来源：Adaptive evolution of industrial Saccharomyces cerevisiae strains for improved glycerol utilization and optimization of key process parameters in bioreactors（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甘油是工业发酵中廉价且丰富的碳源，但工业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因生理和代谢限制通常无法高效利用甘油。本研究对未经基因工程改造的工业酿酒酵母菌株施加适应性进化（AE），以pH为生物反应器规模发酵的选择压力。经过152代进化，Strain3菌株在20 g L⁻¹甘油浓度下最大比生长速率从0.05 h⁻¹提升至0.24 h⁻¹，并实现了对甘油的显著消耗。该研究首次对甘油适应菌株与野生型进行比较基因组分析，揭示了1254个独特变异，为理解酵母甘油代谢的适应性机制提供了新视角。
研究背景
酿酒酵母长期被视为最"驯化"的真核微生物，广泛应用于传统发酵到现代生物技术的多个领域，包括生物燃料生产、食品与饲料添加剂、酶合成以及药物和疫苗的细胞工厂。糖蜜作为甜菜或甘蔗制糖的副产物，因丰富且廉价而广泛用于面包酵母生产，主要含蔗糖（30–35%）、果糖和葡萄糖（10–25%）、非糖化合物（2–3%）、矿物质、水分及可发酵糖（45–55%）。然而，需求增长导致其成本上升，促使研究者寻找替代性碳源。
甘油作为微生物发酵、石化和生物柴油生产的副产物，具有廉价且可再生的特点。生物柴油行业每生产1立方米生物柴油约产生0.1立方米甘油。尽管甘油潜力巨大，酿酒酵母却几乎无法利用它——这成为工业应用的关键瓶颈。已有研究尝试通过基因改造克服此限制，而本研究选择适应性实验室进化（AE）作为替代策略，聚焦于pH作为生物反应器规模发酵中的选择压力。
研究方法
2.1 材料、微生物与培养参数
本研究使用来自PAKMAYA工业菌种保藏中心的9株不同酿酒酵母分离株（Strain1至Strain9）和24株突变菌株（M1S1、M1S2、M1S3、M1S4、M1S5、M1S6、M1S10、M1S11、M2S1、M2S2、M2S3、M2S4、M2S5、M2S6、M2S10、M2S11、M3S1、M3S2、M3S3、M3S4、M3S5、M3S6、M3S10和M3S11）。菌株编号对应保藏中心标识，每个编号代表一个独立菌株。编号中的空缺反映保藏中心中未纳入本研究的菌株，保留原始编号以确保可追溯性和与保藏中心记录的一致性。
在适应性进化实验前，所有菌株经过初步筛选以评估其在葡萄糖和甘油上的生长性能。菌株首先在YM肉汤中培养以评估其葡萄糖活性，随后在YNB/甘油培养基中培养以评估其在甘油上的生长能力。来自斜面YPG琼脂（10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹蛋白胨、20 g L⁻¹葡萄糖和20 g L⁻¹琼脂）和YPM琼脂（10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹蛋白胨、20 g L⁻¹麦芽糖和20 g L⁻¹琼脂）的所有菌株均在含1.7 g L⁻¹酵母氮碱、5.0 g L⁻¹硫酸铵和20 g L⁻¹甘油的YNB/甘油培养基中、15 mL Falcon管中维持。对照组为来自斜面琼脂的相同菌株，在含3.0 g L⁻¹酵母提取物、3.0 g L⁻¹麦芽提取物、5.0 g L⁻¹蛋白胨和10 g L⁻¹葡萄糖的YM肉汤培养基中、15 mL Falcon管中维持。培养物在旋转摇床上于30°C、160 rpm条件下孵育。制备甘油储备液时，将甘油溶液加入培养基至终浓度30%（v/v），并在−20°C和−80°C下储存于1.5 mL冷冻管中。
