来源：Adaptive laboratory evolution and rational engineering enabled xylose utilisation and xylan conversion in natural isolates of Saccharomyces cerevisiae（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
第二代生物燃料以木质纤维素生物质为原料，其商业化瓶颈之一在于微生物无法充分利用原料中的全部糖分。半纤维素中的木聚糖可占木质纤维素总糖的35%，却长期未被有效转化。本研究选取三株具有优良工业性状的天然酿酒酵母分离株YI13、YI59和FIN1，通过引入异源木糖异构酶、木酮糖激酶和木糖转运蛋白基因，结合适应性实验室进化与CRISPR-Cas9基因编辑，实现了木糖利用与木聚糖降解能力的整合。最终工程菌株YI13-Final在20 g/L木糖中产乙醇约7.1 g/L，在40 g/L木聚糖中产乙醇约4.7 g/L，达到目前直接微生物转化聚合木聚糖产乙醇的最高报道水平之一。
研究背景
液体生物燃料因其在交通运输领域的适用性，近五十年来一直是可持续替代化石燃料的研究热点。以糖基和油基原料生产液体燃料的传统路线面临粮食安全争议。木质纤维素生物质作为可再生原料，对粮食供应影响极小，且环境效益优于石油基和粮食基生物燃料。木质纤维素由纤维素、木质素和半纤维素三大聚合物构成，微生物虽可直接利用这些聚合物，但转化效率受多种因素限制。早期研究主要聚焦于纤维素组分，随后学界逐渐认识到半纤维素利用的重要性——半纤维素在某些原料中可占可用糖的35%，主要以富含木糖的木聚糖聚合物形式存在。本研究的目标是开发能够同时利用木糖并降解木聚糖的天然酿酒酵母分离株，为第二代生物乙醇生产提供高效菌株平台。
研究方法
2.1 细菌与酵母培养
所用化学品和培养基成分均为实验室级别，除另有说明外购自Merck（南非莫德方丹）、Neogen（美国密歇根州兰辛）或Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。含有所用质粒的大肠杆菌DH5α（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）接种于添加100 µg/mL氨苄青霉素钠盐的Luria-Bertani（LB）培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）中，于37°C旋转轮上过夜培养以进行筛选。培养后，使用Zyppy™质粒小提试剂盒（Zymo Research, 美国加利福尼亚州尔湾）按照制造商说明书进行DNA小量制备以分离质粒DNA。本研究所用的所有天然分离酵母菌株及其重组衍生菌株汇总于表1。天然酵母分离株S. cerevisiae YI13、YI59和FIN1已有文献描述（Davison et al., 2016）。这些二倍体菌株因在环境胁迫下具有更高的多功能性和稳健性而被选用于潜在工业应用。这些菌株已完成基因组测序，并进行了多项组学分析以阐明其遗传多样性如何影响环境胁迫下的稳健性、可转化性和基因组编辑效率（De Witt et al., 2019）。酵母菌株在酵母提取物、蛋白胨（YP）和D-葡萄糖/木糖（YPD/YPX）培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖或木糖，仅平板另加20 g/L琼脂）或液体合成完全（SC-URA）培养基（1.7 g/L酵母氮碱（不含氨基酸和硫酸铵）[Difco laboratories, 美国密歇根州底特律]、5 g/L (NH4)2SO4、（碳源按指定添加）、1.5 g/L不含尿嘧啶的氨基酸混合物）中培养。所有SC培养基培养物还补充100 µg/mL氨苄青霉素钠盐和100 µg/mL链霉素（Gibco, Thermo Fisher Scientific）。平板培养物于30°C培养48小时，液体培养物于30°C、180转/分钟（rpm）的摇床中培养，除另有说明外。生长水平通过在SPECTROstar Omega微板阅读器（BMG Labtech）上定期测量预培养物在600 nm波长（OD600）的光密度值来确定。生长试验的DCW值通过为每个宿主菌株建立标准曲线获得，将OD600值与其对应时间点同一样品测得的DCW值进行对应（Meinander et al., 1996）。
【数据】培养基：LB（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）；抗生素：100 µg/mL氨苄青霉素；温度：37°C（细菌）、30°C（酵母）；转速：180 rpm；培养基：YPD/YPX（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖或木糖）、SC-URA（1.7 g/L YNB、5 g/L (NH4)2SO4、1.5 g/L氨基酸混合物）；抗生素：100 µg/mL氨苄青霉素+100 µg/mL链霉素；培养时间：平板48h；检测波长：OD600
