来源：Genetic engineering and adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae for robust xylose uptake and ethanol production（Chinese Journal of Chemical Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素乙醇是替代化石燃料的重要可再生能源，但酿酒酵母天然无法高效利用木糖，且预处理产生的抑制物进一步削弱其发酵性能。本研究以耐受抑制物的酿酒酵母SPSC01-TAF94为底盘，通过过表达木糖转运与代谢相关基因（N360F、Ru-xylA、TAL1、TKL1、RKI1、RPE1）构建木糖利用菌株TAF94-X，随后在含乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛（HMF）和香兰素的不脱毒玉米秸秆水解液中进行三阶段适应性进化，最终获得木糖消耗速率达0.42 g·L⁻¹·h⁻¹、乙醇产量44.9 g·L⁻¹的优良菌株TAF94-X60。
研究背景
生物乙醇产业在保障能源安全、推动碳中和、促进环境可持续性和经济增长方面扮演关键角色。来源于木质纤维素生物质的乙醇是最重要的发酵产品，年产量约1000亿升。木质纤维素生物质包括水生植物、能源作物、森林生物质和农业残留物，是理想的碳中和可再生能源。这些生物质含有复杂糖类，其中木糖是木质纤维素水解液中含量第二丰富的糖。工业面临的一大挑战是开发能够在木质纤维素水解液中高效利用丰富糖类生产乙醇的稳健菌株。酿酒酵母天然能发酵葡萄糖但不能发酵木糖。经济可行的生物乙醇生产需要高效且完全利用水解液中的所有糖类。通常，酿酒酵母的木糖利用可通过木糖还原酶-木糖醇脱氢酶（XR-XDH）途径或木糖异构酶（XI）途径实现。XR催化木糖还原为木糖醇，偏好使用NADPH而非NADH作为辅因子；随后XDH在NAD⁺存在下将木糖醇氧化为木酮糖。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于表1。先前开发的乙酸-糠醛胁迫耐受酿酒酵母菌株SPSC01-TAF94用于基因工程改造。酵母和E. coli细胞分别在YPD和LB培养基中、30°C和37°C、旋转摇床200 r·min⁻¹条件下培养。适应性进化在水解液培养基中进行， supplemented with 10 g·L⁻¹酵母提取物、20 g·L⁻¹蛋白胨和20−60 g·L⁻¹木糖。改良菌株的摇瓶发酵评估在YPDX培养基（10 g·L⁻¹酵母提取物、20 g·L⁻¹蛋白胨、40 g·L⁻¹木糖和80 g·L⁻¹葡萄糖）和YPX培养基（10 g·L⁻¹酵母提取物、20 g·L⁻¹蛋白胨和40 g·L⁻¹木糖）中进行。细胞以甘油储备液（终浓度30%（体积比））保存于−80°C。
【数据】培养基：YPD/LB/水解液培养基/YPDX/YPX；温度：30°C（酵母）/37°C（E. coli）；转速：200 r·min⁻¹；甘油储备液浓度：30%（体积比）；保存温度：−80°C
2.2 酿酒酵母木糖利用能力的基因工程改造