【数据】培养基：YPG琼脂（10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹蛋白胨、20 g L⁻¹葡萄糖、20 g L⁻¹琼脂）、YPM琼脂（10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹蛋白胨、20 g L⁻¹麦芽糖、20 g L⁻¹琼脂）、YNB/甘油（1.7 g L⁻¹酵母氮碱、5.0 g L⁻¹硫酸铵、20 g L⁻¹甘油）、YM肉汤（3.0 g L⁻¹酵母提取物、3.0 g L⁻¹麦芽提取物、5.0 g L⁻¹蛋白胨、10 g L⁻¹葡萄糖）；温度：30°C；转速：160 rpm；甘油储备液浓度：30%（v/v）；储存温度：−20°C和−80°C
#### 2.1.1 所选酿酒酵母菌株在葡萄糖上的生长曲线
检测各菌株在葡萄糖环境中的生长曲线。将Falcon管中的预培养物以初始光密度（OD）约0.1（600 nm）接种至含25 mL YM肉汤培养基（含3.0 g L⁻¹酵母提取物、5.0 g L⁻¹蛋白胨、3.0 g L⁻¹麦芽提取物和10 g L⁻¹葡萄糖）的250 mL Erlenmeyer摇瓶中。摇瓶实验在旋转摇床上于30°C、160 rpm条件下进行，三次重复。同时，将Erlenmeyer摇瓶中制备的培养物转移至48孔板中。通过Varioskan Lux多功能酶标仪（Thermo Scientific）测定OD600值评估生长曲线。孵育期间培养物中葡萄糖含量的变化使用高效液相色谱（HPLC）（Agilent Technologies，1260 Infinity）监测。
【数据】培养基：YM肉汤（3.0 g L⁻¹酵母提取物、5.0 g L⁻¹蛋白胨、3.0 g L⁻¹麦芽提取物、10 g L⁻¹葡萄糖）；接种OD600：约0.1；温度：30°C；转速：160 rpm；培养体积：25 mL/250 mL摇瓶；重复次数：3次；检测仪器：Varioskan Lux多功能酶标仪、Agilent 1260 Infinity HPLC
#### 2.1.2 所选酿酒酵母菌株在甘油上的生长曲线
检测各菌株在甘油环境中的生长曲线。将Falcon管中的预培养物以初始OD600约0.1接种至含25 mL YNB/甘油培养基的250 mL Erlenmeyer摇瓶中。摇瓶实验在旋转摇床上于30°C、160 rpm条件下进行，三次重复。同时，将Erlenmeyer摇瓶中制备的培养物转移至48孔板中。基于Varioskan Lux多功能酶标仪获得的OD600值评估生长曲线。菌株生长曲线根据Varioskan Lux多功能酶标仪软件的OD600值生成。孵育期间培养物中甘油浓度的变化通过HPLC监测。
【数据】培养基：YNB/甘油；接种OD600：约0.1；温度：30°C；转速：160 rpm；培养体积：25 mL/250 mL摇瓶；重复次数：3次；检测方法：Varioskan Lux酶标仪、HPLC
2.2 所选菌株对甘油的适应性进化
根据筛选结果，选择四个菌株（Strain3、M3S3、Strain4和M3S4）进行初始适应研究。预培养物（YNB/甘油中）孵育24小时。随后，培养和初始适应在Verduyn等人描述的明确矿物培养基中进行，该培养基含3.0 g L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、3.0 g L⁻¹ KH₂PO₄、0.5 g L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、40 mg L⁻¹ ZnSO₄·7H₂O、0.5 mg L⁻¹ CoCl₂·6H₂O、3.8 mg L⁻¹ MnSO₄·H₂O、0.9 mg L⁻¹ CuSO₄·5H₂O、23 mg L⁻¹ CaCl₂·2H₂O、23 mg L⁻¹ (NH₄)₂Fe(SO₄)₆·6H₂O、0.06 mg L⁻¹ Na₂MoSO₄·2H₂O、3.0 mg L⁻¹ H₃BO₃、3.0 g L⁻¹ Na₂HPO₄·12H₂O和1.0 g L⁻¹谷氨酸钠[29]，甘油以终浓度20 g L⁻¹引入。矿物培养基用正磷酸调至pH 4.0[10]。培养基灭菌后，加入过滤除菌的维生素溶液，含0.012 mg L⁻¹生物素、5.0 mg L⁻¹泛酸盐、5.0 mg L⁻¹烟酸、125 mg L⁻¹肌醇、5.0 mg L⁻¹硫胺素、5.0 mg L⁻¹吡哆醇和1.0 mg L⁻¹对氨基苯甲酸。