来源：Enhanced lignocellulose degradation in Bacillus subtilis RLI2019 through CRISPR/Cas9-mediated chromosomal integration of ternary cellulase genes（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素是自然界最丰富的生物质资源，其高效降解依赖完整的纤维素酶系统。天然枯草芽孢杆菌的纤维素酶基因组成存在先天缺陷，缺乏外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶编码基因。本研究利用CRISPR/Cas9技术，将eglS、cel48S和bglS三个纤维素酶基因分别整合至枯草芽孢杆菌RLI2019染色体的aprE、epr和amyE位点，构建出工程菌株AEA3。该菌株的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和总纤维素酶活性分别提升3.1倍、6.6倍、3.0倍、1.2倍和1.8倍，并能有效降解农作物秸秆。
研究背景
枯草芽孢杆菌是公认安全（GRAS）的益生菌株，在食品加工、健康与化妆品生产、畜禽饲料发酵和生物燃料制造等工业应用中常被用作优良的底盘菌株。凭借其天然分泌纤维素酶的能力，枯草芽孢杆菌也是木质纤维素生物降解工业中的重要菌种。然而，研究发现枯草芽孢杆菌的天然纤维素酶系统并不完整——缺乏外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等编码基因，且内切葡聚糖酶基因仅为单拷贝表达，这限制了其高效破坏植物细胞壁纤维结晶结构的能力。此外，由于内切葡聚糖酶基因表达水平低，枯草芽孢杆菌168无法在纤维素上生长。
前期研究从黄胸散白蚁肠道中分离出枯草芽孢杆菌RLI2019，该菌株能有效降解小麦秸秆。全基因组测序分析显示，RLI2019含有8个纤维素代谢酶相关基因和9个半纤维素代谢酶相关基因，但未发现与任何已知外切葡聚糖酶家族同源的编码基因。因此，通过遗传工程实现纤维素酶基因的多拷贝表达或异源高效表达，成为克服这一缺陷的通用策略。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
大肠杆菌JM109（TAKARA，日本）用于质粒构建，经鉴定正确的质粒转化至大肠杆菌JM110（TAKARA，日本）进行去甲基化处理。野生型初始宿主菌株枯草芽孢杆菌RLI2019分离自黄胸散白蚁肠道。本研究使用的所有菌株和质粒列于表1。LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）或平板用于常规细菌培养。LC培养基（含1% CMC-Na的LB培养基）作为产酶培养基。除非另有说明，卡那霉素在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的浓度分别设为50 μg/mL和20 μg/mL。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）；产酶培养基：LC（含1% CMC-Na）；卡那霉素浓度：大肠杆菌50 μg/mL、枯草芽孢杆菌20 μg/mL
2.2 质粒构建与转化
CRISPR/Cas9基因敲除和敲入质粒的构建基于pJOE8999骨架，包含两个主要步骤：sgRNA序列的连接和同源修复臂的插入（图1A）。以eglS敲除质粒构建为例，使用在线工具CRISPROR（http://crispor.org）设计靶向eglS的sgRNA序列，在5′端添加含BsaI限制性酶切位点的互补碱基对，生成最终的sgRNA引物对（eglS-sg-F/R）。将10 μmol/L的eglS-sg-F/R引物各5 μL等体积混合，进行退火反应。退火产物使用DNA连接试剂盒（TAKARA，日本）连接至经BsaI消化的pJOE8999线性化载体，随后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞。转化细胞涂布于卡那霉素平板，次日挑取单菌落，使用引物对JOE-sg-F/R进行菌落PCR验证。阳性菌落确认含有重组质粒pJOE-sgRNA。
