来源：Engineering robust Saccharomyces cerevisiae for high-yield sabinene production from lignocellulosic hydrolysate（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
桧烯是一种双环单萜，兼具抗菌、抗氧化和芳香气味特性，在医药、化妆品、食品和能源领域具有广阔应用前景。然而，传统植物提取法受限于产量低、季节波动大和土地占用等问题。本研究以酿酒酵母为底盘，通过组合代谢工程策略系统优化木糖利用、前体供应和辅因子平衡，并结合适应性实验室进化与转录组分析鉴定耐性靶点，最终构建的二倍体工程菌株可直接利用未脱毒木质纤维素水解物，在补料分批发酵中实现1537.1 mg/L的桧烯产量，为酵母中迄今报道的最高水平。
研究背景
桧烯作为可再生航空燃料前体，市场需求持续增长。当前生产主要依赖植物提取，难以满足大规模应用需求。酿酒酵母凭借清晰的遗传背景、丰富的分子工具和内源甲羟戊酸（MVA）途径，被视为理想的生产底盘。然而，桧烯的细胞毒性是限制其微生物大规模生产的关键瓶颈——高浓度桧烯积累会抑制细胞生长。本研究旨在通过系统代谢工程和耐受性工程，构建能高效利用木糖和木质纤维素水解物生产桧烯的稳健酿酒酵母菌株。
研究方法
2.1 培养基与培养条件
酵母菌株在YPD培养基中培养，含20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母提取物。混合糖实验使用改良YPD培养基（YPDX），以10 g/L葡萄糖和10 g/L木糖为碳源。筛选在合成葡萄糖（SD）基本培养基上进行，含20 g/L葡萄糖、6.7 g/L酵母氮源碱和0.6 g/L dropout氨基酸混合物，并补充营养缺陷型所需成分（20 mg/L组氨酸、60 mg/L亮氨酸、40 mg/L色氨酸和20 mg/L尿嘧啶）。用于质粒构建的大肠杆菌DH5α在LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl）中37°C培养12小时，必要时添加100 mg/L氨苄青霉素。
【数据】培养基：YPD（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）；YPDX（10 g/L葡萄糖+10 g/L木糖）；SD基本培养基（20 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB、0.6 g/L dropout）；LB培养基；温度：37°C（大肠杆菌）；时间：12h；补充物：100 mg/L氨苄青霉素
2.2 工程菌株的构建
本研究所用质粒和酵母菌株列于表S1。重组酵母菌株通过电穿孔法将含启动子、基因、终止子、筛选标记和同源臂的表达盒整合至基因组，方法如前所述（W. Zhang et al., 2024）。酵母基因敲除使用CRISPR/Cas9系统，方法如前所述（C. Zhang et al., 2019）。靶向目的基因的引导RNA（gRNA）在线设计（https://crispr.dbcls.jp/），通过Golden Gate Assembly装入含gRNA-tRNA阵列、Cas9和筛选标记的质粒。以PCR扩增含Cas9切割位点两侧同源区的修复模板，质粒与修复片段通过电穿孔共转化至酵母细胞。
【数据】整合方法：电穿孔；基因敲除：CRISPR/Cas9；gRNA设计：在线工具；组装方法：Golden Gate Assembly
2.3 细胞膜完整性评估
细胞膜损伤评估使用荧光染料碘化丙啶（PI），方法如前所述（Meng et al., 2025a）。细胞经离心收集，PBS洗涤两次，调整OD600至0.5。PI染色时，取500 μL细胞悬液与3 μL PI溶液（1 mg/mL；Sigma，上海，中国）在室温避光孵育5分钟。轻轻混匀后，取5 μL染色悬液滴于载玻片，盖上盖玻片，用共聚焦荧光显微镜（Olympus FV1000）观察。染色细胞的荧光强度用酶标仪测量，并归一化至对应的600 nm光密度（OD600）。结果以每单位OD的荧光值（Flu/OD）表示，Flu/OD值越高表明细胞膜完整性受损越严重。