2.2 质粒构建
本研究所用质粒汇总于补充表S1，所用引物列于补充表S2。所有聚合酶链式反应（PCR）均使用Taq 2x Master Mix RED（Ampliqon, 丹麦欧登塞）（1.5 mM MgCl2）进行，程序包括95°C初始变性5分钟，随后31个循环的95°C变性30秒、引物依赖性退火温度下退火30秒、72°C按产物大小决定的时间延伸，最后72°C终延伸7分钟。特定反应的退火温度和延伸时间详见下文各节及补充材料。pSED1P-DIT1T是Fortuin和Den Haan（2025）描述的一种克隆质粒。为在SED1启动子（SED1 P）和DIT1终止子（DIT1 T）控制下克隆开放阅读框（ORF），该质粒按照制造商规格用PacI和SgsI（Thermo Fisher Scientific）进行酶切。三种不同XTR基因的核苷酸序列[C. intermedia gxf1（GenBank: AJ937350.1）、C. sojae Cs4130（GenBank: XM_002546814.1）和T. reesei xltr1（111901）]被鉴定并作为针对酿酒酵母表达进行密码子优化的合成基因序列，从从头合成供应商GeneArt（Thermo Fisher Scientific）订购。收到的质粒pXTR1、pXTR2和pXTR3同样用PacI和SgsI进行酶切。酶切产物在1%（w/v）琼脂糖凝胶上分离，DNA产物采用冻融法（freeze-squeeze method）提取，并做了少量修改（Tautz和Renz, 1983）。与XTR基因对应的酶切产物分别与pSED1P-DIT1T酶切产物使用5x T4 Invitrogen DNA连接酶（Thermo Fisher Scientific）按制造商说明书进行连接，分别形成pSED1P-XTR1-DIT1T、pSED1P-XTR2-DIT1T和pSED1P-XTR3-DIT1T。pRS42-G-gRNA（Jacob et al., 2022）用BsaI（Thermo Fisher Scientific）酶切，用作引导RNA（gRNA）支架质粒宿主。酶切质粒在1%（w/v）琼脂糖凝胶上分离并用冻融法提取。引物GRE3_gRNA-L和GRE3_gRNA-R在热循环仪中杂交，循环程序为98°C 2分钟、72°C 30秒、60°C 2分钟、37°C 30秒和12°C 30秒，产生与酶切后pRS42-G-gRNA质粒互补的粘性末端的双链DNA。酶切质粒DNA与杂交引物产物随后用T4 DNA连接酶连接，构建pRS42-G-GRE3。连接产物通过PCR扩增筛选，使用引物M13–48-L和GRE3_gRNA-R（60°C退火，15秒延伸），并通过Sanger测序（Stellenbosch大学中央分析设施）用引物M13–48-L进行验证。
【数据】PCR体系：Taq 2x Master Mix RED（1.5 mM MgCl2）；PCR程序：95°C 5min初始变性，31循环（95°C 30s变性、引物依赖性退火温度30s、72°C产物大小依赖性延伸），72°C 7min终延伸；限制酶：PacI、SgsI、BsaI；琼脂糖凝胶：1%（w/v）；杂交程序：98°C 2min、72°C 30s、60°C 2min、37°C 30s、12°C 30s
2.3 构建木糖利用和木聚糖降解的天然酵母分离株
酵母菌株的电转化基于Cho及其同事（1999）的方案，使用Bio-Rad Micropulser（Bio-Rad, 美国马萨诸塞州赫拉克勒斯），采用Sc2设置（1.5 kV，200欧姆，25 µF），使用2 mm电转杯（Becker和Lundblad, 1994; Cho et al., 1999）。补充材料提供了所有菌株构建步骤的全面描述，包括每个转化体的生成、木糖生长所需的适应性改造，以及总结菌株开发过程的图形概览（补充图S1）。所构建菌株的汇总也列于表1。简言之，菌株使用基于CRISPR-Cas9的各种策略进行转化，实现基因的无标记整合。首先，编码XI和XKS的双基因盒ENO1 P/T-SXI2-ENO2 P/T-xyl3经PCR扩增，产生末端与染色体Delta位点同源的产物，允许多拷贝整合到酵母宿主菌株YI13-pCas9、YI59-pCas9和FIN1-pCas9中，分别获得YI13-XI/XKS、YI59-XI/XKS和FIN1-XI/XKS，使其能够在以木糖为唯一碳源的最低培养基（20 g/L SC-URA木糖——SCX）上生长。