来源：Suppressing isovaleric acid off-flavor in Bacillus subtilis fermentation and its consequential effects on secondary metabolism（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
枯草芽孢杆菌发酵豆制品营养丰富，但以异戊酸为代表的分支链脂肪酸异味严重制约消费者接受度。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了缺失bkdAB和alsS基因的突变株，并与前期构建的Δbcd、Δptb突变株系统比较，在真实豆乳基质中验证了异戊酸合成的关键调控节点。结果显示，敲除bcd和bkdAB分别使异戊酸降低81.85%和70.31%，同时提升果香酯类和醇类物质含量，感官接受度从4.3分提升至6.6分。该研究为食品级工业菌株的异味改良提供了明确的遗传靶点。
研究背景
大豆是优质植物蛋白来源，微生物发酵可提升豆制品的营养价值和感官品质。枯草芽孢杆菌发酵豆制品（如日本纳豆、韩国清麴酱、中国豆豉）日益受到全球关注。该菌在发酵中降解大分子，释放氨基酸、多肽及生物活性代谢物，并加速异黄酮糖苷向苷元的转化。与固态发酵相比，豆乳作为均质、营养丰富的液态基质，更利于受控条件下的发酵代谢研究。然而，以异戊酸为代表的分支链脂肪酸异味严重制约了这类产品的工业化推广。尽管亮氨酸和乙酰乳酸来源的合成途径已被提出，豆乳发酵中异戊酸合成的关键调控节点仍不明确。本研究系统评估了bcd、bkdAB、ptb和alsS四个基因在豆乳发酵过程中对异戊酸生物合成的调控作用。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株和质粒汇总于补充材料。枯草芽孢杆菌168在Luria–Bertani（LB）液体培养基中、37°C、200 rpm振荡条件下培养。电转化在含0.5 M山梨醇和0.38 M甘露醇的缓冲液中进行。转化后细胞于30°C恢复培养，转化子在含50 μg/mL卡那霉素（Solarbio，北京，中国）的LB琼脂平板上筛选。
【数据】培养基：LB；温度：37°C（培养）/30°C（恢复）；转速：200 rpm；山梨醇：0.5 M；甘露醇：0.38 M；卡那霉素：50 μg/mL
2.2 bkdAB和alsS敲除菌株的构建
目标基因bkdAB和alsS采用CRISPR/Cas9系统敲除。针对每个靶基因设计单向导RNA（sgRNA）和侧翼同源臂（见补充材料）。上游和下游同源臂以BS168基因组DNA为模板、高保真聚合酶（2 × SuperPfu PCR Mix，杭州宝赛生物科技有限公司，中国）经聚合酶链式反应（PCR）扩增获得，并通过无缝克隆（5 × Infusion Cloning Mix，杭州宝赛生物科技有限公司，中国）插入SalI线性化的pBSCas9-sgRNA载体，构建敲除载体。重组质粒电转入BS168（2.0 kV，1-mm电转杯）。转化子在含卡那霉素的LB平板上筛选（30°C，24 h），并通过接合PCR和内部PCR验证。消除温敏质粒后，通过PCR和Sanger测序确认无质粒克隆。验证后的突变株BS168ΔalsS和BS168ΔbkdAB保存于−80°C。
【数据】电转电压：2.0 kV；电转杯：1-mm；筛选温度：30°C；筛选时间：24 h；卡那霉素浓度：原文未详述（LB平板含卡那霉素）
2.3 发酵实验
大豆（品种690，山东，中国）浸泡10 h，按1:8（w/v）加水均质，121°C灭菌15 min制备豆乳。初始成分测定为：总糖42.54 g/L、还原糖0.31 g/L、总蛋白22.8 g/L、可溶性蛋白5.69 g/L、氨基酸氮1.28 g/L、脂肪13.1 g/L，分别采用苯酚–硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法、杜马斯燃烧法、BCA法、甲醛滴定法和索氏提取法测定。电感耦合等离子体发射光谱法矿物质分析显示K、P、S、Ca、Mg、Na、Fe、Mn、Zn含量分别为779、314、253、181、133、15.1、3.35、1.78和1.60 mg/kg。灭菌豆乳中未添加额外无机盐或营养补充剂。菌株从−80°C保藏物在LB琼脂上活化，并在LB液体中培养至约1 × 10⁸ CFU/mL。分批发酵在含50 mL灭菌豆乳的250 mL摇瓶中进行。豆乳按1%（v/v）接种，在37°C、200 rpm振荡培养箱中发酵。每12 h取样一次，持续72 h。发酵进程通过pH、活菌数、酶活和主要营养成分的时间曲线表征；异戊酸、挥发性代谢物、游离氨基酸、脂肪酸组成和代谢组学谱在48 h（代表性发酵阶段）于各菌株间比较。
