来源：Effect of sequential fermentation with indigenous non-Saccharomyces cerevisiae combinations and Saccharomyces cerevisiae on the chemical composition and aroma compounds evolution of kiwifruit wine（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
猕猴桃酒长期面临香气单一、酚类物质损失等品质瓶颈。本研究从自然发酵猕猴桃酒中分离三株本土非酿酒酵母——鲁氏接合酵母、库德里阿兹威毕赤酵母和季也蒙迈耶氏酵母，将其两两组合后与酿酒酵母进行顺序接种发酵。研究发现，混合发酵策略不仅显著提升了猕猴桃酒的抗氧化能力和总酚含量，还通过降低发酵过程中关键香气化合物的损失率，赋予酒体浓郁的花果香气，为开发新型果酒发酵剂提供了实验依据。
研究背景
猕猴桃（Actinidia chinensis），又称"中国醋栗"，属于猕猴桃科猕猴桃属大型藤本植物。凭借其风味独特的果肉、酸甜口感以及丰富的营养成分（维生素、氨基酸和多酚），猕猴桃在全球广受欢迎。近年来，随着农业技术升级和管理技术改进，猕猴桃产量逐年攀升。联合国粮农组织（FAO）报告显示，中国是全球最大的猕猴桃种植国和生产国，2019年至今产量和出口量均居世界首位。然而，作为一种典型的呼吸跃变型果实，未成熟猕猴桃风味欠佳，而成熟后果实货架期极短，常因未能及时消费造成严重浪费。因此，猕猴桃深加工对提升经济效益和果实资源利用率至关重要。猕猴桃酒通过酵母发酵猕猴桃澄清汁制成，已有百余年生产历史。相比其他同类产品，猕猴桃酒不仅有效避免了果干和果酱生产中的损耗，还能最大限度保留果实中的生物活性物质，且展现出良好的抗氧化活性。然而，单一酿酒酵母发酵常导致香气单一、复杂度不足，如何利用本土非酿酒酵母资源改善猕猴桃酒风味品质，是该领域的研究热点。
研究方法
2.1 菌株与原料果汁
三株本土非酿酒酵母——鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）P-9（Zr）、库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）B0-1（Pk）和季也蒙迈耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）B12（Mg），分离自自然发酵的猕猴桃酒中，经表征具有优异的β-葡萄糖苷酶和酯酶活性。适宜猕猴桃酒发酵的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WLS21（Sc）保藏于西北农林科技大学食品科学与工程学院健康食品制造与安全实验室。徐香猕猴桃于当年10月采自陕西省眉县猕猴桃标准化示范区。选取无可见病虫害的果实，在室温（15°C，27%相对湿度）下存放至成熟。随后去皮，用榨汁机（Mr. Orange, JP-2, 中国）处理果实。加入果胶酶（20 mg/L）和焦亚硫酸钾（K₂S₂O₅，56 mg/L），于37°C酶解处理24小时。将混合物离心（7104g，4°C，15 min）去除果渣，收集澄清果汁并于−18°C保存备用。
【数据】菌株：Zr P-9、Pk B0-1、Mg B12、Sc WLS21；果胶酶：20 mg/L；K₂S₂O₅：56 mg/L；酶解温度：37°C；酶解时间：24h；离心：7104g，4°C，15 min；贮藏温度：−18°C
2.2 实验室微发酵
