来源：Whole genome sequencing of the poly-γ-glutamic acid-producing novel Bacillus subtilis Tamang strain, isolated from spontaneously fermented kinema（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
Kinema 是喜马拉雅地区传统的大豆发酵食品，以其黏稠质地和鲜味深受喜爱。本研究从 175 株发酵 kinema 来源细菌中筛选出一株高产多聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）的枯草芽孢杆菌 Tamang 菌株，其 γ-PGA 分子量达 660 kDa，具备铁增溶、Caco-2 细胞铁蛋白保留及抗菌活性。全基因组测序揭示了 γ-PGA 生物合成基因簇 capBCA、多种功能基因及安全性特征，为食品级益生菌应用提供了基因组学依据。
研究背景
亚洲最古老的大豆发酵方式之一是生产具有黏稠质地和鲜味的自然发酵大豆食品。Kinema 是喜马拉雅地区 Gorkha 民族传统食用的代表性发酵大豆食品，富含多聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）、纤溶酶、B 族皂苷、生物活性肽和维生素。自然发酵 kinema 中微生物多样性复杂，芽孢杆菌门（Bacillota）最为丰富，其中枯草芽孢杆菌为优势菌种。γ-PGA 产生菌可分为谷氨酸依赖型和谷氨酸非依赖型两类。筛选谷氨酸非依赖型高产菌株可降低生产成本、简化发酵工艺。然而，从自然发酵 kinema 中分离的产 γ-PGA 枯草芽孢杆菌的基因组特征及其 γ-PGA 的结构、性质和生物合成尚未被系统评估。
研究方法
2.1 样品采集
从印度大吉岭山区和锡金邦不同当地蔬菜市场无菌采集 7 份新鲜制备的 kinema 样品，置于无菌容器中。样品立即运回实验室，4°C 保存。
【数据】样品数量：7 份；来源：印度大吉岭山区和锡金邦；保存温度：4°C
2.2 细菌分离
取 10 g kinema 样品与 90 mL 预灭菌生理盐水（0.85% NaCl；MB023-HiMedia，印度）混合，在 stomacher 实验室匀浆器（400，Seward，英国）中均质 5 分钟，随后进行系列稀释（10¹ 至 10¹⁰）。涂布前，稀释液在 100°C 加热 2 分钟以灭活营养细胞，然后涂布于营养琼脂（MM012，HiMedia，孟买，印度），37°C 培养 24 小时。对分离株进行细胞形态学和部分表型特征鉴定，并将培养物保存于 20% 甘油的 −20°C 条件下供后续分析。
【数据】样品量：10 g；稀释液：90 mL 0.85% NaCl；均质时间：5 min；稀释梯度：10¹–10¹⁰；热处理：100°C，2 min；培养基：营养琼脂；培养温度：37°C；培养时间：24 h；保存：20% 甘油，−20°C
2.3 谷氨酸依赖型与非依赖型培养基
参照 Zeng 等（2017）的方法并稍作修改，评估分离株对谷氨酸的依赖性。将新鲜培养的分离株接种于种子培养基，含葡萄糖（10 g/L）、酵母提取物（5 g/L）、胰蛋白胨（10 g/L）和 NaCl（10 g/L）。谷氨酸非依赖条件培养基含葡萄糖（25.0 g/L）、大豆蛋白胨（3.0 g/L）、NH₄NO₃（17.0 g/L）、NaCl（5.0 g/L）、K₂HPO₄（2.5 g/L）和 MgSO₄·7H₂O（1.0 g/L）。谷氨酸依赖条件培养基含葡萄糖（30.0 g/L）、酵母提取物（2.5 g/L）、L-谷氨酸（20.0 g/L）、KH₂PO₄（0.5 g/L）和 MgSO₄·7H₂O（0.1 g/L）。初始 pH 调至 7.0，分离株在 37°C 培养 24–48 小时。
【数据】种子培养基：葡萄糖 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、胰蛋白胨 10 g/L、NaCl 10 g/L；非依赖培养基：葡萄糖 25 g/L、大豆蛋白胨 3 g/L、NH₄NO₃ 17 g/L、NaCl 5 g/L、K₂HPO₄ 2.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 1 g/L；依赖培养基：葡萄糖 30 g/L、酵母提取物 2.5 g/L、L-谷氨酸 20 g/L、KH₂PO₄ 0.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L；pH：7.0；温度：37°C；时间：24–48 h