【数据】大豆浸泡：10 h；料水比：1:8（w/v）；灭菌：121°C，15 min；总糖：42.54 g/L；还原糖：0.31 g/L；总蛋白：22.8 g/L；可溶性蛋白：5.69 g/L；氨基酸氮：1.28 g/L；脂肪：13.1 g/L；接种量：1%（v/v）；温度：37°C；转速：200 rpm；发酵时间：72 h；取样间隔：12 h；K：779 mg/kg；P：314 mg/kg；S：253 mg/kg；Ca：181 mg/kg；Mg：133 mg/kg；Na：15.1 mg/kg；Fe：3.35 mg/kg；Mn：1.78 mg/kg；Zn：1.60 mg/kg
2.4 pH、菌落计数和纳豆激酶活性测定
pH使用pH计（FE28，Mettler-Toledo，Greifensee，瑞士）测定。活菌数采用稀释涂布法计数。纳豆激酶活性按前述方法（Gao et al., 2024）在纤维蛋白平板上测定，以尿激酶（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）校准。
【数据】pH计型号：FE28（Mettler-Toledo）；校准标准品：尿激酶（Sigma-Aldrich）
2.5 营养成分分析
#### 2.5.1 总蛋白、可溶性蛋白和氨基酸氮含量测定
总蛋白含量采用杜马斯燃烧法（NDA 701，VELP Scientifica）测定。可溶性蛋白采用BCA试剂盒（Solarbio）定量。氨基酸氮按中国国家标准GB 5009.235–2016分析。具体操作：5 mL样品稀释至100 mL，取10 mL等分试样用0.05 M NaOH滴定至pH 8.2。加入10 mL 38%甲醛反应60 s后，滴定至pH 9.2。样品和空白的滴定体积分别为V1和V0。氨基酸氮含量（mg/mL）按下式计算：
氨基酸氮含量（mg/mL）=（V1 − V0）× 0.05 × 0.014 /（5 × 0.1）× 1000
其中V1和V0分别为样品和空白的滴定体积（mL）。
【数据】NaOH浓度：0.05 M；甲醛浓度：38%；反应时间：60 s；终点pH：8.2和9.2；样品量：5 mL稀释至100 mL，取10 mL滴定
#### 2.5.2 游离氨基酸测定
游离氨基酸分析在Hitachi L-8900氨基酸分析仪上进行。简要步骤：1 mL样品用8%（w/v）磺基水杨酸脱蛋白，涡旋并离心。收集上清液，氮气吹干，以0.02 M HCl复溶，过滤后进样。分离采用钠型阳离子交换柱，柠檬酸盐缓冲液（pH 3.2、4.3）为流动相，流速0.6 mL/min，柱温60°C。检测波长570 nm，基于外标定量。
【数据】样品量：1 mL；磺基水杨酸：8%（w/v）；复溶液：0.02 M HCl；流速：0.6 mL/min；柱温：60°C；检测波长：570 nm；缓冲液pH：3.2、4.3
#### 2.5.3 脂肪含量测定
脂肪含量按中国国家标准GB 5009.6–2016第一法（索氏提取法）修改测定。冻干样品用于测定干物质含量（C）。随后，1 g干燥样品（m1）用石油醚（30–60°C）在自动索氏提取系统（SER 148，VELP Scientifica，Usmate，意大利）中提取。接收瓶提取前后的质量分别记录为m0和m2。脂肪含量按下式计算：
脂肪含量（g/100 g）=（m2 − m0）× C × 100 / m1
其中m0为接收瓶皮重（g），m1为试样质量（g），m2为接收瓶加脂肪总质量（g），C为干物质含量。
【数据】样品量：1 g；提取溶剂：石油醚（30–60°C）；仪器：SER 148（VELP Scientifica）
#### 2.5.4 脂肪酸含量测定
脂肪酸含量采用气相色谱（Agilent 7890B，Santa Clara，CA，USA）分析。简要步骤：1 g样品加入三癸酸甘油酯内标，经水解和甲酯化形成脂肪酸甲酯（FAMEs）。分析在CP-Sil 88色谱柱（100 m × 0.25 mm × 0.20 μm）上进行，氦气为载气（1 mL/min）。柱温箱程序从140°C升至240°C，升温速率4°C/min，240°C保持15 min。进样口和检测器温度分别为270°C和280°C。基于与内标的峰面积比定量。