如表1所示，首先将编码牛瘤胃木糖异构酶的三个Ru-xylA表达盒整合到PHO13位点，在酿酒酵母SPSC01-TAF94中构建木糖代谢途径。为增强木糖代谢，在GRE3位点过表达磷酸戊糖途径的四个关键基因TAL1、TKL1、RKI1和RPE1。此外，通过将天然启动子替换为强启动子TEF1p，过表达编码木酮糖激酶的天然基因XKS1。为进一步提高木糖异构酶活性，在δ序列位点进行了三轮Ru-xylA表达盒整合。最后，将来源于Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260基因组中克隆的转运蛋白Mgt05196p衍生突变体N360F整合到GRE3位点。同时，为增强N360F的表达，在其启动子上游添加了三个UASCLB（上游激活序列，激活基因CLB2）元件。由此，耐受抑制物的菌株TAF94被基因工程改造为木糖利用菌株TAF94-X，该菌株进一步用于下述三阶段适应性进化。
【数据】整合位点：PHO13、GRE3、δ序列；过表达基因：Ru-xylA（3拷贝）、TAL1、TKL1、RKI1、RPE1、XKS1（TEF1p启动子）；转运蛋白：N360F（源自Mgt05196p）；UASCLB元件：3个
2.3 不脱毒酸预处理玉米秸秆水解液的制备
玉米秸秆（CS）经干燥并过80目（0.18 nm）筛获得细粉。随后，10% CS在120°C下用1%（体积比）H₂SO₄溶液处理90 min。CS水解液通过真空过滤分离，用1 mol·L⁻¹ NaOH溶液将pH调至5.5。不脱毒水解液的组成通过HPLC分析确定，随后储存于4°C，必要时添加木糖或木糖/葡萄糖用于发酵。
【数据】CS浓度：10%；硫酸浓度：1%（体积比）；温度：120°C；时间：90 min；pH：5.5（用1 mol·L⁻¹ NaOH调节）；储存温度：4°C
2.4 木糖利用菌株在CS水解液中的三阶段适应性进化
基因工程菌株进一步用于适应性进化以提升其木糖利用能力，以不脱毒CS水解液为基础培养基，分别添加10 g·L⁻¹酵母提取物和20 g·L⁻¹蛋白胨，以及20、40和60 g·L⁻¹木糖作为主要碳源。为适应环境，工程菌株TAF94-X在YPD培养基中、30°C、200 r·min⁻¹条件下培养12 h。在第一阶段适应性进化中，细胞以2%（体积比）接种量（初始OD600为0.5−0.6）接种到含20 g·L⁻¹木糖、10 g·L⁻¹酵母提取物和20 g·L⁻¹蛋白胨的不脱毒CS水解液中培养24 h。随后进行15代适应性进化，从YPD琼脂平板中分离最佳适应菌株，该菌株进一步用于第二阶段适应性进化（15代），使用含高达40 g·L⁻¹木糖的不脱毒CS水解液。类似地，第三阶段适应性进化（15代）通过将第二阶段获得的最佳菌落接种到含高达60 g·L⁻¹木糖的不脱毒CS水解液中启动。每个阶段适应性进化后获得的菌株分别命名为TAF94-X20、TAF94-X40和TAF94-X60。每个阶段适应结束时，取细胞进行评估并保存于−180°C。
【数据】接种量：2%（体积比）；初始OD600：0.5−0.6；第一阶段：20 g·L⁻¹木糖、24 h、15代；第二阶段：40 g·L⁻¹木糖、15代；第三阶段：60 g·L⁻¹木糖、15代；培养条件：30°C、200 r·min⁻¹；保存温度：−180°C
2.5 合成培养基和木质纤维素水解液中的评估
适应菌株在含高达40 g·L⁻¹木糖（YPX）或80 g·L⁻¹葡萄糖和40 g·L⁻¹木糖混合糖（YPDX）的合成培养基中，于30°C、200 r·min⁻¹条件下评估48–72 h。使用不脱毒CS水解液的发酵也在30°C下进行72 h，工作体积50 ml，接种量2%。水解液分别补充10 g·L⁻¹酵母提取物、20 g·L⁻¹蛋白胨、40 g·L⁻¹木糖和80 g·L⁻¹葡萄糖。所有实验均设两次重复，定期收集样品分析光密度（OD）、残余糖和乙醇。
【数据】合成培养基评估：30°C、200 r·min⁻¹、48–72 h；水解液发酵：30°C、72 h、工作体积50 ml、接种量2%；重复次数：2次
2.6 分析方法