孵育在旋转摇床上于30°C、160 rpm条件下进行。初始适应在含25 mL矿物培养基的250 mL Erlenmeyer摇瓶中进行。初始适应阶段，培养物在孵育期结束后在相同条件下转移至新鲜培养基。此转移过程在相同条件下重复三次。生长曲线通过Varioskan Lux多功能酶标仪评估，甘油量通过HPLC监测。第一次适应后的培养物用于接种1 L Erlenmeyer摇瓶以扩大体积并确定最佳甘油浓度。此阶段测试了五个甘油浓度（20、40、60、80和100 g L⁻¹），所有实验三次重复。适应阶段，培养物每96小时孵育期后转移至新鲜培养基，此过程在相同条件下共重复21次连续传代。使用Varioskan Lux多功能酶标仪评估生长，计算各菌株的最大比生长速率（μmax）。在适应研究确定的不同甘油浓度发酵过程中定量甘油利用量。
【数据】培养基：Verduyn矿物培养基（3.0 g L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、3.0 g L⁻¹ KH₂PO₄、0.5 g L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、40 mg L⁻¹ ZnSO₄·7H₂O、0.5 mg L⁻¹ CoCl₂·6H₂O、3.8 mg L⁻¹ MnSO₄·H₂O、0.9 mg L⁻¹ CuSO₄·5H₂O、23 mg L⁻¹ CaCl₂·2H₂O、23 mg L⁻¹ (NH₄)₂Fe(SO₄)₆·6H₂O、0.06 mg L⁻¹ Na₂MoSO₄·2H₂O、3.0 mg L⁻¹ H₃BO₃、3.0 g L⁻¹ Na₂HPO₄·12H₂O、1.0 g L⁻¹谷氨酸钠）；甘油浓度：20 g L⁻¹（初始适应）、20–100 g L⁻¹（浓度测试）；pH：4.0；温度：30°C；转速：160 rpm；适应时间：96 h/传代（初始）、144 h/传代（连续传代）；传代次数：3次（初始）、21次（连续传代）；维生素溶液：0.012 mg L⁻¹生物素、5.0 mg L⁻¹泛酸盐、5.0 mg L⁻¹烟酸、125 mg L⁻¹肌醇、5.0 mg L⁻¹硫胺素、5.0 mg L⁻¹吡哆醇、1.0 mg L⁻¹对氨基苯甲酸
2.3 底物分析
发酵样品采集后用0.45 µm亲水性针式过滤器（Sartorius Minisart RC）过滤。上清液使用HPLC分析。具体而言，HPLC（Agilent 110系列）配备Shodex SH 1011糖柱（8.0 × 300 mm），柱温维持在50°C，配折射率检测器。0.005 M硫酸溶液作为流动相，恒定流速0.8 mL min⁻¹。蔗糖和甘油浓度根据色谱图峰面积及蔗糖（0.1–8.0 g L⁻¹）和甘油（0.1–8.0 g L⁻¹）标准品的校准曲线确定。
【数据】过滤膜：0.45 µm亲水性针式过滤器；色谱柱：Shodex SH 1011糖柱（8.0 × 300 mm）；柱温：50°C；检测器：折射率检测器；流动相：0.005 M硫酸；流速：0.8 mL min⁻¹；标准曲线范围：蔗糖0.1–8.0 g L⁻¹、甘油0.1–8.0 g L⁻¹
2.4 摇瓶中发酵参数的确定
为确定适应后酿酒酵母菌株发酵的最佳pH，在Erlenmeyer摇瓶中于初始pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0条件下进行实验。培养物在这些条件下培养，每个pH水平三次重复。生长曲线通过转移至孔板的培养物同步监测，使用Varioskan Lux多功能酶标仪测定。孵育97小时后记录培养物的最终pH值。使用酶标仪获得的生长曲线计算µmax值。这些数据用于评估初始pH与给定实验条件下微生物生长性能之间的关系。
【数据】初始pH范围：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；重复次数：3次/组；孵育时间：97 h；检测方法：Varioskan Lux酶标仪
2.5 台式生物反应器中的分批培养
分批培养实验在3-L Sartorius Biostat A和B生物反应器（Sartorius Stedim Systems GmbH）中进行。这些实验旨在研究pH对...