参照Zhang等（2022）报道的接种方案并稍作修改进行猕猴桃酒发酵。添加蔗糖将猕猴桃汁的白利度（Brix°）调整至21，所有实验方案均在恒温发酵罐中进行，温度25°C，装入4.5 L巴氏杀菌果汁（75°C，15 min）。以单独接种酿酒酵母为对照，共建立三种顺序接种方案：同时接种库德里阿兹威毕赤酵母B0-1和季也蒙迈耶氏酵母B12，4天后接种酿酒酵母（Pk-Mg）；同时接种库德里阿兹威毕赤酵母B0-1和鲁氏接合酵母P-9，4天后接种酿酒酵母（Pk-Zr）；同时接种鲁氏接合酵母P-9和季也蒙迈耶氏酵母B12，4天后接种酿酒酵母（Mg-Zr）。总接种量设定为7 log CFU/mL，非酿酒酵母与酿酒酵母按1:1比例接种。每个方案设两个平行实验组，每组每个参数测定三次。发酵开始后，每隔一天取样，分析关键挥发性化合物的动态演化和损失率。以可溶性固形物含量（SSC）作为监测发酵过程的观察指标，连续三天无变化视为发酵终点。转移至无菌容器去除酒脚，再次添加K₂S₂O₅，于15°C陈酿一个月，过滤后用于后续分析。
【数据】Brix°：21；发酵温度：25°C；巴氏杀菌：75°C，15 min；总接种量：7 log CFU/mL；接种比例：1:1；取样频率：每2天一次；陈酿：15°C，1个月
2.3 理化参数分析
使用pH计（METTLER TOLEDO, FiveEasyPlus FE28, 瑞士）和便携式手持折光仪（INESA, WZS80, 上海，中国）分别测定猕猴桃酒的pH和可溶性固形物含量。总糖和总酸按照中国国家标准GB/T15038–2006要求测定。猕猴桃酒和果汁的总酚含量和维生素C含量分别采用福林-酚法和2,6-二氯靛酚法测定。乙醇浓度采用配备火焰离子化检测器的气相色谱仪（GC-2014C, Shimadzu, 日本）测定。具体操作：样品用丙酮稀释，经0.22 μm有机滤膜过滤，在DB-WAX色谱柱（30 m × 0.25 mm, 0.25 μm）上分离。进样口温度设定为250°C，进样量0.5 μL，分流模式进样，分流比20:1，载气为N₂，流速0.42 mL/min，检测器温度300°C。升温程序：初始温度40°C保持13 min，然后以40°C/min速率升至240°C保持12 min。以超纯水为对照，使用色差仪（CS-820色差仪；彩谱科技有限公司，杭州，中国）测定猕猴桃酒的亮度（L）、红绿值（a）和黄蓝值（b），总色差（ΔE）按CIELAB色彩空间提供的公式（1）计算：
ΔE = [(L₁ − L₀)² + (a₁ − a₀)² + (b₁ − b₀*)²]^(1/2) （式1）
式1中，下标1代表实验组，下标0代表对照组。
【数据】色谱柱：DB-WAX（30 m × 0.25 mm, 0.25 μm）；进样口温度：250°C；进样量：0.5 μL；分流比：20:1；载气：N₂，0.42 mL/min；检测器温度：300°C；升温程序：40°C保持13 min→240°C（40°C/min）保持12 min
2.4 HPLC分析
有机酸和单体酚采用配备PDA检测器的高效液相色谱仪（LC-20A, Shimadzu, 日本）检测，参照Li等（2022）的方法。有机酸分离在Shim-pack VP-DOS C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm内径，粒径4.6 μm，Shimadzu，京都，日本）上进行，柱温40°C，进样量10 μL，检测波长210 nm。流动相A为0.1%磷酸水溶液，流动相B为甲醇，等度洗脱，流速1 mL/min，A:B = 97.5:2.5。有机酸的定性和定量通过将保留时间和标准曲线与标准品（草酸、酒石酸、奎宁酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸和琥珀酸；上海源叶生物科技有限公司，中国）比对完成。