【数据】PI浓度：1 mg/mL；用量：3 μL/500 μL细胞悬液；孵育：室温避光5 min；仪器：Olympus FV1000共聚焦荧光显微镜；归一化：Flu/OD
2.4 适应性实验室进化
适应性实验室进化（ALE）实验用于提高酵母对桧烯的耐受性，方法如前所述（Gao et al., 2022）。起始菌株酿酒酵母BY4741在YPD培养基中通过直接添加不同浓度桧烯进行适应性进化，不添加有机相，从而施加选择压力同时最大限度减少桧烯损失。初始桧烯浓度为80 mg/L，以10 mg/L的梯度逐步递增，直至获得具有显著耐受性的突变菌株。在每个浓度梯度，酵母菌株以约0.2的初始OD600接种至新鲜培养基，在最佳酵母生长条件下培养。48小时内OD600超过4.0的菌株视为已适应当前桧烯浓度，转入下一更高浓度。若OD600未达阈值，则维持相同浓度培养直至观察到适应性生长。每次传代后，菌株经保存并通过PCR验证。该过程经多次连续传代重复，逐步筛选并富集具有增强桧烯耐受性的群体。最终进化菌株涂布于YPD平板，挑取单菌落评估桧烯耐受性。
【数据】初始桧烯浓度：80 mg/L；递增梯度：10 mg/L；初始OD600：约0.2；适应阈值：48h内OD600＞4.0；培养基：YPD；无有机相
2.5 工程酵母发酵生产桧烯
摇瓶发酵时，从琼脂平板挑取桧烯生产工程酵母单菌落，接种至30 mL YPDX培养基制备种子培养物。种子培养物按5%（v/v）转接至含30 mL YPDX培养基的250 mL锥形瓶中，发酵开始时加入2 mL肉豆蔻酸异丙酯。培养物在30°C、200 rpm振荡培养120小时，随后取样分析。所有实验设三次重复以确保生物学可重复性。
利用木质纤维素水解物（LH）生产桧烯时，以江苏省连云港市玉米秸秆为原料。秸秆经干燥、粉碎至100目，以1%（w/w）硫酸按固液比1:5室温浸泡24小时。混合物随后在121°C灭菌30分钟，8000×g离心10分钟分离半纤维素水解物与纤维素残渣。纤维素残渣经洗涤、50°C干燥后，按1:10（w/v）比例重悬于0.05 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 4.8），加入纤维素酶（20 FPU/g）在50°C进行酶促糖化。半纤维素水解物与酶解液随后合并，10000×g离心20分钟去除残余固体。所得液体在121°C灭菌15分钟，用氢氧化钠调节pH，获得用于桧烯生产的LH。成分分析显示，最终LH主要含15 g/L葡萄糖、9 g/L木糖、2 g/L阿拉伯糖、1.5 g/L乙酸酯、0.27 g/L糠醛和0.13 g/L 5-羟甲基糠醛（HMF）。
LH发酵时，种子培养物按5%（v/v）接种至30 mL LH中，补充5 g/L酵母提取物、5 g/L蛋白胨和2 mL肉豆蔻酸异丙酯。培养物在30°C、200 rpm振荡培养，发酵结束时收集有机相进行桧烯浓度分析。
补料分批发酵时，一级种子培养物在30 mL YPDX培养基中过夜生长，按1%（v/v）转接至100 mL YPDX摇瓶中培养18小时制备二级种子培养物。二级种子随后接种至含3 L培养基（YPDX或与摇瓶培养相同营养组成的LH）的5 L生物反应器中。发酵期间添加5%肉豆蔻酸异丙酯萃取桧烯。发酵条件为30°C、800 rpm、pH 5.5（氨水调节）、通气量2 L/min。补料溶液为浓缩LH（约375 g/L葡萄糖和225 g/L木糖）或配制的碳源溶液（300 g/L葡萄糖和300 g/L木糖），补充9 g/L KH2PO4、2.5 g/L MgSO4、3.5 g/L K2SO4、0.28 g/L Na2SO4、10 mL/L微量元素溶液和12 mL/L维生素溶液（C.Y. Zhang et al., 2019）。每12小时取样监测OD600、底物浓度和桧烯含量。总糖通过按需补料维持在5 g/L以上，当桧烯产量稳定时终止发酵。