2.4 黏稠度测定
在谷氨酸非依赖培养基中新鲜培养的、推定产多聚谷氨酸的分离株，进一步在 phytone 琼脂（Nagai 等，1994）上 37°C 培养 24 小时。培养后，用无菌接种针拉起培养物表面，测量黏丝长度（厘米），以此确定培养物的黏稠度（Chettri 等，2016）。
【数据】培养基：phytone 琼脂；温度：37°C；时间：24 h；测定方法：接种针拉丝测长（cm）
2.5 黏度测定
选择黏丝长度 > 20 cm 的分离株，接种于新鲜配制的 PGA 肉汤（100 mL）中，成分包括：L-谷氨酸 5 g（GRM048，HiMedia，孟买，印度）、葡萄糖 5 g（MB037，HiMedia，孟买，印度）、Na₂HPO₄·12H₂O 0.1 g（Merck，孟买，印度）、KH₂PO₄ 0.1 g（Merck，孟买，印度）、MgSO₄·7H₂O 0.1 g（Merck，孟买，印度）、MnSO₄·H₂O 0.002 g（Merck，孟买，印度）、FeCl₃·6H₂O 0.005 g（Merck，孟买，印度）、CaCl₂ 0.02 g（Merck，孟买，印度）和生物素 50 µg（CMS095，HiMedia，孟买，印度），37°C 培养 72 小时（Tork 等，2015）。培养后，使用黏度计（DV1MRVTJ0，Brookfield AMETEK，美国马萨诸塞州）测定等分试样的动态黏度。
【数据】PGA 肉汤成分：L-谷氨酸 5 g/L、葡萄糖 5 g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 0.1 g/L、KH₂PO₄ 0.1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L、MnSO₄·H₂O 0.002 g/L、FeCl₃·6H₂O 0.005 g/L、CaCl₂ 0.02 g/L、生物素 50 µg/L；温度：37°C；时间：72 h；筛选标准：黏丝 > 20 cm
2.6 多聚-γ-谷氨酸的提取
Tamang 菌株在 PGA 培养基中新鲜培养，37°C 培养 72 小时用于 γ-PGA 提取（Pariyar 等，2022）。培养后，PGA 肉汤在 8000×g、4°C 离心 30 分钟，然后向上清液中加入冷甲醇（4:1），再次在 8000×g、4°C 离心 30 分钟。所得沉淀溶于蒸馏水，4°C 孵育过夜。随后，溶液在 −40°C 冻干至水分完全去除，获得粉末样品。γ-PGA 于 −20°C 保存备用。商业标准 PGA（P4886，Sigma-Aldrich，美国密苏里州）作为对照。
【数据】培养温度：37°C；培养时间：72 h；离心：8000×g，30 min，4°C（两次）；甲醇比例：4:1；冻干温度：−40°C；保存温度：−20°C；对照：Sigma-Aldrich P4886
2.7 FTIR 和 ¹H NMR 波谱分析
使用 Spectrum X（Perkin Elmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）在 4000–500 cm⁻¹ 频率范围内对 Tamang 菌株提取的 γ-PGA 进行傅里叶变换红外光谱（FTIR）测量。干涉图检测合成多聚谷氨酸提取物的官能团并确定图形结果的峰值（Mohanraj 等，2019）。使用 FT-NMR（Bruker Advance-II 400 MHz）通过质子（¹H）-NMR 谱和碳（¹³C）-NMR 谱测量对 Tamang 菌株的 γ-PGA 进行核磁共振（NMR）分析。样品溶于 D₂O 溶剂，化学位移以百万分之一（ppm）表示，TMS（四甲基硅烷）作为内标（Radu 等，2008）。
【数据】FTIR 范围：4000–500 cm⁻¹；NMR 仪器：Bruker Advance-II 400 MHz；溶剂：D₂O；内标：TMS
2.8 分子量分析和圆二色谱（CD）光谱