接下来，以枯草芽孢杆菌RLI2019基因组DNA为模板，分别使用引物对eglS-UF/UR和eglS-DF/DR扩增上下游同源臂片段。这些同源臂使用无缝克隆方法，按照One-Step PCR Cloning Kit（Novoprotein，中国）说明书连接至经SalI和XbaI（Promega，美国）消化的pJOE-sgRNA线性化质粒。重组质粒转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，使用引物对JOE-TYB-F/R通过菌落PCR筛选单菌落。阳性克隆送至Sangon Biotech（中国）进行Sanger测序进一步验证。最终获得CRISPR/Cas9敲除质粒pJOE-KO1。为去除甲基化，将pJOE-KO1转化至大肠杆菌JM110感受态细胞。使用SanPrep柱式质粒小提试剂盒（Sangon Biotech，中国）提取目标质粒，随后用于转化枯草芽孢杆菌进行eglS基因敲除。
其他CRISPR/Cas9敲除和敲入质粒的构建遵循相同流程，区别在于敲入质粒需将目标基因序列无缝插入上下游同源臂之间。所有引物详细信息见补充材料表S1。枯草芽孢杆菌化学感受态细胞按照Spizizen方法制备。质粒转化和去除按照Altenbuchner方法进行。简要流程为：将质粒转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞后，涂布于含0.2%甘露糖（Sigma-Aldrich，美国）和卡那霉素的平板。通过菌落PCR鉴定预期阳性菌落，随后在50°C、220 rpm条件下过夜培养以去除质粒。去除质粒的菌株可作为下一轮基因编辑的宿主。
【数据】sgRNA设计工具：CRISPROR；退火反应：10 μmol/L引物各5 μL；连接酶：DNA Ligation Kit（TAKARA）；限制酶：BsaI、SalI、XbaI；感受态制备：Spizizen法；质粒去除：50°C、220 rpm过夜；甘露糖浓度：0.2%
2.3 优化cel48S的表达评估
cel48S的原始序列从NCBI数据库下载（Gene ID: 35805096），根据表达宿主枯草芽孢杆菌的密码子偏好性进行密码子优化。优化后的序列提交至GenScript Biotech（中国）进行基因合成。含C端His标签的优化cel48S亚克隆至表达载体（pT7M）的NdeI和HindIII限制性酶切位点。随后，重组载体转化至枯草芽孢杆菌7024E进行诱导表达。挑取正确的单菌落，接种至4 mL含四环素的LB培养基中，在37°C、220 rpm摇床中培养。当OD600值达到0.6至0.8之间时，加入IPTG使终浓度达到2%木糖，分别在25°C诱导16小时和37°C诱导4小时。收集上清液、全细胞裂解液和细胞裂解沉淀样品，通过SDS-PAGE和western blot检测蛋白表达。Cel48S表达评估由GenScript Biotech（中国）完成。
【数据】cel48S基因ID：35805096；表达载体：pT7M；限制酶：NdeI、HindIII；诱导条件：OD600 0.6-0.8时加入IPTG至2%木糖；25°C 16h、37°C 4h；培养基：4 mL含四环素的LB
2.4 酶活性测定与总蛋白浓度测定
将枯草芽孢杆菌接种至LC培养基，在37°C、220 rpm条件下培养24小时，随后在4°C、10,000 rpm离心15分钟收集上清液和菌体沉淀。上清液即为粗酶液，用于测定内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和总纤维素酶活性（以滤纸酶活法FPA测定）。详细操作步骤参照前期研究。外切葡聚糖酶活性测定采用微量稀释法，与β-葡萄糖苷酶测定方法相同，区别在于反应底物替换为1 mg/mL的pNPC溶液。使用多功能酶标仪（Bio Tek Instruments，美国）在540 nm处测定吸光度。酶活单位（U/mL）定义为每分钟每毫升产生1 μmol还原糖（葡萄糖、木糖或对硝基苯酚）所需的酶量。菌株的纤维素降解能力通过CMC-Na平板上水解圈的大小（刚果红染色）来测定。收集的粗酶液总蛋白浓度使用Bradford蛋白检测试剂盒（TIANGEN，中国）测定。具体而言，以牛血清白蛋白（BSA，1 mg/mL）溶液作为标准品，按照制造商说明书操作。
