面活性素、杆菌素和杆菌溶素的HPLC图谱。（D）枯草芽孢杆菌JSHY-K3及其衍生菌株发酵上清液中表面活性素的HPLC图谱
讨论与解读
枯草芽孢杆菌能产生多种生物活性物质来抑制多种动植物病原体的生长，在多种植物和动物疾病的生物防治中具有良好前景。目前对枯草芽孢杆菌抑菌物质的研究主要集中在核糖体途径合成的细菌素、非核糖体途径合成的肽类抗生素和非肽类抗生素。本研究针对枯草芽孢杆菌JSHY-K3的6种潜在抗菌肽，成功构建了6株敲除突变株：ΔsrfAB-AC、ΔppsA-B、ΔsunI-T、ΔdhbC、Δsbo和ΔbacA。通过检测菌液和无细胞培养液对Vp^AHPND^的拮抗效果，发现srfAB-AC、dhbC和bacA基因的缺失降低了JSHY-K3对Vp^AHPND^ SHY1669的拮抗作用，表明表面活性素、杆菌素和杆菌溶素可能是JSHY-K3抑制Vp^AHPND^生长的主要物质。已有报道表明表面活性素能抑制副溶血性弧菌的生长，本实验室前期也在JSHY-K3菌株具有抑菌活性的发酵提取物中成功检测到表面活性素A。值得注意的是，ΔsrfAB-AC、ΔdhbC和ΔbacA菌株对Vp^AHPND^仍表现出较弱的拮抗效果，说明可能还有其他抗菌物质参与抑菌作用。
编译者解读
本研究采用CRISPR/Cas9基因编辑结合高分辨质谱靶向定量的策略，系统鉴定了枯草芽孢杆菌JSHY-K3中对虾AHPND病原菌的三种主要抗菌物质，方法学上具有清晰的"基因型-表型-化学表型"闭环逻辑。三重四极杆定量结果精准对应各基因敲除后的代谢物变化，验证了基因簇与产物合成的对应关系。值得关注的是，ΔbacA菌株同时影响表面活性素A和杆菌溶素的合成，提示bacA基因可能在调控网络中具有更上游的位置，这为后续解析次级代谢调控机制提供了切入点。从应用角度看，明确三种抗菌肽的贡献为开发基于JSHY-K3的益生菌制剂提供了质量控制靶标，但单一菌株在实际养殖环境中的稳定性仍需进一步验证。
参考来源
Xiang, L. (2025). Surfactin, bacillibactin and bacilysin are the main antibacterial substances of Bacillus subtilis JSHY-K3 that inhibited the growth of Vp^AHPND^ (the main pathogen of acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp). Aquaculture Reports, 2025. DOI: 10.1016/j.aqrep.2025.102745
DOI: 10.1016/j.aqrep.2025.102745