图1 | 四株酿酒酵母菌株的甘油消耗。Strain3（绿色柱）、Strain4（蓝色柱）、M3S3（黑色柱）和M3S4（红色柱）在含20 g L⁻¹初始甘油的矿物培养基中的初始适应期表现。数据为三次独立实验的平均值±标准差。
研究结果
3.1 基于葡萄糖和甘油活性的菌株筛选
使用Varioskan Lux多功能酶标仪对9株不同天然酿酒酵母菌株的葡萄糖利用能力进行了发酵实验评估。所有菌株在10 g L⁻¹葡萄糖条件下培养时表现出相似的生长模式，表明在给定条件下葡萄糖利用能力是保守的（图S1a）。然而，当甘油作为唯一碳源时未观察到生长（图S1b）。在葡萄糖上高效生长的菌株在20 g L⁻¹甘油浓度下培养时均未显示任何生长。此外，来自PAKMAYA菌种保藏中心的24株突变菌株得到相似结果，均未在甘油上显示生长（图S1c）。这些发现共同表明，野生型和突变型酿酒酵母菌株在给定条件下均缺乏有效利用甘油的内在代谢能力。这一限制与先前报道的酿酒酵母中甘油利用途径缺失或活性不足的研究一致，可能是由于关键基因表达有限[9]。虽然已有研究采用基因改造克服此瓶颈[14,19,24]，本研究聚焦于适应性实验室进化作为增强甘油利用的替代策略。
【数据】菌株数：9株天然+24株突变；葡萄糖浓度：10 g L⁻¹；甘油浓度：20 g L⁻¹；结果：所有菌株在甘油上无生长
3.2 适应期间所选菌株的甘油消耗
基于3.1节所述筛选实验（图S1），选择四株酿酒酵母（Strain3、Strain4、M3S3和M3S4）进行适应性进化研究。这些菌株作为PAKMAYA菌种保藏中心中具有代表性工业分离株和突变衍生物，在筛选条件下葡萄糖生长相当但甘油上无检测到生长。为评估甘油作为所选酿酒酵母菌株生长碳源的潜力，按照2.2节所述适应条件进行培养实验。初始适应阶段，菌株每96小时在对数中期重复转移至相同条件下的新鲜矿物培养基中。每次转移后测定甘油消耗量。根据HPLC结果，初始适应阶段的甘油消耗显示所有菌株在连续传代中甘油摄取能力逐步提高（图1）。
图2 | 十三株酿酒酵母Strain3通过连续传代对不同初始甘油浓度的适应。数据为三次独立生物学重复的平均值±标准差。（a）20 g L⁻¹甘油浓度。（b）60 g L⁻¹甘油浓度。（c）100 g L⁻¹甘油浓度。
20 g L⁻¹甘油的初始适应实验后，使用更高初始甘油浓度（20、40、60、80和100 g L⁻¹）在2.2节所述适应条件下进行体积扩大实验。因此，适应研究以四株不同菌株在五个不同初始甘油浓度下进行，共创建20种不同适应条件。每144小时在不同甘油浓度的矿物培养基中传代培养细胞，共进行21次转移（152代）。适应过程中根据观察到的菌株特异性差异——包括适应稳定性、生长进展和培养连续性——细化各菌株的甘油浓度选择，反映甘油耐受性、渗透压应激反应和代谢适应能力的差异。特别地，Strain3在低甘油浓度下表现出稳健生长，但需要更高的选择压力（100 g L⁻¹）来巩固甘油利用能力；而Strain4在100 g L⁻¹时受抑制，但在40至80 g L⁻¹之间表现出稳定的适应轨迹。整个连续传代过程中通过HPLC分析甘油消耗。