【数据】培养条件：LC培养基、37°C、220 rpm、24h；离心：4°C、10,000 rpm、15min；外切葡聚糖酶底物：1 mg/mL pNPC；检测波长：540nm；蛋白标准品：BSA 1 mg/mL
2.5 最佳纤维素酶基因整合位点的评估
枯草芽孢杆菌RLI2019的完整基因组序列已提交至GenBank数据库，登录号为NZ_CP123621，eglS和bglS的位点标签分别为OU418_09655和OU418_20835。设计合适的引物，以枯草芽孢杆菌RLI2019基因组为模板直接扩增eglS和bglS的插入片段。优化的cel48S为人工合成，可作为扩增模板。为确保纤维素酶的胞外分泌，选择枯草芽孢杆菌RLI2019染色体上的胞外酶基因作为目标整合位点，如淀粉酶基因（amyE）和蛋白酶基因（aprE、nprE、wprA、epr、bpr、nprB）。pJOE8999衍生的敲入质粒精确定位至这些位点，实现纤维素酶基因的染色体整合。值得注意的是，目标基因的原始启动子和信号肽被保留，仅将目标基因的成熟肽序列分别替换为eglS、bglS和cel48S。测定工程菌株的纤维素酶活性，根据酶活性筛选最佳整合位点。
【数据】GenBank登录号：NZ_CP123621；eglS位点标签：OU418_09655；bglS位点标签：OU418_20835；整合位点：amyE、aprE、nprE、wprA、epr、bpr、nprB
2.6 多基因组位点的纤维素酶基因整合
基于筛选出的最佳整合位点，在枯草芽孢杆菌RLI2019染色体上依次整合多个纤维素酶基因表达盒。以已构建的工程菌株为宿主，进行下一轮基因编辑，逐步将eglS、cel48S和bglS整合至不同位点。每轮编辑后均通过菌落PCR验证基因的正确插入，并测定相应的纤维素酶活性。最终构建同时表达三种纤维素酶基因的工程菌株。
【数据】整合策略：逐轮编辑、多基因共表达；验证方法：菌落PCR
2.7 秸秆降解与酶解糖化
将工程菌株接种至含农作物秸秆的发酵培养基中，在适宜条件下进行固态或液态发酵。发酵结束后，收集发酵产物，测定还原糖含量和纤维素酶活性。采用范氏（Van Soest）洗涤纤维分析法测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量，计算半纤维素和木质素含量变化。利用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察发酵前后秸秆的表面结构变化。采用X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析秸秆纤维素的结晶度和化学结构变化。
【数据】发酵底物：农作物秸秆；分析指标：还原糖、NDF、ADF、半纤维素、木质素；表征手段：FE-SEM、XRD、FTIR
研究结果
3.1 内源eglS和bglS及外源cel48S的功能验证
在枯草芽孢杆菌RLI2019的全基因组序列分析中，功能注释将eglS鉴定为内切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4），将bglS鉴定为内切-β-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.6或EC 3.2.1.73）。研究进一步在大肠杆菌BL21（DE3）中对eglS和bglS进行了异源表征，检测到显著的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性。本研究通过敲除实验验证eglS和bglS是否为枯草芽孢杆菌RLI2019中与纤维素酶活性相关的主要功能基因。
