来源：Construction of an antibiotic marker-free Bacillus subtilis host via genome editing and secretion of a hyperthermostable β-galactosidase through signal peptides screening（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
β-半乳糖苷酶是低乳糖牛奶生产的关键酶，但多数商业酶为常温酶，难以耐受70°C以上的高温灭菌工艺。本研究利用CRISPR-Cpf1系统对高分泌型枯草芽孢杆菌WB800进行无痕基因编辑，敲除3个抗生素抗性基因（ble、hyg、bsr），构建了食品级安全宿主BS801。在此基础上，通过筛选10个Sec通路信号肽，实现了来源于激烈火球菌的超耐热β-半乳糖苷酶BgaS的分泌表达。其中，来源于DacB蛋白的信号肽分泌效率最高，胞外酶活达0.42 U/mL。该酶在90°C、pH 7.0条件下4小时内可将生乳中乳糖水解率提升至92.64%，展现出良好的乳品工业应用潜力。
研究背景
β-半乳糖苷酶在乳品工业中用于生产低乳糖牛奶。然而，多数市售β-半乳糖苷酶为常温酶，最适反应温度在35至70°C之间，无法耐受70°C以上的高温灭菌工艺。这意味着酶必须在牛奶冷却后才能加入反应，增加了工业生产中微生物污染的风险。另一策略是使用冷适应乳糖酶在低温下降解乳糖，但该方法需要在不同步骤分别进行巴氏杀菌和乳糖水解，工艺更为复杂。此外，许多商业β-半乳糖苷酶的最适pH偏酸，与牛奶近中性的pH环境不兼容。
来自激烈火球菌的β-半乳糖苷酶BgaS因其高热稳定性而受到关注——其最适反应温度达90°C以上，在80°C孵育4小时后仍保留超过80%的酶活，最适pH为7.0，与牛奶pH高度匹配。然而，BgaS在非食品级系统中的异源表达限制了其应用，其分泌表达研究也尚不充分。本研究旨在构建食品级枯草芽孢杆菌宿主，并通过信号肽筛选实现BgaS的高效分泌表达。
研究方法
2.1 菌株、质粒与材料
本研究所用质粒、菌株及引物列于表S1。质粒pMA5-Lip和pMA5-MCS为本实验室前期构建并保存。枯草芽孢杆菌WB800由本实验室保存，其衍生菌株为本研究构建。用于BgaS异源表达及信号肽筛选的质粒pXHD1.1及其衍生质粒为本研究构建。CRISPR-Cpf1系统中用于Cpf1蛋白表达的质粒pHT-XCR6及用于构建含crRNA序列和同源臂的重组质粒pcrF11购自南京MolecularCloud公司。pcrF11衍生质粒为本研究构建。乳糖水解实验所用牛奶为无锡当地牧场的鲜奶。LB培养基及蛋白纯化所用试剂购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。限制性内切酶购自上海生工生物工程股份有限公司。邻硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（ONPG）购自阿拉丁生化科技股份有限公司（上海）。其余试剂均为分析纯级。
【数据】菌株：Bacillus subtilis WB800；质粒：pMA5-Lip、pMA5-MCS、pXHD1.1、pHT-XCR6、pcrF11；试剂来源：国药集团、生工生物、阿拉丁；牛奶来源：无锡当地牧场鲜奶
2.2 CRISPR-Cpf1辅助的多抗性标记删除
在CRISPR-Cpf1系统中，Cpf1蛋白与crRNA形成的复合物能够识别并结合靶基因，切割DNA产生双链断裂（DSB），随后通过同源重组修复断裂DNA，实现基因敲除。三个抗性标记的crRNA序列列于表1。选取抗性标记周围的DNA序列（各500至1000 bp）作为同源臂，由生工生物（上海）合成。
首先将质粒pHT-XCR6转化至枯草芽孢杆菌WB800中，获得WB800(pHT-XCR6)。随后，将三个用于敲除ble、hyg和bsr基因的pcrF11衍生质粒——pcrF11-ble-del、pcrF11-hyg-del和pcrF11-bsr-del——依次转化至WB800(pHT-XCR6)中。具体而言，先转化pcrF11-ble-del生成WB800-Δ1（ble基因缺失）；再将pcrF11-hyg-del转化至WB800-Δ1生成WB800-Δ2（ble和hyg基因均缺失）；最后将pcrF11-bsr-del转化至WB800-Δ2生成WB800-Δ3（ble、hyg和bsr基因全部缺失）。