然而，七株菌株在连续传代过程中被污染，因此从研究的这些阶段中排除。如图2和图S3所示，四株酵母菌株在连续传代后甘油消耗均呈渐进性增加，凸显了适应性进化在增强以甘油为主要碳源的代谢能力方面的有效性。特别是，矿物培养基中反复传代促进了菌株的生理适应，表现为底物利用随时间增加。该观察结果与先前报道一致，即适应性进化策略使微生物群体在长期暴露下提高底物利用效率[30,31]。
在较低初始甘油浓度（20 g L⁻¹和40 g L⁻¹）下，菌株间适应通过连续传代更为均匀地推进，与较高初始甘油浓度相比甘油利用率稳步增加（图2a、S3a和S3b）。在所有测试菌株中，酿酒酵母Strain3效率最高，在144小时培养后消耗了20 g L⁻¹甘油中的12.83 g L⁻¹。在40 g L⁻¹初始甘油浓度下，酿酒酵母M3S4显示逐渐的甘油消耗模式，144小时后消耗10.8 g L⁻¹，低于20 g L⁻¹时的水平。这些结果表明较低底物浓度可能通过减少渗透压应激促进快速适应——已知高浓度渗透压会抑制膜转运和酶功能[32]。
图3 | 酿酒酵母Strain3最大比生长速率（µmax, h⁻¹）的变化。数值表示为含20 g L⁻¹甘油培养基中连续传代次数的函数（Adp：适应，T：传代）。数据为三次独立生物学重复的平均值±标准差。
在60 g L⁻¹初始甘油浓度下，酿酒酵母Strain3和M3S3表现出最高消耗速率，分别为60 g L⁻¹甘油中的9.9 g L⁻¹和10.0 g L⁻¹，而Strain4和M3S4值较低，分别为60 g L⁻¹甘油中的9.6 g L⁻¹和9.5 g L⁻¹，表明该浓度下适应具有菌株依赖性（图S3c）。当初始甘油浓度增加至80 g L⁻¹时（图S3d），M3S3持续稳步增加甘油消耗，而Strain4和M3S4初始消耗较低但后期达到相似水平，表明适应过程慢得多。适应过程结束时，Strain4、M3S3和M3S4分别消耗了80 g L⁻¹甘油中的9.2 g L⁻¹、9.3 g L⁻¹和9.6 g L⁻¹。在100 g L⁻¹下，Strain3（图2c）和M3S3（图S3e）表现出最高甘油消耗，分别为100 g L⁻¹甘油中的9.7 g L⁻¹和9.5 g L⁻¹，紧随其后的是M3S4消耗100 g L⁻¹中的9.3 g L⁻¹，表现出对高甘油浓度的增强耐受性。
尽管在所有浓度下均成功适应，最高底物消耗出现在20 g L⁻¹下，由Strain3实现，最大利用率为64.2%。相比之下，随着甘油浓度增加，底物消耗率逐渐下降，在40、60、80和100 g L⁻¹甘油浓度下分别记录为27%、16.7%、12%和9.7%。培养基中初始甘油浓度与其被细胞消耗之间的这种反比关系表明，升高的甘油浓度可能对微生物代谢产生抑制效应[10,32]。Strain3在高甘油浓度下表现出优越的适应性，可能经历了菌株特异性调控变化，可能涉及负责甘油转运的基因（如STL1、FPS1）或中心碳代谢基因（如GUT1）的上调，正如先前酵母代谢工程研究所述[33,34]。这些发现表明较高甘油浓度支持适应，但不一定确保高效的底物利用。因此，后续研究使用Strain3进行——其在20 g L⁻¹初始甘油浓度下表现出最高利用率。
图4 | 不同初始pH值对酿酒酵母Strain3发酵能力的影响。数据为三次独立生物学重复的平均值±标准差。（a）以光密度（OD）表示的生长：pH 3.0（黑色）、pH 3.5（红色）、pH 4.0（蓝色）、pH 4.5（绿色）、pH 5.0（紫色）...