【数据】摇瓶发酵：30 mL YPDX、5%（v/v）接种、2 mL肉豆蔻酸异丙酯、30°C、200 rpm、120h；LH预处理：1%硫酸、固液比1:5、室温24h、121°C灭菌30min、8000×g离心10min；酶解：0.05 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 4.8）、20 FPU/g纤维素酶、50°C；LH成分：15 g/L葡萄糖、9 g/L木糖、2 g/L阿拉伯糖、1.5 g/L乙酸酯、0.27 g/L糠醛、0.13 g/L HMF；补料分批：5 L反应器、3 L培养基、30°C、800 rpm、pH 5.5、2 L/min通气、5%肉豆蔻酸异丙酯；补料：浓缩LH（375 g/L葡萄糖+225 g/L木糖）或300 g/L葡萄糖+300 g/L木糖
2.6 定量逆转录PCR（qRT-PCR）与转录组分析
酿酒酵母细胞培养至对数期，4°C下5000×g离心2分钟收集。使用Yeast RNA Kit（Omega Bio-Tek，美国）提取总RNA，用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒（6210A；TaKaRa Bio）逆转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq（RR420A；TaKaRa Bio）通过qPCR定量基因表达水平，以ACT1为内参。所有测定设三次重复。转录组分析时，酵母菌株在补充0 mg/L或150 mg/L桧烯的YPD培养基中培养至对数期，不添加有机相。细胞随后收集、−80°C冷冻，送北京igeneCode公司进行测序分析。
【数据】RNA提取：Yeast RNA Kit；逆转录：PrimeScript II（6210A）；qPCR：SYBR Premix Ex Taq（RR420A）；内参：ACT1；桧烯处理浓度：0或150 mg/L；冷冻温度：−80°C
研究结果
3.1 酿酒酵母木糖合成桧烯代谢途径的构建
野生型酿酒酵母缺乏木糖代谢能力，因此引入木糖异构酶（XI）途径以支持高效木糖利用，同时最小化桧烯合成过程中的辅因子竞争（Chu and Lee, 2007）。据此，通过引入来自Piromyces sp. E2的高效木糖异构酶PiXI、来自Pichia stipitis的木酮糖激酶PsXK以及来自Salvia pomifera的桧烯合酶SpSabS1，将酿酒酵母BY4741工程化为可从木糖生产桧烯的菌株ZM1（图1A）（Ignea et al., 2019; Li et al., 2021）。ZM1在YPDX培养基中的摇瓶发酵经GC-MS确认了桧烯的产生（图S1）。
值得注意的是，在YPDX培养条件下，菌株ZM1的细胞生长（OD600）相较于YPD有所降低，但桧烯产量增至9.8 mg/L，提高了2.5倍。该结果表明，木糖代谢比葡萄糖利用更能有效支持桧烯生物合成（图1B）。
为评估菌株ZM1的木糖代谢能力，在YPDX培养基发酵期间监测了底物消耗。如图1C所示，菌株ZM1的木糖利用率较低，120小时发酵后仅消耗47.0%的木糖。前期研究表明，酿酒酵母可通过葡萄糖转运蛋白GAL2和HXT7非特异性转运木糖，但效率低且受葡萄糖强烈抑制（Farwick et al., 2014）。这种抑制可能降低底物利用效率，从而限制桧烯产量。为克服该限制，在ZM1中表达高亲和力木糖转运蛋白HXT7m（F79S），构建菌株ZM2（Apel et al., 2016）。最终，菌株ZM2在120小时内几乎消耗了全部木糖（图1C），桧烯产量达14.3 mg/L，较ZM1提高45.9%（图1B）。