【数据】样品量：1 g；载气：氦气，1 mL/min；程序升温：140→240°C，4°C/min；保持：240°C，15 min；进样口温度：270°C；检测器温度：280°C；色谱柱：CP-Sil 88（100 m × 0.25 mm × 0.20 μm）
2.6 关键酶活性测定
四种酶使用商业试剂盒测定，细胞提取物从收获的细胞制备。ALS活性通过525 nm显色终点法测定（BC5525，Solarbio，北京，中国），按试剂盒定义以U/g生物量表示。Ptb和Bkd活性在450 nm处使用商业试剂盒（UMBio，北京，中国）测定，按制造商说明以IU/mL细胞提取物报告。Bcd活性通过监测340 nm处NADH氧化动力学测定（G0444W，Geruisi-Bio，武汉，中国），按试剂盒定义以nmol/min/mL细胞提取物表示。
【数据】ALS检测波长：525 nm；Ptb和Bkd检测波长：450 nm；Bcd检测波长：340 nm（NADH氧化）；试剂盒货号：BC5525（Solarbio）、UMBio、G0444W（Geruisi-Bio）
2.7 风味特征分析
#### 2.7.1 感官评价
采用定量描述分析（QDA）评估发酵豆乳样品的感官特征（Lin et al., 2024）。15名受过训练的评审员（9名女性，6名男性）对5 g样品（25°C平衡）进行盲评。关键异味（豆腥味、苦味、汗臭味、氨味、酸败味、霉味）强度按0–10分制评分（0 = 无，10 = 极强）。总体接受度采用类似量纲评估（0 = 完全不可接受，10 = 高度可接受）。样品间设置30 s间隔以减轻感官疲劳，每个样品嗅闻三次。所有参与者在测试前签署书面知情同意书。
【数据】评审员：15人（9女6男）；样品量：5 g；平衡温度：25°C；评分范围：0–10；间隔时间：30 s；嗅闻次数：3次
#### 2.7.2 电子鼻分析
电子鼻分析采用PEN-3系统（Airsense Analytics，Schwerin，德国），配备10个金属氧化物传感器（Xiao & L
【数据】仪器：PEN-3（Airsense Analytics）；传感器数量：10个金属氧化物传感器
研究结果
3.1 工程敲除菌株的构建与发酵性状分析
#### 3.1.1 基因敲除菌株的构建
采用CRISPR/Cas9系统删除了BS168的alsS和bkdAB基因，获得BS168ΔalsS和BS168ΔbkdAB。接合引物PCR产生较短的片段（BS168ΔalsS为1041 bp，BS168ΔbkdAB为1067 bp），而野生型分别为2754 bp和2051 bp；内部引物未获得扩增产物（图1A和B）。接合片段测序进一步确认了靶基因被抗生素抗性 cassette 替换（见补充材料）。突变体基因型在无抗生素选择压力下连续传代十次后仍保持稳定，证明基因敲除可遗传。这些菌株为alsS和bkdAB的功能分析提供了可靠工具。
【数据】BS168ΔalsS接合PCR片段：1041 bp；BS168ΔbkdAB接合PCR片段：1067 bp；野生型alsS位点：2754 bp；野生型bkdAB位点：2051 bp；连续传代：10次
#### 3.1.2 发酵性状分析
通过时间曲线监测BS168和四个敲除突变株的异戊酸、pH、活菌数和纳豆激酶（NK）活性。BS168的异戊酸最高（2363 μg/kg，图1C）。BS168Δbcd（429 μg/kg，−81.85%）和BS168ΔbkdAB（702 μg/kg，−70.31%）的异戊酸显著降低。BS168ΔalsS（1395 μg/kg，−40.97%）和BS168Δptb（1634 μg/kg，−30.83%）的降幅较小。这些结果表明bcd和bkdAB对异戊酸积累的贡献大于alsS和ptb。发酵过程中，pH先略微下降后升至约9.0（图1D），可能归因于碱性发酵中蛋白质降解和氨释放（Gao et al., 2024）。BS168ΔbkdAB的pH上升速度比其他菌株慢。所有菌株的活菌数均超过1 × 10⁹ CFU/mL（图1E），表明枯草芽孢杆菌在豆乳中生长旺盛。BS168Δbcd和BS168ΔalsS的细胞密度峰值出现在36 h，BS168Δptb在24 h，BS168ΔbkdAB在48 h，表明生长动态改变但不影响整体性能。如图1F所示，多个突变株的纳豆激酶峰值活性高于BS168（72 h时为406 IU/mL）。其中，BS168Δbcd和BS168Δptb分别达到520 IU/mL（60 h）和526 IU/mL（72 h），分别增加约28%和29%。BS168ΔbkdAB的NK产生延迟，但在72 h达到453 IU/mL的峰值活性（增加12%）。相比之下，BS168ΔalsS表现出最高的NK活性，在60 h达到587 IU/mL（增加45%）。重要的是，这些基因缺失未损害发酵性能。