如图1B所示，eglS的敲除导致内切葡聚糖酶活性几乎检测不到，木聚糖酶活性极显著下降。此外，bglS的敲除导致β-葡萄糖苷酶活性从1.92 U/mL降至0.70 U/mL（图1C）。EglS作为高活性内切葡聚糖酶的异源表征已被广泛验证。近期研究也表明，来自枯草芽孢杆菌1AJ3的BglS具有高β-糖苷酶活性。本研究结果与前期报道一致——基因敲除后酶活性的丧失证实eglS和bglS是枯草芽孢杆菌RLI2019中与纤维素酶活性直接相关的功能基因。因此，eglS和bglS被视为后续染色体整合以增强纤维素酶活性的候选基因。
来自嗜热梭菌的Cel48S已被鉴定为纤维小体中的主要外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.176）。SDS-PAGE和western blot结果显示，在上清液和细胞裂解液样品中均观察到预期大小的Cel48S蛋白条带（约85 kDa），证明优化的cel48S能在枯草芽孢杆菌中表达和分泌（图1D）。在前期研究中，cel48S基因在大肠杆菌BL21（DE3）中经诱导表达，产生了显著的外切葡聚糖酶活性。类似地，Arsov等人报道，在贝莱斯芽孢杆菌中异源表达含cel48S的重组载体增强了菌株的纤维素分解能力。因此，引入cel48S来优化枯草芽孢杆菌的纤维素酶系统在理论上可行，尤其有助于提高外切葡聚糖酶活性。
【数据】eglS敲除后：内切葡聚糖酶活性几乎检测不到；bglS敲除后：β-葡萄糖苷酶活性从1.92 U/mL降至0.70 U/mL；Cel48S蛋白大小：约85 kDa
3.2 eglS、cel48S和bglS染色体整合位点的优化
选择多个染色体位点进行eglS基因组整合，以增强枯草芽孢杆菌RLI2019的内切葡聚糖酶活性。选取4个酶基因（amyE、epr、nprE和aprE）作为靶向敲入位置，根据酶活性筛选eglS的最佳插入位点（图2A）。菌落PCR确认了eglS的正确插入（图2B）。此外，枯草芽孢杆菌RLI2019-KI02（Δepr::eglS）和枯草芽孢杆菌RLI2019-KI04（ΔaprE::eglS）的内切葡聚糖酶活性分别是枯草芽孢杆菌RLI2019的1.33倍和2.60倍（图2B）。各工程菌株的生长曲线基本一致，但枯草芽孢杆菌RLI2019-KI03（ΔnprE::eglS）在24小时时的细胞密度显著下降（图3A）。
前期研究已证实不同基因组整合位点存在基因表达差异，这直接影响异源蛋白的表达效率。因此，为不同目标基因匹配适当的整合位点十分必要。本研究中，枯草芽孢杆菌RLI2019-KI04表现出最高的内切葡聚糖酶活性（23.73 U/mL），这可归因于总蛋白浓度的显著增加（图3B）。因此，aprE被确定为后续eglS整合的最佳位点。
与eglS在不同位点整合的位置效应类似，将bglS整合至amyE、bpr、nprB和wprA位点，并测定工程菌株的β-葡萄糖苷酶活性（图2C）。令人兴奋的是，四个位点的基因组整合均显著增强了β-葡萄糖苷酶活性（图2D）。值得注意的是，枯草芽孢杆菌RLI2019-KI06（Δbpr::bglS）表现出最高的β-葡萄糖苷酶活性（7.36 U/mL），是枯草芽孢杆菌RLI2019的4.46倍。各工程菌株的生长曲线基本一致，但枯草芽孢杆菌RLI2019-KI07（ΔnprB::bglS）在24小时时的细胞密度显著下降（图3C）。枯草芽孢杆菌RLI2019-KI05、KI06和KI08的总蛋白浓度也显著高于枯草芽孢杆菌RLI2019（图3D）。
将目标基因插入枯草芽孢杆菌中带分泌信号肽的胞外蛋白酶、淀粉酶和非必需基因位点，是促进异源酶蛋白分泌和表达的理想方法。Song等人利用CRISPR/Cas9技术将两拷贝紫穗槐二烯合酶整合至枯草芽孢杆菌的amyE和mpr位点，从而提高了紫穗槐二烯的产量。Ren等人将三拷贝β-半乳糖苷酶整合至枯草芽孢杆菌的bpr、epr和amyE位点，观察到总酶活和胞外酶活均有所增加。本研究中，内源eglS和bglS在枯草芽孢杆菌RLI2019染色体上的敲入实质上增加了基因表达拷贝数，因此纤维素酶活性的提升在意料之中。