本研究考察了后培养（post-culture）对CRISPR-Cpf1基因编辑效率的影响。后培养是指在双质粒导入宿主细胞后，在适当的诱导条件下进行的额外培养步骤。其核心功能是充分确保Cpf1蛋白与crRNA的二元复合物与基因组靶位点的有效接触，被认为能够影响CRISPR-Cpf1基因编辑系统的编辑效率（So et al., 2017）。具体方法为：将含crRNA的质粒导入重组菌株WB800(pHT-XCR6)后，一半细胞直接涂布于选择性平板。其余细胞在含30 g/L木糖、0.05 mg/mL卡那霉素和0.05 mg/mL氯霉素的液体LB培养基中、30°C条件下后培养8小时，然后涂布于选择性平板。随机选取一定数量的转化子进行菌落PCR验证。通过比较两组平板上阳性克隆的比例，计算后培养对基因编辑效率的影响。克隆经DNA测序验证基因敲除成功与否。
验证后，将细胞接种至含0.005%十二烷基硫酸钠（SDS）的LB培养基中消除质粒pcrF-gene-del和pHT-XCR6（Paul et al., 2020）。为消除质粒pcrF-gene-del，将WB800-Δ1、WB800-Δ2和WB800-Δ3的培养物在含SDS的LB液体培养基中、37°C、220 rpm过夜培养后，划线于含氯霉素的LB平板。随后挑取单菌落接种至含氯霉素和卡那霉素的LB液体培养基中。若生长受到抑制，则表明质粒pcrF-gene-del已被消除。为消除pHT-XCR6，将WB800-Δ3的培养物在含SDS的LB液体培养基中过夜培养后，划线于无抗生素的LB平板。挑取单菌落接种至含氯霉素的LB液体培养基中。若该培养基中生长受抑，则表明pHT-XCR6已成功从菌落中消除。经验证的WB800-Δ3菌株——缺失全部三个抗性基因且不含外源质粒——命名为BS801。菌落PCR验证所用引物及菌株特征列于表S1。整个构建流程如图S1所示。所有重组菌株均由生工生物（上海）测序验证。
【数据】同源臂长度：500-1000 bp；后培养条件：30 g/L木糖、0.05 mg/mL卡那霉素、0.05 mg/mL氯霉素、30°C、8 h；SDS浓度：0.005%；培养条件：37°C、220 rpm、过夜
2.3 质粒pXHD1.1和pXHD1.1-bgaS的构建
为实现BgaS在枯草芽孢杆菌BS801中的异源表达，利用质粒pMA5-Lip和pMA5-MCS构建了一个新的穿梭质粒pXHD1.1。由于穿梭质粒pMA5-MCS中HpaII启动子下游的限制性酶切位点数量有限，不利于后续操作，本研究在其下游区域引入了新的限制性酶切位点。具体构建步骤如图S2A所示。
含枯草芽孢杆菌estA基因的质粒pMA5-Lip与质粒pMA5-MCS分别用NdeI和BamHI进行双酶切。从pMA5-Lip中获得的684 bp DNA片段（含EstA信号肽编码序列和限制性酶切位点）通过酶连法插入pMA5-MCS的相应位点，引入多个限制性酶切位点，构建枯草芽孢杆菌质粒pXHD1。随后，质粒pXHD1用EcoRI单酶切，回收长片段并自连，以消除一个EcoRI限制性酶切位点，获得目标质粒pXHD1.1。pXHD1.1的序列经DNA测序验证。
为表达酶BgaS，将bgaS基因插入EcoRI-BamHI限制性酶切位点，构建质粒pXHD1.1-bgaS。构建流程如图S2B所示。
【数据】DNA片段长度：684 bp；限制性内切酶：NdeI、BamHI、EcoRI；插入位点：EcoRI-BamHI
2.4 酶BgaS的表达与纯化
将质粒pXHD1.1-bgaS转化至BS801感受态细胞中，生成重组菌株BS801(pXHD1.1-bgaS)。挑取阳性转化子接种至含卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养。质粒提取后，用EcoRI和BamHI进行双酶切验证。验证成功的重组菌株在200 mL LB液体培养基中、37°C、200 rpm振荡过夜培养。随后，以1.0%（v/v）接种量转接至500 mL LB液体培养基中，于37°C进行表达。
培养结束后，细胞经5000 × g、4°C离心10分钟收集，重悬于磷酸盐缓冲液（50 mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH 7.0）。收集上清液，细胞经超滤浓缩。随后在4°C下进行超声破碎（350 W）。细胞碎片经离心（10,000 × g、10分钟、4°C）后，可溶性组分经Ni螯合亲和层析纯化。
【数据】接种量：1.0% (v/v)；培养基体积：200 mL（预培养）、500 mL（表达）；温度：37°C；转速：200 rpm；离心：5000 × g、10 min、4°C（收菌）；超声功率：350 W；二次离心：10,000 × g、10 min、4°C；缓冲液：50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0
2.5 BgaS酶活测定