培养期间按适当间隔收集样品，以12000 r·min⁻¹离心5 min。上清液用0.22 μm无菌滤膜过滤。木糖、葡萄糖和乙醇浓度用HPLC分析。光密度（OD）用UV-VIS分光光度计在600 nm波长下测定，作为细胞生长指标。糖的乙醇产率（g·g⁻¹）按峰值乙醇浓度除以消耗的糖量计算。统计分析使用GraphPad Prism 6软件进行。
【数据】离心：12000 r·min⁻¹、5 min；滤膜：0.22 μm；OD测量波长：600 nm；分析软件：GraphPad Prism 6
研究结果
3.1 木糖利用菌株TAF94-X的构建与评估
为考察不同条件下的木糖发酵能力，使用工程菌株TAF94-X分别以40 g·L⁻¹木糖、混合糖（40 g·L⁻¹木糖和80 g·L⁻¹葡萄糖）以及补充木糖或混合糖的不脱毒CS水解液进行了数次分批发酵。TAF94-X在木糖和木糖/葡萄糖培养基中的最大OD600分别为4.5和5.8，其中TAF94-X在木糖培养基中从25.2 g·L⁻¹木糖产生9.0 g·L⁻¹乙醇，产率为0.36 g·g⁻¹；在木糖/葡萄糖培养基中从19.6 g·L⁻¹木糖和80 g·L⁻¹葡萄糖产生41.0 g·L⁻¹乙醇，产率为0.41 g·g⁻¹。近期，一株木糖利用酵母SA-1(XR/XDH)通过CRISPR-Cas9成功工程化，使用三基因盒将来自Scheffersomyces stipitis的三种异源酶（包括木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶）表达于URA3位点。然而，其最大OD600检测为1.5，远低于TAF94-X在木糖培养中检测到的值，表明TAF94-X的木糖摄取更为活跃，因此对细胞生长贡献更大。当使用补充高达40 g·L⁻¹木糖的不脱毒CS水解液时，TAF94-X从21.6 g·L⁻¹木糖产生7.4 g·L⁻¹乙醇，产率为0.34 g·g⁻¹；而使用补充40 g·L⁻¹木糖和80 g·L⁻¹葡萄糖的水解液时，从15.0 g·L⁻¹木糖和80 g·L⁻¹葡萄糖获得36.5 g·L⁻¹乙醇，产率为0.38 g·g⁻¹，表明TAF94-X的木糖转运和代谢在葡萄糖和预处理衍生抑制物存在下仍然受限。这一结果与表达氧化还原酶途径的菌株MEC1121相当，后者在YP培养基混合糖发酵中实现了0.31−0.34 g·g⁻¹的乙醇产率。类似地，酿酒酵母MA-R4通过整合XYL1和XYL2（编码来自S. stipitis的XR和XDH）以及XKS1（编码PGK启动子下的XK）进行工程化。该菌株进一步通过将消化的质粒pAUR-XKXDHXR整合到IR-2的aur1位点构建，在混合糖发酵（45 g·L⁻¹葡萄糖和45 g·L⁻¹木糖）中产生了较低的乙醇产率（0.40 g·g⁻¹）。木糖异构酶（XI）途径在增强木糖利用方面的有效性也在诸如酿酒酵母INVSc1/pHM368-PADH1-xylA等菌株中得到体现，其中由ADH1启动子驱动的xylA实现了葡萄糖和木糖的共发酵，在最佳实验室条件下达到0.38 g·g⁻¹的产率。然而，当使用不脱毒蔗渣水解液时，该产率降至0.25 g·g⁻¹。类似地，来自S. stipitis的XR和XDH基因被整合到菌株LVY103中，使其能够代谢木糖并产生乙醇。LVY103在混合糖发酵中实现了相对较低的乙醇产率0.20 g·g⁻¹。在去除URA3标记并整合木酮糖激酶（XKS1）基因后，所得菌株LVY123的乙醇产率提高了70%，达到0.34 g·g⁻¹。实现XR、XDH和XKS1的平衡表达对于重组木糖利用酿酒酵母菌株减少副产物产生和提高乙醇产率至关重要。