猕猴桃酒中的单体酚在分析前需进行特异性富集。取5 mL样品调节pH至7.0，加入5 mL乙酸乙酯萃取中性酚三次，然后调节pH至2.0萃取酸性酚三次。合并所有萃取液，旋转蒸发至干，残渣用甲醇溶解并经有机滤膜（0.22 μm）过滤。采用Waters xTerra MS C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm）分析单体酚，柱温30°C，进样量20 μL。流动相A为1%乙酸水溶液，流动相B为乙腈，总流速1 mL/min，梯度洗脱程序如下：前10 min乙腈浓度保持5%，10–25 min升至30%，25–35 min升至50%，35–40 min升至70%，40 min后降回5%。黄烷-3-醇、羟基肉桂酸和黄酮醇分别于280 nm、320 nm和360 nm吸收波长检测。单体酚的定性和定量通过将保留时间和标准曲线与标准品（没食子酸、儿茶素、芦丁、根皮苷、槲皮素、根皮素、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸和阿魏酸；上海源叶生物科技有限公司，中国）比对完成。
【数据】有机酸色谱柱：Shim-pack VP-DOS C18（250 mm × 4.6 mm，粒径4.6 μm）；柱温：40°C；进样量：10 μL；检测波长：210 nm；流动相：0.1%磷酸:甲醇=97.5:2.5；流速：1 mL/min；单体酚色谱柱：Waters xTerra MS C18（250 mm × 4.6 mm, 5 μm）；柱温：30°C；进样量：20 μL；检测波长：280/320/360 nm；流速：1 mL/min
2.5 抗氧化能力分析
猕猴桃酒的DPPH自由基清除、ABTS自由基清除和羟基自由基清除能力参照此前报道的方法（Mitrevska et al., 2020; Restuccia et al., 2017）测定，所有样品在测定前用蒸馏水适度稀释（1:20，v/v）。
#### 2.5.1 DPPH自由基清除率
DPPH自由基清除率采用2 mL反应体系测定，含0.5 mL样品和1.5 mL DPPH工作液（100 mM）。反应在黑暗中避光进行30 min，于517 nm处测定吸光度值记为A₁。以无水乙醇代替猕猴桃酒作对照，517 nm处测定吸光度值记为A₀。最终结果按式（2）计算，以DPPH自由基清除百分比表示：
清除率（%）= [(A₁ − A₀)/A₀] × 100% （式2）
#### 2.5.2 ABTS自由基清除率
ABTS工作液通过将ABTS溶液（7 mM）与K₂S₂O₈（2.45 mM）等体积混合获得，使用前于4°C黑暗中保存12小时。ABTS工作液在734 nm处的吸光度……
【数据】样品稀释倍数：1:20（v/v）；DPPH工作液浓度：100 mM；反应时间：30 min；检测波长：517 nm；ABTS溶液：7 mM；K₂S₂O₈：2.45 mM；ABTS工作液保存：4°C，12h（注：ABTS部分原文节选在此处截断，后续步骤原文未详述）
研究结果
3.1 猕猴桃酒理化参数
表1展示了四种猕猴桃酒的理化参数。总体而言，不同发酵方案处理带来了显著差异。作为菌株生长的主要营养来源，大部分糖在酿酒过程中通过糖酵解途径转化为乙醇和其他代谢产物，所有样品在发酵结束时的残糖浓度均<4 g/L。有趣的是，最低残糖含量（3.21 g/L）和最低酒精度（11.05%，v/v）同时出现在Pk-Zr中，这可能归因于非酿酒酵母在发酵早期消耗了更多糖分。
酸被视为果酒风味的骨架，适度的酸度为口感提供清新感和纯净感。测定中，Pk-Mg表现出最高的总酸含量18.83 g/L，而Pk-Zr和Mg-Zr与Sc无显著差异。同时，三种混合方案处理组的pH均显著低于Sc组，这可能源于非酿酒酵母产生的丰富酸性代谢物。
颜色被视为感知果酒最直接的方式，决定消费者的接受或拒绝。所有猕猴桃酒的亮度、红绿度和黄蓝度与发酵方案密切相关，所有混合方案相比Sc均提高了L值并降低了a值。值得注意的是，尽管混合方案在总色差上与Sc存在显著差异，但这些差异似乎不足以肉眼可见（ΔE*<2的净差异）（Hensel et al., 2023）。