BgaS的酶活通过将酶与5 mmol/L ONPG在50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中、90°C反应1分钟进行测定，以不加酶的反应作为对照。反应通过加入等体积的终止液终止。
【数据】底物：5 mmol/L ONPG；缓冲液：50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0；反应温度：90°C；反应时间：1 min
图1 | 10个信号肽编码序列的插入及分泌质粒pXHD1.1-Sp-bgaS构建示意图
研究结果
3.1 CRISPR-Cpf1辅助的三个抗性标记基因删除
为验证pHT-XCR6的阳性转化子，从构建的重组菌株WB800(pHT-XCR6)中提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图S3所示。质粒pHT-XCR6接近理论大小14,002 bp，表明质粒已导入细胞，重组菌株WB800(pHT-XCR6)构建成功。
为从菌株WB800中敲除抗性基因ble，将质粒pcrF11-ble-del转化至细胞中生成重组菌株WB800-Δ1，转化子经菌落PCR验证。结果如图2A所示。设计的引物靶向模板DNA上的特定区域，包含399 bp的抗性标记ble及其上下游同源臂，总长1804 bp。凝胶电泳显示，阴性对照枯草芽孢杆菌WB800的菌落PCR产物在1800 bp附近出现清晰条带，与理论大小一致。相比之下，使用相同引物对4个重组细胞进行PCR验证，发现条带缩短至1400 bp左右。条带大小的变化与ble的大小一致，表明抗性标记ble已被成功敲除。靶DSB位置附近的DNA测序验证证实了PCR结果（图S4）。
为进行后续实验，使用上述方法消除引入的质粒pcrF11-ble-del，并通过抗生素筛选验证质粒的成功消除（图S9）。pcrF11-ble-del消除后，以类似方式将pcrF11-hyg-del转化至细胞中，构建WB800-Δ2以敲除抗性基因hyg。菌落PCR的凝胶电泳结果（图2B）显示，重组细胞的基因大小短于对照，大小差异与hyg一致，确认其已被敲除。测序结果支持这一结论（图S5）。
为敲除抗性基因bsr，在按上述流程消除质粒pcrF11-hyg-del后，将质粒pcrF11-bsr-del转化至WB800-Δ2中生成WB800-Δ3。以类似方式进行了菌落PCR和琼脂糖凝胶电泳（图2C）。测序结果与凝胶电泳结果一致，表明bsr基因已被敲除（图S6）。随后，按照前述方法从WB800-Δ3中消除质粒pcrF11-bsr-del和pHT-XCR6。消除所有质粒后，最终成功构建了不含外源抗性基因的重组菌株枯草芽孢杆菌BS801。
图2 | (A) WB800-Δ1、(B) WB800-Δ2和(C) WB800-Δ3的菌落PCR结果。M：Marker；L1：枯草芽孢杆菌WB800菌落PCR验证（对照）；L2-L5：转化子的菌落PCR验证
此外，本研究测试了后培养对基因编辑效率的影响。表2显示了有无后培养的编辑方法之间的敲除效率差异。每组随机选取12个菌落进行验证。未进行后培养时，获得6-9个阳性菌落；而后培养组中所有测试菌落均为阳性，证实了后培养步骤对提高枯草芽孢杆菌中CRISPR-Cpf1系统基因编辑效率的积极作用。
从机制上讲，这种积极效果可以解释为：在持续诱导条件下，后培养不仅延长了Cpf1-crRNA核糖核蛋白复合物与基因组靶位点的有效相互作用时间，更重要的是建立了持续的选择压力。在此压力下，只有成功完成同源重组修复并实现基因敲除的细胞才能逃脱CRISPR系统诱导的持续性DNA双链断裂（DSB），从而富集目标突变体群体。图S10显示，未进行后培养的平板产生的菌落较少且分布稀疏，而后培养平板上的菌落数量显著增加，表明细胞有足够的时间进行DNA修复，从而更好地富集成功编辑的突变体。这种通过延长编辑窗口和加强正选择来提高效率的原理已在CRISPR-Cas系统中得到证实（So et al., 2017）。作为CRISPR-Cas系统的一种类型，本研究认为CRISPR-Cpf1遵循相同的原理。此外，其他采用后培养策略的CRISPR-Cas基因编辑研究通常报道编辑效率接近100%（Y. Wu, Chen, et al., 2020）。这与本研究结果一致，进一步支持了后培养对CRISPR-Cpf1系统基因编辑的积极影响。
【数据】pHT-XCR6理论大小：14,002 bp；ble基因长度：399 bp；PCR产物理论长度：1804 bp；敲除后条带：约1400 bp；未后培养阳性菌落数：6-9/12；后培养阳性菌落数：12/12
3.2 BgaS在枯草芽孢杆菌中的基因克隆、表达与纯化