3.3 初始pH对发酵性能的影响
为确定最佳初始pH，在初始pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0条件下培养适应后的Strain3。孵育97小时后记录最终pH值并计算µmax值。不同初始pH条件下的生长曲线显示，pH 4.0时菌株表现出最佳生长性能（图4）。pH值低于或高于4.0时，生长速率均有所下降。这一结果表明，pH 4.0是该适应菌株发酵的最佳初始pH条件。
图5 | 甘油适应Strain3（红色）与野生型菌株（黑色）底物消耗动力学比较。发酵培养基中蔗糖作为唯一碳源（4.0 g L⁻¹，实心标记）和甘油作为唯一碳源（20 g L⁻¹，空心标记）。数据为三次独立实验的平均值±标准差。
3.4 生物反应器中的分批发酵
在3-L搅拌罐生物反应器中进行了分批培养实验，以研究pH控制对Strain3发酵性能的影响。实验在20 g L⁻¹初始甘油浓度和初始pH 4.0条件下进行48小时。在不控制pH的条件下（图6a），甘油消耗缓慢，pH逐渐下降。在pH控制条件下（图6b），以两种不同初始细胞浓度进行实验，所有发酵均在pH恒定维持在4.0时于30小时内实现甘油的完全消耗。较高的初始细胞浓度导致更快的甘油消耗，凸显了接种量在发酵性能中的重要作用。
图6 | 酿酒酵母Strain3在3-L搅拌罐生物反应器中48小时内的生长和甘油消耗，初始甘油浓度20 g L⁻¹、初始pH 4.0。（a）不控制pH条件（甘油：红色，干重（DW）：黑色，pH：绿色）。（b）pH控制条件，初始光密度...
图7 | （无图注）
讨论与解读
本研究成功展示了适应性进化作为增强工业酿酒酵母甘油利用的有效非工程策略。初始菌株筛选确认野生型和突变型酿酒酵母均天然缺乏高效代谢甘油的能力。通过不同甘油浓度下的连续适应，特别是Strain3在甘油摄取方面表现出显著改善，20 g L⁻¹时观察到的消耗量最高，凸显了该菌株优越的代谢灵活性。适应后的Strain3 µmax显著提升至0.24 h⁻¹，高于先前报道的适应性进化和基因工程菌株，表明有效的生理和代谢重编程。这些发现与近期适应性实验室进化研究一致，如Tangwanaprai等人报道进化酿酒酵母菌株在甘油上生长改善七倍，进一步支持进化方法在克服甘油代谢内在限制方面的有效性。
发酵优化揭示pH控制是代谢性能的关键决定因素，在pH 4.0的pH控制条件下实现最佳生长和甘油利用。接种量也是另一个重要因素，较高接种水平导致更快的发酵启动和底物消耗。比较基因组分析揭示了适应菌株中1254个独特变异，调控区域突变富集提示转录重编程，而FPS1突变表明甘油摄取和代谢改善。全基因组变异模式凸显了基因组可塑性作为甘油生长的关键适应机制。
编译者解读
本研究选择适应性进化而非基因工程改造工业菌株，策略务实——避开了工业菌株遗传操作困难与监管障碍。以pH为选择压力并将pH 4.0确定为关键工艺参数，直接对接工业发酵实际需求。152代进化后µmax达0.24 h⁻¹，超越了此前报道的进化菌株，说明非工程手段在工业菌株改良中潜力可观。比较基因组学揭示的调控区突变富集提示转录重编程是甘油适应的核心机制，为后续理性改造提供了靶点。不过，高浓度甘油下消耗率骤降（100 g L⁻¹时仅9.7%）说明渗透压仍是瓶颈；基因组变异的功能验证也有待深入。从合成生物学视角看，将AE筛选出的优势突变与CRISPR等精准编辑工具结合，或可进一步加速菌株改良周期。
参考来源
Öztürk N. Adaptive evolution of industrial Saccharomyces cerevisiae strains for improved glycerol utilization and optimization of key process parameters in bioreactors. Process Biochemistry, 2026.
DOI: 10.1016/j.procbio.2026.03.008
DOI: 10.1016/j.procbio.2026.03.008