【数据】BS168异戊酸：2363 μg/kg；BS168Δbcd：429 μg/kg（−81.85%）；BS168ΔbkdAB：702 μg/kg（−70.31%）；BS168ΔalsS：1395 μg/kg（−40.97%）；BS168Δptb：1634 μg/kg（−30.83%）；pH峰值：约9.0；活菌数：>1 × 10⁹ CFU/mL；BS168 NK峰值：406 IU/mL（72 h）；BS168Δbcd：520 IU/mL（60 h，+28%）；BS168Δptb：526 IU/mL（72 h，+29%）；BS168ΔbkdAB：453 IU/mL（72 h，+12%）；BS168ΔalsS：587 IU/mL（60 h，+45%）
3.2 发酵豆乳的风味表征
#### 3.2.1 感官评价
基因修饰通过减少异味属性改善了发酵豆乳的感官品质（图2A）。BS168表现出较强的汗臭味（6.4）和氨味（6.0），与先前关于纳豆的报道一致（Lan et al., 2020）。所有突变株的汗臭味均低于BS168。BS168ΔbkdAB的改善最为显著，氨味和酸败味评分均较低（均为2.7），汗臭味也降至3.1。BS168Δptb的汗臭味也降低（3.5），而BS168ΔalsS的豆腥味评分最低（2.4）。所有突变株的总体接受度均提高（图2B），BS168ΔbkdAB得分最高（6.6），其次为BS168Δbcd（6.2）、BS168Δptb（5.5）和BS168ΔalsS（5.1），而BS168为4.3。这些结果表明，敲除bcd、ptb、alsS，尤其是bkdAB，是减轻异味和改善感官接受度的有效策略，与近期针对大豆制品芽孢杆菌菌株代谢工程的研究进展一致（Chen et al., 2024; Wen et al., 2025）。
【数据】BS168汗臭味：6.4；氨味：6.0；BS168ΔbkdAB氨味和酸败味：均为2.7；汗臭味：3.1；BS168Δptb汗臭味：3.5；BS168ΔalsS豆腥味：2.4；总体接受度：BS168ΔbkdAB 6.6 > BS168Δbcd 6.2 > BS168Δptb 5.5 > BS168ΔalsS 5.1 > BS168 4.3
#### 3.2.2 电子鼻分析
使用配备10传感器阵列的PEN-3电子鼻进一步评估挥发性特征（Wei & Gu, 2020）。雷达图显示各菌株间存在明显不同的响应模式（图2C）。BS168在W1W（1.58）和W5S（1.23）传感器处响应较高，这两个传感器主要分别响应含硫化合物和含氮挥发性物质。相比之下，所有突变株在这些传感器处的响应均降低，其中BS168ΔbkdAB（W1W：1.47；W5S：1.09）和BS168Δbcd（W5S：0.83）降幅最大。PCA解释了82.9%的方差（PC1：56.0%；PC2：26.9%），并将BS168与突变株清晰分离（图2D）。BS168位于PC2正区域，与其高异味传感器响应相关。BS168Δbcd和BS168ΔbkdAB沿PC1和PC2轴明显分离，而BS168Δptb和BS168ΔalsS呈中间分布。PC1主要由W1S、W2S、W2W和W1W传感器驱动，PC2与W6S和W3S相关。综上，电子鼻数据表明bkdAB和bcd敲除最能有效降低与不良气味相关的挥发性信号。
【数据】BS168 W1W响应：1.58；W5S响应：1.23；BS168ΔbkdAB W1W：1.47；W5S：1.09；BS168Δbcd W5S：0.83；PCA总方差解释：82.9%（PC1：56.0%；PC2：26.9%）
3.3 发酵豆乳中挥发性有机化合物分析
#### 3.3.1 挥发性有机化合物组成
48 h时，采用HS-SPME-GC–MS分析VOCs（图3A和B），完整挥发性有机化合物列表见补充材料。该时间点用于菌株依赖性挥发性特征的终点比较。BS168中，醇类占主导地位（997.65 μg/kg），其特征为草本醇类（如1-己醇）、奶油酮类（如2,3-戊二酮）和支链脂肪酸如异戊酸。该模式与典型发酵豆制品一致（Huang et al., 2022; Zhang et al., 2022b），也与感官评价中观察到的豆腥味、酸败味和汗臭味相符（图2A）。靶向基因缺失重塑了所有突变株的挥发性特征（图3A）。BS168ΔbkdAB和BS168Δbcd的酸类物质降幅最大，分别伴随酯类和醛类物质增加。BS168ΔalsS以呋喃类升高以及坚果味和蘑菇味挥发性物质增加为特征，而BS168Δptb在多种酯类和醛类上均呈现降低。总体而言，这些变化表明挥发性特征从酸败味和青草味转向果香、坚果香和麦芽香。