将质粒pXHD1.1-bgaS导入枯草芽孢杆菌BS801中，随后对菌株进行发酵以观察外源蛋白BgaS的表达情况。发酵24小时后，对无细胞提取物、发酵上清液和纯化组分进行SDS-PAGE分析。结果如图S7所示。BgaS在重组菌株BS801(pXHD1.1-bgaS)中成功表达并被检测到。BgaS的分子质量为59.45 kDa。BgaS的酶活为23.76 U/mg。
与先前报道的BgaS在大肠杆菌中的活性相比，其在枯草芽孢杆菌中的酶活相对较低。本研究推测活性降低可能是由于表达载体的更换导致部分蛋白质错误折叠（Yan & Wu, 2017）。根据先前的研究，合适的启动子可以有效表达外源蛋白并减少错误折叠的可能性（Konda et al., 2019; Rao et al., 2020; N. Zhang et al., 2016）。因此，为解决酶活下降的问题，计划在未来的研究中更换不同的启动子，以实现BgaS更好的表达。
【数据】发酵时间：24 h；BgaS分子质量：59.45 kDa；酶活：23.76 U/mg
3.3 通过信号肽筛选实现BgaS在枯草芽孢杆菌中的分泌表达
BgaS在枯草芽孢杆菌中成功表达后，采用信号肽筛选策略测试该酶的分泌表达。基于SignalP 5.0和PSORTb 3.0软件的预测结果，结合文献报道，选取了10个来源于枯草芽孢杆菌的Sec通路信号肽。相应地，用于分泌表达测试的各重组菌株均成功构建，包括BS801(pXHD1.1-SPnprE-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPyoaW-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPxynA-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPsacB-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPphoB-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPpel-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPnucB-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPdacB-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPbglS-bgaS)和BS801(pXHD1.1-SPbdbD-bgaS)。
对10个重组细胞沉淀的不溶性组分进行酶活测试，结果显示细胞沉淀中无活性酶，如图S8所示。10个重组菌株无细胞提取物的SDS-PAGE结果如图3所示。在L2和L13泳道（阳性对照组）约60 kDa处观察到清晰条带，与预期分子量一致。此外，在L4、L6-L9和L12泳道的相同位置也检测到明显条带，分别对应重组菌株BS801(pXHD1.1-SPnucB-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPbdbD-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPpel-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPyoaW-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPxynA-bgaS)和BS801(pXHD1.1-SPdacB-bgaS)的无细胞提取物。然而，其他重组菌株在相应位置未观察到条带。
图3 | 重组菌株无细胞提取物的SDS-PAGE分析。L1：BS801（阴性对照）；L2：BS801(pXHD1.1-bgaS)（阳性对照）；L3：BS801(pXHD1.1-SPnprE-bgaS)；L4：BS801(pXHD1.1-SPnucB-bgaS)；L5：BS801(pXHD1.1-SPbglS-bgaS)；L6：BS801(pXHD1.1-SPbdbD-bgaS)；L7：BS801(pXHD1.1-SPpel-bgaS)
采用ONPG法测定10个无细胞提取物的酶活，颜色变化如图4A所示。6个重组菌株的无细胞提取物出现颜色变化，其酶活如图4B所示，其余提取物未检测到明显酶活。
图4 | 通过ONPG法评估BS801(pXHD1.1-bgaS)和10个BS801(pXHD1.1-Sp-bgaS)重组菌株无细胞提取物的酶活结果。(A) 实验过程中观察到的颜色变化；(B) 不同信号肽对胞内BgaS活性的影响