一项显著进展是将GRE3、SOR1和XKS1基因整合到CEN.PK2-1C和K7菌株的AUR1位点。在50 g·L⁻¹木糖的批式发酵中，所得突变菌株CEN-XYL和K7-XYL分别产生7.1和12.2 g·L⁻¹乙醇，产率分别为0.25和0.22 g·g⁻¹。在使用80 g·L⁻¹葡萄糖和50 g·L⁻¹木糖的乙醇发酵中，最终实现了更高的乙醇产率，CEN-XYL为0.39 g·g⁻¹，K7-XYL为0.37 g·g⁻¹。该研究表明，内源木糖同化基因的组合在木糖发酵中表现出足够的活性。为进一步提高木糖摄取，以木糖利用菌株TAF94-X为对象，设计并进行了以木糖为碳源的不脱毒水解液三阶段适应性进化。
【数据】TAF94-X最大OD600：4.5（木糖）/5.8（木糖+葡萄糖）；木糖培养基产乙醇：9.0 g·L⁻¹（消耗25.2 g·L⁻¹木糖，产率0.36 g·g⁻¹）；混合糖培养基产乙醇：41.0 g·L⁻¹（消耗19.6 g·L⁻¹木糖+80 g·L⁻¹葡萄糖，产率0.41 g·g⁻¹）；不脱毒水解液（40 g·L⁻¹木糖）产乙醇：7.4 g·L⁻¹（消耗21.6 g·L⁻¹木糖，产率0.34 g·g⁻¹）；不脱毒水解液（40 g·L⁻¹木糖+80 g·L⁻¹葡萄糖）产乙醇：36.5 g·L⁻¹（消耗15.0 g·L⁻¹木糖+80 g·L⁻¹葡萄糖，产率0.38 g·g⁻¹）
3.2 适应菌株木糖利用和乙醇生产能力分析
为提高TAF94-X的木糖利用性能，进一步使用分别含高达20、40和60 g·L⁻¹木糖作为唯一碳源的不脱毒水解液进行适应性进化，获得适应菌株TAF94-X20、TAF94-X40和TAF94-X60。所有菌株首先在含高达40 g·L⁻¹木糖的合成培养基（SMX）中测试（见图1和表2）。在48 h发酵内，适应菌株TAF94-X20、TAF94-X40和TAF94-X60分别消耗了73%、81.3%和90%的木糖，而TAF94-X仅消耗63%的木糖。相应地，TAF94-X20、TAF94-X40和TAF94-X60给出了更高的OD600，分别为5.5、6.3和7.2，高于TAF94-X检测到的4.5（图1(a)）。据报道，适应酵母E7-403在木糖/葡萄糖培养中达到了相当的峰值OD600 6.6。经过三阶段适应性进化后，与其亲本菌株TAF94-X相比，木糖摄取和乙醇生产均获得了显著改善。适应菌株TAF94-X20、TAF94-X40和TAF94-X60的木糖消耗速率分别提高至0.61、0.68和0.75 g·L⁻¹·h⁻¹，而对照菌株TAF94-X为0.53 g·L⁻¹·h⁻¹。根据一项先前的研究，酵母yYST12经过第一阶段和第二阶段适应性进化后，以木糖为唯一碳源时，所得适应菌株的木糖消耗速率进一步提高至0.108和0.243 g·L⁻¹·h⁻¹。在一项类似研究中，基因工程木糖利用菌株SA-1(XR/XDH)给出了0.67 g·L⁻¹·h⁻¹的木糖消耗速率，表明适应性进化对提高木糖摄取具有重要意义。最终，在这三个适应菌株中，TAF94-X60产生了14.6 g·L⁻¹乙醇，产率最高达0.41 g·g⁻¹，而对照菌株TAF94-X获得的乙醇为9.0 g·L⁻¹，产率为0.36 g·g⁻¹（图1(b)和(c)）。适应性进化已被广泛接受为从木糖提高乙醇产率的有效方法。它还可以改善多种表型，包括对有毒产物、pH和温度的耐受性，同时拓宽可用碳源的范围。适应菌株TAF94-X60实现的乙醇产率高达0.41 g·g⁻¹，高于以往报道的菌株。例如，一株工程木糖利用酵母MA-R4用40 g·L⁻¹木糖适应了30代，获得菌株MA-B4，其乙醇产率提高至0.34 g·g⁻¹-木糖，而对照菌株为0.27 g·g⁻¹-木糖。