将 Tamang 菌株的沉淀 γ-PGA 溶于水，对 10 mmol/L PBS（磷酸盐缓冲液）缓冲液（pH 7.5）透析。透析后，溶液通过连接 HPLC（高效液相色谱）系统（Model 1100，Agilent，美国）的 TSKgel G4000 SWXL 柱（Sigma Chemical Co.，印度班加罗尔）进行凝胶过滤色谱分析。柱子用 PBS 缓冲液平衡并洗脱。10 μg 蛋白质以 1 mL/min 流速按大小分级分离，洗脱过程在 210 nm 监测。甲状腺球蛋白（660 kDa，Amersham Biosciences，英国）作为分子量测定的参考标准，与样品在相同条件下运行（Pariyar 等，2022）。此外，使用圆二色谱（CD）分光偏振计（JASCO-810）在 1 mm 比色皿中、0.2 nm 间隔、25°C 条件下进行测量（Park 等，2011）。
【数据】透析：10 mmol/L PBS，pH 7.5；色谱柱：TSKgel G4000 SWXL；流速：1 mL/min；上样量：10 μg；检测波长：210 nm；标准品：甲状腺球蛋白 660 kDa；CD 条件：1 mm 比色皿，0.2 nm 间隔，25°C
2.9 γ-PGA 的铁增溶、Caco-2 细胞铁影响及抗菌测定
Tamang 菌株提取的 γ-PGA 铁增溶试验按照 Palika 等（2015）描述的方法进行。简要步骤：10 µL 10 mM 铁与 50 µL γ-PGA 混合，孵育 10 分钟。向混合物中加入 440 µL 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲液，37°C 孵育 30 分钟。随后，混合物在 8000×g、4°C 离心 15 分钟。离心后，取 200 µL 上清液转移至 96 孔板。200 µL 蛋白质沉淀剂溶液与 200 µL 红菲绕啉二磺酸盐（BPDS）混合，室温孵育 10 分钟，使用分光光度计在 540 nm 测定光密度（OD）。
Tamang 菌株提取的 γ-PGA 在 Cancer coli-2（Caco-2）细胞系（HTB-37）中测试铁蛋白保留能力。该细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），实验按照 Palika 等（2015）的方法进行。简要步骤：细胞在含 10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）和 1%（v/v）抗生素-抗真菌混合物的 MEM（最低必需培养基）中培养，置于 6 孔板中，37°C、95% 湿度和 5% CO₂ 条件下。培养基每隔一天更换，细胞在 70–80% 融合时传代。实验使用接种后 21 天的细胞进行自发分化。细胞补充 5 μg γ-PGA 以评估其铁吸收能力。之后，对照组和 γ-PGA 补充组均用 10 µL 铁处理，比较其对铁吸收的影响。随后，使用铁蛋白试剂盒（EIA-1872，DRG International Inc.，美国）定量测定人血清中的铁蛋白水平，并使用 BioTek Synergy H1 多功能读板仪（BioTek Instruments Inc.，Winooski，佛蒙特州，美国）在 450 nm 记录读数。
Tamang 菌株提取的 γ-PGA 的抗菌活性（150 mg/mL）和 MIC（最低抑菌浓度）采用孔扩散法（Ajayeoba 等，2019）对以下菌株进行：鼠伤寒沙门氏菌（微生物典型培养物保藏中心，昌迪加尔，MTCC 3224）、沙门氏菌属（MTCC 1162）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、大肠杆菌（ATCC 25922）、蜡状芽孢杆菌（ATCC 10876）和金黄色葡萄球菌（ATCC 700699）。
【数据】铁增溶：10 µL 10 mM 铁 + 50 µL γ-PGA，孵育 10 min；MES 缓冲液 440 µL，37°C，30 min；离心 8000×g，15 min，4°C；BPDS 反应室温 10 min；OD 测定 540 nm。细胞实验：MEM + 10% FBS + 1% 抗生素，37°C，95% 湿度，5% CO₂；γ-PGA 补充量 5 μg；铁处理 10 µL；铁蛋白测定 450 nm。抗菌：浓度 150 mg/mL；测试菌株 6 种
2.10 全基因组特征分析
#### 2.10.1 DNA 提取
（原文节选至此，后续步骤原文未详述）
【数据】原文未详述
研究结果