对6个重组菌株的发酵上清液进行SDS-PAGE验证，结果如图5所示。在BS801(pXHD1.1-SPdacB-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPphoB-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPnprE-bgaS)、BS801(pXHD1.1-SPnucB-bgaS)和BS801(pXHD1.1-SPbdbD-bgaS)的发酵上清液中观察到清晰条带，表明这些信号肽能够有效介导BgaS的分泌。BS801(pXHD1.1-SPxynA-bgaS)的条带较弱。
图5 | 重组菌株发酵上清液的SDS-PAGE验证。L1：BS801（阴性对照）；L2：BS801(pXHD1.1-SPdacB-bgaS)；L3：BS801(pXHD1.1-SPphoB-bgaS)；L4：BS801(pXHD1.1-SPnprE-bgaS)；L5：BS801(pXHD1.1-SPnucB-bgaS)；L6：BS801(pXHD1.1-SPbdbD-bgaS)；L7：BS801(pXHD1.1-SPxynA-bgaS)
采用ONPG法测定BS801(pXHD1.1-bgaS)和10个重组菌株的胞外分泌酶活，颜色变化如图6A所示，酶活结果如图6B所示。其中，来源于DacB蛋白的信号肽（SPdacB）对BgaS的分泌效率最高，胞外酶活达到0.42 U/mL。其次为SPphoB、SPnprE和SPnucB，均能有效促进BgaS分泌。
图6 | 通过ONPG法评估BS801(pXHD1.1-bgaS)和10个BS801(pXHD1.1-Sp-bgaS)重组菌株的分泌酶活结果。(A) 实验过程中的颜色变化；(B) 不同信号肽对胞外BgaS活性的影响
对重组BgaS的酶学性质进行了表征，结果如图7所示。BgaS的最适反应温度为90°C（图7A），最适反应pH为7.0（图7B）。在80°C孵育3小时后，BgaS仍保留约80%的相对活性（图7C），显示出良好的热稳定性。金属离子对酶活的影响如图7D所示。
图7 | BgaS的酶学性质。(A) 最适反应温度；(B) 最适反应pH；(C) 热稳定性分析；(D) 金属离子对酶活的影响
对信号肽性质与胞外酶活之间的相关性进行了分析，结果如图8所示。分析了信号肽长度（图8A）、N端区域电荷分布（图8B）、H区疏水性（图8C）以及mRNA折叠的ΔG值（图8D）与分泌效率之间的关联。
图8 | 信号肽性质与胞外酶活的相关性分析。(A) 长度；(B) N端区域电荷分布；(C) H区疏水性；(D) mRNA折叠的ΔG
在最优条件下，BgaS在90°C下4小时内将生乳中的乳糖水解至0.5%（w/w）以下，乳糖水解率达到92.64%。
【数据】最适温度：90°C；最适pH：7.0；80°C孵育3 h后相对活性：约80%；SPdacB分泌酶活：0.42 U/mL；乳糖水解率：92.64%；水解时间：4 h；水解温度：90°C；最终乳糖浓度：<0.5% (w/w)
讨论与解读
本研究通过CRISPR-Cpf1基因编辑系统，以枯草芽孢杆菌WB800为原始宿主，成功构建了具有高分泌能力且不含任何抗性标记的新型重组菌株BS801。BgaS在BS801中成功表达，重组BgaS的最适反应温度为90°C，最适pH为7.0。该酶表现出良好的耐热性——在80°C孵育3小时后相对活性几乎不变。通过信号肽筛选方法，成功实现了BgaS的分泌表达。在最优条件下，BgaS在4小时内达到92.64%的乳糖水解率，展示了其在高温和中性pH条件下的高效性。本研究为重组BgaS在低乳糖牛奶生产中的工业应用提供了理论支持。
值得注意的是，虽然本研究敲除的抗性基因均为非必需基因，菌株理论上更安全，但其实际生物安全性仍需通过后续的细胞毒性或动物实验进一步验证。同时，本研究构建的信号肽文库规模有限，仅筛选了来源于Sec通路的10个信号肽，胞外酶活仍有提升空间。未来研究可扩大信号肽文库，纳入其他分泌通路的信号肽。
编译者解读：本研究的技术路线值得关注——先用CRISPR-Cpf1做"减法"（清除抗性标记），再做"加法"（信号肽筛选优化分泌），两步策略逻辑清晰。后培养步骤对编辑效率的显著提升是一个实用的工艺细节，对工业菌株改造有直接参考价值。BgaS在90°C、pH 7.0条件下实现92.64%的乳糖水解率，这一数据在高温中性条件下相当亮眼。不过，0.42 U/mL的胞外酶活距离工业化仍有差距，信号肽文库也仅覆盖Sec通路。若后续能扩大文库规模并优化启动子，该系统的应用潜力值得期待。
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108523