由于枯草芽孢杆菌RLI2019缺乏天然外切葡聚糖酶基因，将密码子优化的cel48S成熟肽序列插入基因组以弥补这一缺陷（图2E）。尽管仅在amyE和epr两个位点进行了评估，枯草芽孢杆菌RLI2019-KI09（ΔamyE::cel48S）和KI10（Δepr::cel48S）均表现出显著升高的外切葡聚糖酶活性（图2F）。值得注意的是，枯草芽孢杆菌RLI2019-KI10表现出最高的外切葡聚糖酶活性（2.68 U/mL），是宿主菌株的2.46倍，展示了通过基因组整合实现异源外切葡聚糖酶基因高效表达的潜力。此外，cel48S的整合不影响生长曲线和24小时时的细胞密度（图3E），但导致总蛋白浓度显著降低（图3F）。前期研究也通过芽孢杆菌中表达cel48S的质粒实现了纤维素酶的胞外分泌。本研究的基因组整合策略确保了异源遗传信息在染色体上的更稳定维持，有利于工程菌株保持高酶生产能力。
【数据】eglS整合：KI02（Δepr）为野生型1.33倍、KI04（ΔaprE）为野生型2.60倍；KI04最高内切葡聚糖酶活性：23.73 U/mL；bglS整合：KI06（Δbpr）最高β-葡萄糖苷酶活性7.36 U/mL，为野生型4.46倍；cel48S整合：KI10（Δepr）最高外切葡聚糖酶活性2.68 U/mL，为野生型2.46倍
3.3 多模块基因组整合eglS、cel48S和bglS以增强纤维素酶活性
#### 3.3.1 双纤维素酶基因共表达工程菌株的构建
为确定增加基因拷贝数是否能提升纤维素酶活性，在枯草芽孢杆菌RLI2019-KI04的基础上，将额外的eglS表达盒整合至epr位点，构建了含两个表达盒的整合菌株（枯草芽孢杆菌RLI2019-KI11），并通过菌落PCR确认（图S1A）。遗憾的是，预期中内切葡聚糖酶活性的显著增加并未出现。相反，枯草芽孢杆菌RLI2019-KI11的酶活性有所下降，但仍保持为枯草芽孢杆菌RLI2019的2.38倍（图S2A）。同时，虽然观察到枯草芽孢杆菌RLI2019-KI11在24小时时的细胞密度显著下降（图S2B），但总蛋白浓度保持稳定（图S2C）。
类似地，研究尝试构建携带两个bglS和cel48S表达盒的工程菌株。然而，出于未知原因，在当前实验条件下这种基因组整合未获成功。细菌中的代谢通量平衡对于优化目标产物产量至关重要。理论上，增加基因拷贝数有利于促进高表达水平，但也可能带来代谢失衡的负面效应。
【数据】KI11（双eglS拷贝）：内切葡聚糖酶活性为野生型2.38倍；24h细胞密度显著下降；总蛋白浓度稳定
#### 3.3.2 三纤维素酶基因共表达工程菌株AEA3的构建与表征
基于上述单基因整合的优化结果，依次将eglS整合至aprE位点、cel48S整合至epr位点、bglS整合至amyE位点，构建了三基因共表达工程菌株枯草芽孢杆菌AEA3（图4A）。菌落PCR验证了三个基因的正确整合（图4B）。CMC-Na平板刚果红染色显示，AEA3菌株产生明显的水解圈（图4C），表明其具有较强的纤维素降解能力。
酶活性分析表明，与野生型菌株相比，枯草芽孢杆菌AEA3的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和总纤维素酶活性分别提高了3.1倍、6.6倍、3.0倍、1.2倍和1.8倍，分别达到26.31 U/mL、9.77 U/mL、3.91 U/mL、19.63 U/mL和2.42 U/mL（图4D）。生长曲线显示，AEA3与野生型菌株的生长特性基本一致（图4E），24小时时的细胞密度无显著差异（图4F）。
【数据】AEA3酶活：内切葡聚糖酶26.31 U/mL（3.1倍）、外切葡聚糖酶9.77 U/mL（6.6倍）、β-葡萄糖苷酶3.91 U/mL（3.0倍）、木聚糖酶19.63 U/mL（1.2倍）、总纤维素酶2.42 U/mL（1.8倍）
3.4 工程菌株AEA3对农作物秸秆的降解效果
#### 3.4.1 发酵秸秆的还原糖含量与内切葡聚糖酶活性
将枯草芽孢杆菌AEA3接种至含农作物秸秆的发酵培养基中进行发酵，测定发酵产物的还原糖含量和内切葡聚糖酶活性。如图5所示，与未处理对照组和野生型菌株处理组相比，AEA3处理组的还原糖含量显著提高（图5A），内切葡聚糖酶活性也显著高于其他组（图5B）。所有实验均设三组重复（n=3），*表示差异显著。
【数据】实验重复：n=3；还原糖含量：AEA3组显著高于对照组和WT组；内切葡聚糖酶活性：AEA3组显著高于对照组和WT组