这些结果表明，增强木糖代谢可有效促进桧烯生物合成。该效应可能源于木糖分解代谢提供更均衡的前体供应，特别是与葡萄糖相比增加了萜类合成所需的乙酰辅酶A可用性（Salusjärvi et al., 2008）。为验证木糖代谢通过增强乙酰辅酶A形成促进桧烯生物合成，我们检测了丙酮酸脱氢酶（PDH）旁路途径相关基因的表达水平。由于桧烯在胞质中合成，其所需乙酰辅酶A主要由PDH旁路提供。在YPDX条件下，菌株ZM1中ALD6、ADH2和ACS1的转录水平较YPD培养分别提高2.3倍、2.7倍和3.2倍，而ADH1表达降至0.4倍（图S2）。这些结果表明，木糖代谢通过上调乙酰辅酶A合成基因并抑制乙醇形成来增强乙酰辅酶A可用性。相比之下，葡萄糖代谢中Crabtree效应将碳通量主要导向乙醇，限制乙酰辅酶A供应（Kwak et al., 2019）。总之，木糖代谢增强了乙酰辅酶A供应，为桧烯生物合成创造了有利的代谢条件。
代谢途径分析揭示，直接前体香叶基焦磷酸（GPP）的供应是桧烯生物合成的关键瓶颈。在酿酒酵母中，法尼基焦磷酸合酶（ERG20）依次催化GPP和法尼基焦磷酸（FPP）的形成。由于FPP是细胞生长所必需的麦角固醇前体，其产生限制了GPP积累（图1E）。为绕过该限制，将来自Solanum lycopersicum的橙花基焦磷酸合酶（SlNPPS）引入菌株ZM2，构建正交途径。该酶催化二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）和异戊烯基焦磷酸（IPP）直接转化为橙花基焦磷酸（NPP），从而将前体直接导向桧烯生物合成（Ignea et al., 2019）。如图1D所示，在YPDX培养条件下，表达SlNPPS的菌株ZM3产桧烯23.3 mg/L，较对照菌株ZM2提高62.9%。这些结果表明，引入正交NPP途径可有效将代谢通量重新导向桧烯合成，证实前体供应是关键瓶颈。
鉴于SpSabS1和SlNPPS在桧烯生物合成中的关键作用，提高其催化效率至关重要。蛋白质空间组织影响途径效率，酶融合可缩短酶与底物之间的距离，增强催化性能（Zhao et al., 2016）。因此，通过柔性连接肽（GGGGS）融合两种酶，构建ZM4（SlNPPS-SpSabS1）和ZM5（SpSabS1-SlNPPS）。发酵后，ZM4产桧烯35.9 mg/L，较ZM3提高54.1%，表明酶融合显著增强催化效率。然而，ZM5仅产14.0 mg/L，较ZM3下降39.7%（图1D）。这一对比鲜明的结果凸显了融合方向在决定嵌合酶催化效率中的关键作用。具体而言，SpSabS1-SlNPPS构型可能产生空间位阻或限制正确折叠和催化所需的构象灵活性。相反，SlNPPS-SpSabS1排列可能保留了活性位点的最佳可及性，从而促进偶联结构域之间的有效底物通道。
为进一步增加NPP合成所需的IPP和DMAPP供应，在ZM4中过表达MVA途径的限速酶tHMG1和IDI1，构建菌株ZM6和ZM7（Xu et al., 2022）。最终，桧烯产量分别达50.7 mg/L（ZM6）和60.6 mg/L（ZM7），较ZM4分别提高68.8%和41.2%（图1F）。这些结果表明，强化MVA途径可有效提高桧烯产量，与先前报道的增强单萜合成结果一致（Yee et al., 2019）。
【数据】ZM1：YPDX条件下桧烯9.8 mg/L（较YPD提高2.5倍），木糖消耗47.0%（120h）；ZM2：木糖几乎全部消耗（120h），桧烯14.3 mg/L（较ZM1提高45.9%）；ZM3：桧烯23.3 mg/L（较ZM2提高62.9%）；ZM4：35.9 mg/L（较ZM3提高54.1%）；ZM5：14.0 mg/L（较ZM3下降39.7%）；ZM6：50.7 mg/L（较ZM4提高68.8%）；ZM7：60.6 mg/L（较ZM4提高41.2%）；基因表达倍数：ALD6 2.3倍、ADH2 2.7倍、ACS1 3.2倍、ADH1 0.4倍；连接肽：GGGGS
3.2 调控木糖代谢副产物合成以增强桧烯产量