【数据】BS168醇类总量：997.65 μg/kg；分析时间点：48 h；分析方法：HS-SPME-GC–MS
#### 3.3.2 多元统计分析
PLS-DA将BS168与突变株清晰分为五个不同组别（图3C）。模型表现出高可靠性（R²X = 94.3%，Q² = 94.5%），200次置换检验验证了模型稳健性（图3D）。变量投影重要性（VIP）分析鉴定出36种关键判别性挥发性物质（VIP > 1.0，p < 0.05）（图3E）。其中，2-戊基呋喃和异戊酸等已确立的异味化合物尤为突出。VIP列表还包括1-己醇、苯乙酸甲酯和2,5-二甲基吡嗪等分别与草本、果香和坚果香属性相关的化合物（Ma et al., 2025; Ren et al., 2024），有助于解释菌株间的香气差异。
【数据】模型参数：R²X = 94.3%，Q² = 94.5%；置换检验：200次；关键判别挥发性物质：36种（VIP > 1.0，p < 0.05）
#### 3.3.3 理想风味成分特征
通过OAV分析鉴定关键气味活性物质（表1）。OAV值基于已发表文献中的气味阈值计算（Fu et al., 2023; Wang et al., 2020; Ye et al., 2024）。BS168中，异戊酸是主要的异味驱动因子，而2-戊基呋喃贡献果香–豆腥特征但对总体接受度影响较小。BS168ΔbkdAB的改善最为显著，其特征为异戊酸显著降低、果香酯类和醇类增加，且1-庚醇仅在该菌株中检出。BS168ΔalsS也因异戊酸降低而呈现更清爽、更具果香的轮廓，尽管2-戊基呋喃有所增加，进一步凸显了异戊酸在异味形成中的主导作用。BS168Δbcd表现为异戊酸降低、2,5-二甲基吡嗪增加以及2-甲基丁醛出现。BS168Δptb中，异戊酸降低和异戊醛缺失共同促成更清爽的香气，与Ptb在分支链酰基辅酶A向酸转化中的作用一致（Jiang et al., 2024）。在所有突变株中，增加
【数据】OAV计算依据：已发表气味阈值；BS168ΔbkdAB独有检出：1-庚醇；BS168Δbcd新增：2-甲基丁醛；BS168Δptb缺失：异戊醛
3.4 发酵豆乳的多元分析与差异代谢物鉴定
（原文此处内容在节选中未完整呈现，以下依据可获得的原文节选内容翻译）
【数据】原文未详述
3.5 发酵豆乳的营养品质评价
（原文此处内容在节选中未完整呈现，以下依据可获得的原文节选内容翻译）
【数据】原文未详述
3.6 异戊酸形成的代谢途径解析
（原文此处内容在节选中未完整呈现，以下依据可获得的原文节选内容翻译）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究在真实豆乳基质中系统验证了枯草芽孢杆菌异戊酸生物合成的关键基因调控节点。异戊酸从BS168的2363 μg/kg在BS168Δbcd中降低81.85%、在BS168ΔbkdAB中降低70.31%，BS168ΔalsS（−40.97%）和BS168Δptb（−30.83%）降幅较小。感官接受度从4.3分提升至BS168ΔbkdAB的6.6分。酶活测定和非靶向代谢物谱分析确定bcd和bkdAB为优势调控节点，ptb作用于下游，alsS影响上游碳通量分配。
编译者解读：该研究最值得称道之处在于将基因敲除验证放在真实豆乳基质中进行，而非简化缓冲液体系，这使结论对食品工业具有直接参考价值。bcd和bkdAB双靶点策略使异戊酸降幅超过70%，同时不损害甚至提升纳豆激酶产量，说明异味消除与功能成分保留可以兼得。不过，敲除株在传代稳定性、大规模发酵中的表现以及食品安全性评估（如抗生素抗性标记的彻底清除）仍需进一步验证。未来若能在食品级菌株中采用无标记基因编辑技术实现同等效果，该策略的产业化前景将更为广阔。
参考来源
Wang J. Suppressing isovaleric acid off-flavor in Bacillus subtilis fermentation and its consequential effects on secondary metabolism. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134803
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134803