#### 3.4.2 不同农作物秸秆的降解效率
采用范氏洗涤纤维分析法测定了发酵后秸秆的中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、半纤维素和木质素含量。如图6所示，与对照组和野生型菌株处理组相比，AEA3处理组的NDF含量（图6A）、ADF含量（图6B）、半纤维素含量（图6C）和木质素含量（图6D）均显著降低。这表明工程菌株AEA3能有效破坏植物细胞壁的纤维结构，促进木质纤维素的降解。
【数据】NDF含量：AEA3组显著低于对照组和WT组；ADF含量：AEA3组显著降低；半纤维素含量：AEA3组显著降低；木质素含量：AEA3组显著降低
#### 3.4.3 秸秆表面结构的FE-SEM观察
利用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）在10,000倍放大倍数下观察了发酵7天后秸秆的表面结构变化。如图7所示，未处理对照组的秸秆表面结构完整、光滑致密；野生型菌株处理组的秸秆表面出现一定程度的破损；而AEA3处理组的秸秆表面结构被严重破坏，纤维束松散、表面粗糙，显示出明显的降解痕迹。这直观地证明了工程菌株AEA3对秸秆纤维结构的强效降解能力。
【数据】放大倍数：10,000×；发酵时间：7天；表面结构：AEA3组纤维束松散、表面粗糙
#### 3.4.4 秸秆的XRD和FTIR分析
采用X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）对发酵后的秸秆进行了分析。XRD图谱（图8A）显示，AEA3处理组秸秆的纤维素结晶度发生显著变化，右上角嵌入表格展示了纤维素结晶度的量化值。FTIR光谱（图8B）显示，AEA3处理组在纤维素和半纤维素相关特征吸收峰处的强度发生明显变化，表明纤维素的化学结构被有效破坏。
【数据】XRD：AEA3组纤维素结晶度显著变化；FTIR：AEA3组纤维素和半纤维素特征峰强度明显变化
讨论与解读
本研究通过CRISPR/Cas9介导的多基因整合策略，显著增强了枯草芽孢杆菌RLI2019的纤维素降解能力。eglS、cel48S和bglS被依次插入枯草芽孢杆菌RLI2019的aprE、epr和amyE位点，获得了理想的工程菌株枯草芽孢杆菌AEA3。该菌株能够高效降解农作物秸秆产生单糖。纤维素酶基因的多拷贝染色体表达为工程化枯草芽孢杆菌应对木质纤维素降解挑战提供了基础框架。这一工程策略可推广至其他工业微生物，有望促进木质纤维素生物质降解中的微生物预处理。然而，未来的工作应继续聚焦于表达元件的优化（如启动子、RBS和信号肽筛选）以及工业发酵工艺的强化，以将实验室成果转化为可放大的生物过程。
编译者解读
本研究展示了CRISPR/Cas9多轮基因组编辑在工业底盘菌株改造中的系统化应用——从单基因整合位点筛选到三基因逐步叠加，逻辑严谨、层次分明。选择染色体整合而非质粒表达的策略，确保了异源基因在传代中的稳定遗传，这对工业化放大尤为重要。值得注意的是，双拷贝eglS整合并未带来预期的酶活叠加效应，反而出现下降，提示代谢负担与基因拷贝数之间存在非线性关系，这一反直觉现象对合成生物学中的多基因表达设计具有警示意义。未来若能在启动子工程和分泌途径优化上进一步突破，AEA3菌株在生物质转化领域的应用潜力将更加可观。
参考来源
Liu G. Enhanced lignocellulose degradation in Bacillus subtilis RLI2019 through CRISPR/Cas9-mediated chromosomal integration of ternary cellulase genes. International Journal of Biological Macromolecules, 2025. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.141727
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.141727