猕猴桃酒和原果汁的总酚和维生素C含量见图1a。除Pk-Zr外，所有猕猴桃酒中检测到的总酚和维生素C含量均显著高于原果汁。最高总酚含量和维生素C含量同时出现在Pk-Mg中，分别为857.65 mg GAE/L和863.58 mg/L。唯一例外是Pk-Zr中维生素C含量相比原果汁有所下降，这有待未来研究进一步探讨。
3.2 有机酸和单体酚分析
有机酸主要来源于果实和发酵过程中酵母的代谢，对猕猴桃酒的风味、颜色和化学稳定性有重要影响（Tian et al., 2024）。图1c展示了所有样品中七种有机酸的浓度。就总量而言，Pk-Mg显著增加了原果汁中的有机酸含量，而Sc、Pk-Zr和Mg-Zr显示出相似程度的下降。奎宁酸和柠檬酸是含量最丰富的两种有机酸，合计占总量的>60%，且这两种化合物在发酵前后呈现出相反的变化趋势。前者增加可能源于绿原酸在发酵环境中不稳定而发生水解（Gigl et al., 2021），后者减少则可能是因为某些菌株能通过细胞膜上的转运蛋白将柠檬酸转运至细胞内作为碳源分解利用（Assalve et al., 2024）。猕猴桃汁中的草酸和琥珀酸在发酵后显著减少，且四种接种方案之间无显著差异。尽管本发酵体系中未涉及乳酸菌，但仍观察到苹果酸略微下降和乳酸略微上升，这可能源于酵母三羧酸循环的中心代谢。酒石酸性质稳定，不易受微生物或发酵环境影响，因此被视为果酒中重要的缓冲物质（Li et al., 2023）。部分样品中酒石酸的减少可能解释为与果酒中金属离子形成络合物而沉淀。
酚类化合物已被认定为有助于猕猴桃酒口感、颜色和风味的重要生物活性物质类别（Li et al., 2022）。在四种猕猴桃酒中分析了十种单体酚，结果见图1d。总体而言，四种方案均显著提高了原果汁中多酚的总量，且混合发酵获得了更高的产量。最高总浓度出现在Pk-Mg中，为69.98 mg/L，其次是Mg-Zr（67.29 mg/L）和Pk-Zr（59.74 mg/L）。与此前研究一致（Huang et al., 2022），儿茶素是猕猴桃酒中最丰富的单体酚，也是不同样品总含量差异的主要来源。尽管所有方案均显著提高了儿茶素含量，但引入非酿酒酵母显然获得了更好的效果，这种增加可能源于非酿酒酵母更强的β-葡萄糖苷酶分泌能力所诱导的糖苷水解增强（Zhang et al., 2021）。咖啡酸和没食子酸含量分别位列第二和第三，两者在发酵后均显著增加，且四种方案之间无显著差异。数据显示，四种猕猴桃酒的咖啡酸含量范围为10.15 mg/L至11.12 mg/L，没食子酸含量范围为3.16 mg/L至3.28 mg/L。已有研究表明，果实中的槲皮素通常以糖苷状态存在，在调节血压、免疫支持和促进关节健康方面具有巨大潜力（Liu et al., 2017）。在本测定中，槲皮素未在果汁中检出，仅存在于猕猴桃酒中，这可视为发酵对果汁品质的改善。根皮苷是一种二氢查尔酮黄酮类化合物，具有降低血糖和抑制肾脏对葡萄糖重吸收的药理作用（Hou et al., 2012）。在微生物酶的作用下，根皮苷在发酵过程中被大量水解，所有猕猴桃酒中根皮素的浓度均显著增加。绿原酸、肉桂酸和阿魏酸属于酚酸类，结构上具有反应性基团而不稳定，易受高酒精度和高酸度发酵环境影响。这三种化合物的浓度在发酵后均显著增加，且增加幅度与发酵方案相关。
【数据】残糖：<4 g/L（最低3.21 g/L，Pk-Zr）；酒精度：最低11.05% v/v（Pk-Zr）；总酸：最高18.83 g/L（Pk-Mg）；总酚最高值：857.65 mg GAE/L（Pk-Mg）；维生素C最高值：863.58 mg/L（Pk-Mg）；单体酚总浓度：Pk-Mg 69.98 mg/L、Mg-Zr 67.29 mg/L、Pk-Zr 59.74 mg/L；咖啡酸：10.15–11.12 mg/L；没食子酸：3.16–3.28 mg/L