从印度大吉岭山区和锡金邦各当地市场采集的 7 份 kinema 样品中共分离出 175 株细菌，检测其在含或不含谷氨酸的培养基中的生长情况。其中仅 48 株能在谷氨酸非依赖培养基中生长。对所有 48 株谷氨酸非依赖生长分离株进行高黏稠度（> 20 cm）和高黏度（> 30 cP）筛选，其中 Tamang 分离株表现出最高的黏稠度 28.33 ± 0.58 cm 和黏度 37.67 ± 0.58 cP。基于最高的黏稠度和黏度产生能力，Tamang 分离株首先进行形态学和表型特征鉴定（数据未显示），并使用 16S rRNA 基因测序分析进行物种鉴定。该分离株被鉴定为枯草芽孢杆菌 Tamang 菌株，与 NCBI 数据库中参考菌株的相似性指数为 99.94%（图 1a）。TEM 分析显示 B. subtilis Tamang 呈圆柱形杆状细胞形态，长度为 1.68 µm，宽度为 0.51 µm（图 1b）。
【数据】分离菌株总数：175 株；谷氨酸非依赖生长：48 株；Tamang 菌株黏稠度：28.33 ± 0.58 cm；黏度：37.67 ± 0.58 cP；16S rRNA 相似性：99.94%；细胞尺寸：长 1.68 µm，宽 0.51 µm
3.1 提取 γ-PGA 的 FTIR 光谱和 ¹H NMR 波谱分析
B. subtilis Tamang 提取的 γ-PGA 的 FTIR 光谱显示存在谷氨酸的羧基、羟基、羰基和酰胺基团，其中 O–H 伸缩带在 3418 cm⁻¹，酰胺 N–H 带在 1629 cm⁻¹，C=O 伸缩带在 1402 cm⁻¹，C–N 伸缩带在 1045 cm⁻¹（图 2a）。提取的 γ-PGA 中观察到的 NMR 化学位移与标准 PGA 化合物的峰位置高度一致。γ-PGA 的质子（¹H）和碳（¹³C）NMR 谱在相同条件下显示出与标准 PGA 观察到的峰相对应的峰。¹H NMR 谱中检测到的化学位移为：α-CH 4.10 ppm，β-CH₂ 2.87 ppm 和 2.62 ppm，γ-CH₂ 3.67 ppm 和 3.60 ppm（图 2b）。PGA 的碳-13（¹³C）NMR 谱中观察到的化学位移为：α-CH₂ 65.19 ppm，β-CH₂ 39.92 ppm，γ-CH₂ 41.38 ppm，CO 基团 181.33 ppm，COO 基团 184.54 ppm（图 2b）。
【数据】FTIR 吸收峰：3418 cm⁻¹（O–H）、1629 cm⁻¹（酰胺 N–H）、1402 cm⁻¹（C=O）、1045 cm⁻¹（C–N）；¹H NMR 化学位移：α-CH 4.10 ppm、β-CH₂ 2.87/2.62 ppm、γ-CH₂ 3.67/3.60 ppm；¹³C NMR 化学位移：α-CH₂ 65.19 ppm、β-CH₂ 39.92 ppm、γ-CH₂ 41.38 ppm、CO 181.33 ppm、COO 184.54 ppm
3.2 分子量分析和圆二色谱（CD）光谱
凝胶过滤色谱显示 B. subtilis Tamang 产生的 γ-PGA 在 5–6 分钟之间出现明显峰，与甲状腺球蛋白（MW = 660 kDa）和标准 PGA 的洗脱时间匹配，表明提取的生物聚合物（γ-PGA）具有高分子量（图 2c）。CD 光谱确认了 γ-PGA 的 α-螺旋二级结构，其在 200–245 nm 之间的光谱测量与标准 PGA 一致（图 2d）。
【数据】γ-PGA 洗脱时间：5–6 min；分子量：约 660 kDa（与甲状腺球蛋白对照）；CD 光谱范围：200–245 nm
3.3 γ-PGA 的铁增溶、Caco-2 细胞铁影响及抗菌测定
B. subtilis Tamang 产生的 γ-PGA 表现出铁增溶能力（1.33 μg），显著高于标准 PGA（表 1）。γ-PGA 还显示出良好的铁蛋白保留能力（6.5 ng/mg），表明其具有储存铁的潜力（表 1）。将 B. subtilis Tamang 分泌的 γ-PGA 与标准 PGA 在 150 mg/mL 浓度下的抗菌性能进行比较。基于抑菌圈，B. subtilis Tamang 分泌的 γ-PGA 对鼠伤寒沙门氏菌（MTCC 3224）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、大肠杆菌（ATCC 25922）、蜡状芽孢杆菌（ATCC 10876）、金黄色葡萄球菌（ATCC 700699）表现出略高的活性，而标准 PGA 对沙门氏菌属（MTCC 1162）具有更大的抑菌圈（表 1）。B. subtilis Tamang 分泌的 γ-PGA 对所有测试病原体还表现出 ≥ 37.5 mg/mL 的最低抑菌浓度（MIC）。而标准 PGA 对所有测试病原体的 MIC 浓度更高，但沙门氏菌属（MTCC 1162）和金黄色葡萄球菌（ATCC 700699）除外（表 1）。对蜡状芽孢杆菌（ATCC 10876）未观察到结果。