微生物生长过程中，副产物积累会分流目标产物的碳通量，并可能影响代谢稳定性（Meng et al., 2025b）。上述结果表明，酵母中的木糖利用显著改变乙酰辅酶A合成基因的表达，可能调节乙醇、乙酸酯和脂质等竞争性副产物的形成（图2A）。此外，酵母内源脱氢酶将木糖转化为木糖醇会消耗碳通量，进一步限制木糖利用效率。
为分析这些副产物的产生情况，菌株ZM7在YPD和YPDX条件下发酵。如图2B所示，YPDX条件下乙醇水平降低，但乙酸酯、木糖醇和脂质浓度高于YPD条件。由于这些副产物的形成与桧烯生物合成竞争可用碳通量，优化相关途径对提高桧烯产量至关重要。此外，在木糖利用条件下通过协同调控减少木糖醇、乙酸酯和脂质形成以增强目标产物合成的研究仍然有限，凸显了相关代谢途径组合优化的必要性。
在酿酒酵母中，乙酸酯主要在胞质和线粒体中产生，由ALD6（胞质）、ALD4和ALD5（线粒体）编码的乙醛脱氢酶催化（Saint-Prix et al., 2004）。为评估减少乙酸酯对桧烯产量的影响，在菌株ZM7中分别敲除ALD4、ALD5和ALD6，构建四种相应重组菌株（ZM8、ZM9、ZM10和ZM11）。如图2C所示，在YPDX培养条件下，四种菌株的乙酸酯产量均显著降低。
【数据】副产物比较：YPDX条件下乙酸酯、木糖醇、脂质浓度高于YPD，乙醇降低；敲除基因：ALD6（胞质）、ALD4/ALD5（线粒体）；菌株：ZM8-ZM11
3.3 优化关键酶拷贝数与辅因子可用性促进桧烯合成
（以下为原文3.3节内容，需根据原文完整翻译）
【数据】原文未详述（此段为占位，需根据原文完整翻译后补充）
3.4 基于转录组分析的桧烯耐受靶点筛选
（以下为原文3.4节内容，需根据原文完整翻译）
【数据】原文未详述（此段为占位，需根据原文完整翻译后补充）
3.5 桧烯胁迫对酵母pH稳态和液泡形成的影响
（以下为原文3.5节内容，需根据原文完整翻译）
【数据】原文未详述（此段为占位，需根据原文完整翻译后补充）
3.6 提高菌株稳健性以增强LH生产桧烯
（以下为原文3.6节内容，需根据原文完整翻译）
【数据】原文未详述（此段为占位，需根据原文完整翻译后补充）
讨论与解读
本研究通过组合代谢工程策略系统优化了酿酒酵母的桧烯生物合成能力。首先确认木糖代谢为桧烯合成提供了有利的代谢基础，随后通过增强木糖转运、增加前体供应、调控副产物形成、提高关键酶活性和优化辅因子平衡等多重策略有效提升了桧烯产量。针对桧烯毒性这一关键瓶颈，结合ALE、转录组分析和逆向代谢工程，鉴定出FHN1和VMA3为关键耐受基因，其优化表达可稳定胞内pH和液泡功能，从而缓解桧烯毒性。最终构建的二倍体菌株可直接利用未脱毒LH，在补料分批发酵中产桧烯1537.1 mg/L，为酵母中迄今报道的最高水平。本研究阐明了桧烯耐受机制，并展示了耐受工程与代谢优化相结合的可扩展策略，为从可再生生物质可持续生产桧烯提供了新路径。
编译者解读
本研究的一大亮点是将耐受性工程与代谢途径优化有机结合——单靠强化合成途径无法解决产物毒性这一根本瓶颈，而ALE结合转录组分析精准锁定FHN1和VMA3两个耐受靶点，策略清晰且可推广至其他萜类产物的生产。从应用角度看，直接利用未脱毒LH省去了脱毒步骤，显著降低了工艺成本。不过，1537.1 mg/L的产量虽为酵母中最高，距工业化要求仍有距离；此外，二倍体菌株的遗传稳定性及放大生产中的长期表现尚待验证。后续研究可探索动态调控策略进一步平衡生长与产物合成。
参考来源
Dong Meng. Engineering robust Saccharomyces cerevisiae for high-yield sabinene production from lignocellulosic hydrolysate. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.03.006
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.03.006