在另一项研究中，重组木糖利用酵母TMB3399在好氧、限氧和厌氧条件下分别经过三阶段适应性进化后，乙醇产率为0.25 g·g⁻¹-木糖，而其亲本菌株TMB3400为0.21 g·g⁻¹-木糖。Jeong等人通过过表达氧化还原酶途径和异构酶途径开发了两株工程酵母。在使用含40和100 g·L⁻¹木糖的合成培养基进行两阶段适应性进化后，所得菌株XYL123e和XI-XYL3e在木糖培养中给出了更高的乙醇产率，分别为0.27和0.37 g·g⁻¹，而其亲本菌株XYL123和XI-XYL3分别为0.26和0.29 g·g⁻¹。如表3所列，本研究中TAF94-X60获得的0.41 g·g⁻¹乙醇产率在已报道的各种酵母木糖培养中表现出色。定点突变、交配、进化工程和单倍体化等方法已被联合用于开发活跃的木糖利用菌株。单倍体菌株KFG4-6B被工程化以过表达木酮糖激酶（XK）和来自Scheffersomyces stipitis的XR/XDH。
【数据】48 h木糖消耗率：TAF94-X20 73%、TAF94-X40 81.3%、TAF94-X60 90%、TAF94-X 63%；最大OD600：TAF94-X20 5.5、TAF94-X40 6.3、TAF94-X60 7.2、TAF94-X 4.5；木糖消耗速率：TAF94-X20 0.61 g·L⁻¹·h⁻¹、TAF94-X40 0.68 g·L⁻¹·h⁻¹、TAF94-X60 0.75 g·L⁻¹·h⁻¹、TAF94-X 0.53 g·L⁻¹·h⁻¹；乙醇产量：TAF94-X60 14.6 g·L⁻¹（产率0.41 g·g⁻¹）、TAF94-X 9.0 g·L⁻¹（产率0.36 g·g⁻¹）
讨论与解读
本研究证实，基因工程与适应性进化的联合策略是提高酿酒酵母木糖摄取和乙醇生产的有效途径。首先通过过表达木糖转运和代谢相关基因对酿酒酵母SPSC01-TAF94进行工程改造，随后在不脱毒富含木糖的水解液中进行三阶段适应。所得活跃木糖利用和高产乙醇菌株TAF94-X60在不脱毒水解液培养中产生了44.9 g·L⁻¹乙醇，产率为0.41 g·g⁻¹，而对照菌株TAF94-X为36.5 g·L⁻¹和0.38 g·g⁻¹。所展示的联合策略可以在无需物理化学脱毒或水洗过程的情况下充分利用木质纤维素水解液，表明其在经济可行和可持续的大规模木质纤维素乙醇生产中具有巨大潜力。
编译者解读
该研究的技术路线具有清晰的递进逻辑：基因工程解决"能不能用木糖"的问题，适应性进化解决"用得好不好"的问题。六基因过表达加三阶段进化的组合策略，使木糖消耗速率从0.53提升至0.75 g·L⁻¹·h⁻¹（合成培养基），在不脱毒真实水解液中乙醇产量从36.5提升至44.9 g·L⁻¹，提升幅度约23%。值得注意的是，该策略直接跳过脱毒步骤，这对降低木质纤维素乙醇的工艺成本具有直接产业价值。一个潜在局限是：三阶段进化共45代，耗时较长，工业化放大时需权衡时间成本。此外，菌株在更高木糖浓度（>60 g·L⁻¹）或更高抑制物负荷下的表现原文未详述，值得后续探究。
参考来源
Rehman O. Genetic engineering and adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae for robust xylose uptake and ethanol production. Chinese Journal of Chemical Engineering, 2025. DOI: 10.1016/j.cjche.2025.06.034
DOI: 10.1016/j.cjche.2025.06.034