【数据】铁增溶：1.33 μg（Tamang γ-PGA）vs 标准 PGA（较低）；铁蛋白保留：6.5 ng/mg；抗菌浓度：150 mg/mL；MIC：≥ 37.5 mg/mL（对所有测试病原体）；测试菌株：6 种
3.4 枯草芽孢杆菌 Tamang 菌株基因组分析
#### 3.4.1 基因组质量
B. subtilis Tamang 的全基因组序列显示完整率为 99.59%，污染率为 0.23%。基因组总长度为 4,115,992 bp，组装成 167 个重叠群，基因组 GC（鸟嘌呤-胞嘧啶）含量为 43.2%（表 2）。特征总数为 4708 个，其中 4631 个被记录为编码序列（CDS）。预测的 CDS 显示存在 4 个 rRNA（1 个 23S rRNA、1 个 16S rRNA 和 2 个 5S rRNA）、1 个 tmRNA、73 个 tRNA 序列和 1569 个假设蛋白。未检测到质粒元件。从基因组中检测到 9 个插入元件，包括 2 个完整前噬菌体区域（> 90 分）、2 个可疑前噬菌体区域（70–90 分）和 5 个不完整前噬菌体区域（< 70 分）（表 2）。
【数据】基因组完整率：99.59%；污染率：0.23%；基因组长度：4,115,992 bp；重叠群：167 个；GC 含量：43.2%；CDS：4631 个；rRNA：4 个；tmRNA：1 个；tRNA：73 个；假设蛋白：1569 个；质粒：无；插入元件：9 个（2 完整、2 可疑、5 不完整）
3.5 预测功能
在 B. subtilis Tamang 基因组的预测功能注释中，检测到与代谢相关的基因占主导地位（77.64%），其次是遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、生物系统和人类疾病（图 3a）。在超级通路（第 2 级）中，全局和概览图谱（42.78%）、碳水化合物代谢（9.36%）和氨基酸代谢（6.88%）最为丰富（图 3b）。在亚通路第 3 级中，代谢通路（17.68%）和次级代谢产物生物合成（8.24%）显示出丰富的功能（图 3c）。COG 功能分类揭示了与碳水化合物运输和代谢、转录、氨基酸运输和代谢、翻译、核糖体结构和生物发生相关的基因（补充图 1）。使用预测功能分析中的 KO 模块生成了 B. subtilis Tamang 代谢通路的综合概览（补充图 2）。共检测到 12 种次级代谢产物（表 3a）、基因组中 3 个重复序列和属于 3 种 Cas 类型的 7 个 Cas 基因（表 3b）。次级代谢产物谱揭示了仅在 B. subtilis Tamang 基因组中检测到的三个关注区域，即 amyloliquecidin GF610、bogorol A 和 thermoactinoamide A，而这些次级代谢产物在 B. subtilis subsp. subtilis 168、B. subtilis subsp. natto VK161 和 B. subtilis subsp. subtilis MH-1 中未检测到（数据未显示）。
【数据】代谢相关基因：77.64%；全局和概览图谱：42.78%；碳水化合物代谢：9.36%；氨基酸代谢：6.88%；代谢通路：17.68%；次级代谢产物生物合成：8.24%；次级代谢产物：12 种；重复序列：3 个；Cas 基因：7 个（3 种 Cas 类型）
3.6 碳水化合物活性酶（CAZy）注释
B. subtilis Tamang 基因组中共揭示 132 种碳水化合物活性酶（CAZymes）（补充表 1）。这些酶分为 6 个不同类别，其中糖苷水解酶家族（41.67%）占比最高，其次是糖基转移酶、碳水化合物酯酶、碳水化合物结合模块、多糖和辅助活性家族（补充表 1）。
【数据】CAZymes 总数：132 种；类别：6 类；糖苷水解酶家族：41.67%
3.7 基因组比较和系统发育分析