3.3 抗氧化能力分析
得益于其高维生素和酚类含量，猕猴桃酒展现出比其他果酒更强的抗氧化能力，这使其具有预防糖尿病和神经退行性疾病发展的潜力（Dutra et al., 2017）。抗氧化能力与猕猴桃酒中的生物活性物质密切相关，这些物质可通过抑制起始和断链传播来清除自由基，或通过结合金属离子、还原过氧化氢、淬灭超氧化物和单线态氧来抑制自由基形成（Du et al., 2009）。图1b总结了猕猴桃酒在DPPH自由基清除、ABTS自由基清除和羟基自由基清除活性方面的表现。总体而言，所有混合发酵方案均检测到比Sc更强的自由基清除能力。四种猕猴桃酒的DPPH清除率范围为50%–60%，ABTS清除率范围为30%–50%。值得一提的是，最高的DPPH和ABTS清除率同时出现在Pk-Mg中，这可能归因于Pk-Mg中高含量的酚类物质。而羟基自由基清除活性则略有不同。Pk-Zr……
【数据】DPPH清除率：50%–60%；ABTS清除率：30%–50%；最高DPPH和ABTS清除率：Pk-Mg（具体数值原文未详述）
3.4 挥发性化合物分析
图2展示了猕猴桃酒和猕猴桃汁中挥发性化合物浓度的热图。红色-蓝色图例表示数据的行归一化，红色代表相对较高的产量，蓝色代表相对较低的产量。"Total"图例代表挥发性化合物的总浓度。图3展示了rOAV >0.1的挥发性香气化合物与猕猴桃酒之间的PCA双标图。图4展示了不同猕猴桃酒在酒精发酵过程中关键挥发性化合物（rOAV >0.1）的演化。图5展示了不同猕猴桃酒在酒精发酵过程中关键挥发性化合物（rOAV >0.1）的损失率。
【数据】rOAV阈值：>0.1；挥发性化合物定量方式：内标定量（原文未详述具体化合物浓度数值）
讨论与解读
顺序接种非酿酒酵母组合与酿酒酵母的方案有效改善了猕猴桃酒中有机酸和单体酚的组成与浓度，显著提升了抗氧化能力。更重要的是，这些方案还增强了酒体的香气复杂度。相比单独酿酒酵母发酵，使用更复杂的发酵剂组合和接种方案获得了更高水平的酯类和醇类，赋予酒体浓郁的花果香气，并在感官分析中获得更高的总体可接受度。此外，混合发酵剂对猕猴桃酒的香气演化具有重要影响。较低的香气化合物损失率可能是酒体香气增强的主要原因。总之，通过多种本土非酿酒酵母与酿酒酵母的顺序接种优化发酵剂，可有效促进关键挥发性化合物的演化并减少酒精发酵过程中的香气损失，从而提升猕猴桃酒的香气多样性和感官品质。建议进一步研究酵母间相互作用并明确导致香气损失的具体原因，为开发更高质量的猕猴桃酒提供有价值见解。
编译者解读：本研究的关键价值在于将"菌株筛选"推进到"组合策略优化"层面——三株本土非酿酒酵母的两两组合与酿酒酵母顺序接种，形成了可比较的发酵方案矩阵。Pk-Mg方案在总酚、维生素C、有机酸和香气化合物等多个维度表现突出，提示非酿酒酵母间的协同效应可能优于单一非酿酒酵母与酿酒酵母的组合。方法上，对香气损失率的动态追踪是亮点，将香气品质从"终点结果"拓展为"过程控制"。局限在于，酵母间互作的分子机制尚未深入，且Pk-Zr中维生素C下降的现象未获解释。未来若结合代谢组学和转录组学，有望从机制层面为果酒发酵剂设计提供更系统的指导。
参考来源
Sun W. Effect of sequential fermentation with indigenous non-Saccharomyces cerevisiae combinations and Saccharomyces cerevisiae on the chemical composition and aroma compounds evolution of kiwifruit wine. Food Chemistry, 2024. DOI: 10.1016/j.foodchem.2024.140758
DOI: 10.1016/j.foodchem.2024.140758