将 B. subtilis Tamang 与从 NCBI 下载的 20 株 B. subtilis 代表性菌株进行基因组比较，共记录 11,002 个预测基因，其中 7465 个持久基因（存在于所有基因组中的基因）、2096 个壳基因（大多数基因组共享的基因）和 1441 个云基因（最少亚群共享或基因组间可变基因）（表 4）。代表性全基因组序列的基因组大小范围为 4,009,488 bp 至 4,350,274 bp，GC 含量为 43.2% 至 43.9%（表 4）。还使用 20 株 B. subtilis 代表性菌株构建了系统发育树（图 4），B. subtilis Tamang 与 20 个代表性基因组计算的平均核苷酸同一性（ANI）显示相似性指数范围为 97.94% 至 99.27%（表 4）。根据相似性指数，B. subtilis Tamang 菌株与豆制品中发现的菌株关系最密切，相似性超过 99%（表 4）。对 p……
【数据】比较基因组数：20 株；预测基因总数：11,002；持久基因：7465；壳基因：2096；云基因：1441；基因组大小范围：4,009,488–4,350,274 bp；GC 含量范围：43.2–43.9%；ANI 相似性范围：97.94–99.27%
3.8 基因组注释与功能基因
基因组注释显示 B. subtilis Tamang 含有多个与 γ-PGA 产生、纤溶活性、风味、生物活性肽产生、水解酶、维生素和氨基酸生物合成相关的生物标志基因（图 5）。γ-PGA 生物合成相关基因包括谷氨酸合酶（gltA、gltB、gltX）、谷氨酸消旋酶（racE）和 γ-PGA 合成酶复合物（capBCA）（图 6a）。图 6b 展示了 gltA、gltB、gltX、racE、capB、capC、capA 基因参与 γ-PGA 生物合成通路的示意。
【数据】γ-PGA 相关基因：gltA、gltB、gltX、racE、capB、capC、capA
3.9 益生菌与治疗相关基因
B. subtilis Tamang 基因组的环形基因组视图显示了多个与潜在治疗特性和健康益处相关的益生菌基因和功能基因（图 7）。基因组中还检测到 L-天冬酰胺酶产生基因（具有抗癌特性）以及 CRISPR-Cas 系统。未检测到毒力因子和抗菌素耐药基因，确认了 B. subtilis Tamang 作为食品级细菌的安全性。
【数据】毒力因子：未检出；抗菌素耐药基因：未检出；CRISPR-Cas 系统：检出；L-天冬酰胺酶基因：检出
讨论与解读
讨论
消费者高度偏好发酵大豆表面分泌的黏稠物质，这种物质即 γ-聚谷氨酸，由芽孢杆菌属在大豆自然发酵过程中产生。喜马拉雅地区居民同样偏爱具有黏稠质地和鲜味的 kinema。然而，从自然发酵 kinema 中分离的产 γ-PGA 枯草芽孢杆菌的基因组特征及其 γ-PGA 的结构、性质和生物合成此前尚未被评估。γ-PGA 产生菌分为谷氨酸依赖型和谷氨酸非依赖型两类。虽然大多数产 γ-PGA 的芽孢杆菌依赖谷氨酸，但部分菌株如 B. subtilis TAM-4、B. subtilis C1 和 B. subtilis 5E 不依赖谷氨酸。筛选谷氨酸非依赖型菌株的主要目的是在不额外补充谷氨酸的情况下，以更低成本和更简化的发酵工艺提高产量。本研究筛选出的 B. subtilis Tamang 菌株能够在谷氨酸非依赖条件下高产 γ-PGA，且基因组分析证实了其安全性。
编译者解读
本研究通过系统的表型筛选与全基因组测序相结合的策略，从传统发酵食品中发掘出一株兼具高产 γ-PGA、铁增溶、抗菌和潜在益生特性的食品级枯草芽孢杆菌。谷氨酸非依赖型的特性使其在工业化生产中具有显著成本优势。基因组层面未检出毒力因子和耐药基因，为其作为食品添加剂或益生菌开发奠定了安全性基础。值得注意的是，该菌株特有的次级代谢产物基因簇和 132 种 CAZymes 提示了更广泛的生物技术应用潜力。后续研究可聚焦于 γ-PGA 生物合成通路的代谢工程改造及体内功能验证。
参考来源
Tamang, J. P. (2024). Whole genome sequencing of the poly-γ-glutamic acid-producing novel Bacillus subtilis Tamang strain, isolated from spontaneously fermented kinema. Food Research International, 2024. DOI: 10.1016/j.foodres.2024.114655
DOI: 10.1016/j.foodres.2024.114655