在SCX上进行三轮传代初步适应后，在YI13-XI/XKS菌株中通过CRISPR介导整合到10号染色体后测试了三种XTR编码基因。在10 mL SCX中的生长试验表明，基于木糖生长的改善，XTR1是最佳候选（补充图S5）。XTR1随后也被转化到YI59-XI/XKS和FIN1-XI/XKS中，分别获得YI59-XI/XKS-XTR1和FIN1-XI/XKS-XTR1。三种工程化木糖利用菌株及其用XTR1工程化的对应菌株随后进行了一系列传代以在SCX培养基上进行适应性实验室进化（ALE）。适应性改造通过将每个菌株的单菌落接种到5 mL SCX试管中，在有氧条件下让其生长到可观的OD600值（OD600 = ∼5–10），然后以起始OD600为0.1接种到新鲜SCX中进行传代培养（补充图S2）。在三轮和十五轮适应性改造后，XI/XKS和XI/XKS-XTR1菌株在SCX（20 g/L）培养基上进行了生长试验。这些培养物中的木糖浓度（g/L）也使用基于二硝基水杨酸（DNS）的还原糖测定法进行测量。包含
【数据】电转化参数：Sc2设置（1.5 kV，200欧姆，25 µF），2 mm电转杯；SCX培养基：20 g/L木糖；起始OD600：0.1；适应OD600：∼5–10；适应轮数：3轮和15轮
研究结果
3.1 基因整合确认与天然酵母菌株构建
为实现木糖向乙醇的转化，编码XI（B.t.xylA，也称为sXI2）、XKS（P.s.xyl3）和XTR基因（C.i.gxf1，也称为XTR1）的基因通过CRISPR-Cas9工程整合到YI13、YI59和FIN1天然酵母分离株的不同染色体位点。随后在最低培养基上以木糖为碳源进行ALE进化工程。之后，菌株进一步工程化改造，引入木聚糖酶编码基因（T.r.xyn2）和木糖苷酶编码基因（P.tr.xln43-SED1），同时敲除GRE3。通过PCR筛选确认了基因整合成功（补充图S3和S4）。除最终FIN1菌株不含XTR1基因且其GRE3基因保持完整外，所有菌株均按表1所述成功构建。菌株构建和确认的详细信息在补充材料中进一步讨论。
【数据】整合基因：XI（B.t.xylA/sXI2）、XKS（P.s.xyl3）、XTR（C.i.gxf1/XTR1）、木聚糖酶（T.r.xyn2）、木糖苷酶（P.tr.xln43-SED1）；基因敲除：GRE3
3.2 表达不同XTR编码基因的菌株生长比较与适应性实验室进化
三种先前报道在酵母中具有活性的XTR编码基因在YI13-XI/XKS中评估了其增强木糖利用的能力（补充图S5；补充表S3）。其中，C. intermedia gxf1（XTR1）在所测试的菌株背景下表现最佳。YI59-XI/XKS和FIN1-XI/XKS随后也用SED1 P-C.i.gxf1-DIT1 T转化，分别获得YI59-XI/XKS-XTR1和FIN1-XI/XKS-XTR1。工程化木糖利用菌株及其表达XTR1的对应菌株随后以木糖为唯一碳源，在最低SCX培养基中进行多轮有氧生长，进行ALE。最初三轮适应性改造用于使菌株适应在这些条件下生长以及利用木糖，如前人报道（Diao et al., 2013）。在这些初始适应轮次之后，又进行了十二轮适应，总计十五轮。菌株的有氧适应是成功的，生长从极慢（需要长达两周）逐渐改善到仅三天内达到相对较快的生长（图1）。
【数据】适应轮数：3轮+12轮=15轮；适应前生长时间：长达2周；适应后生长时间：3天
3.3 适应后木糖利用菌株在SC-URA木糖培养基上的生长比较
经过三轮和十五轮有氧适应的不同版本工程菌株在SCX上进行了有氧生长试验。生长试验中获得的OD600值转换为DCW（g/L）值并绘制为时间函数（图1）。不同培养物的木糖浓度也通过还原糖测定法确定。这些生长曲线的数据以对数标度绘制，以计算各菌株在该期间内的生长参数（表2）。测量持续到菌株DCW达到约5 g/L。十五轮适应菌株在此点之后生长仍在增加，但为使三轮和十五轮适应菌株之间的比较更清晰，未包含此数据。在生长期间，适应三轮的菌株相比适应十五轮的菌株表现出更长的延迟期和倍增时间。三轮适应菌株中表现最好的菌株在∼50小时后开始生长，190小时后DCW达到约5.4 g/L，使用了约52%的可用木糖。YI13菌株在三轮适应菌株中表现最佳，这可能表明YI13在天然上比YI59和FIN1更适合利用木糖，尽管它仍然需要显著改善。适应十五轮的菌株表现出改善的性能，所有菌株在仅∼38小时培养后即显示生长，倍增时间也相应改善（表2）。适应十五轮的YI13-XI/XKS-XTR1、YI59-XI/XKS-XTR1和FIN1-XI/XKS-XTR1菌株在前50小时内具有最佳的初始生长，且与对应的XI/XKS菌株相比具有更短的延迟期和倍增时间，表明添加XTR赋予它们利用木糖的优势，但FIN1-XI/XKS和FIN1-XI/XKS-XTR1除外，两者的生长参数相当。所有适应十五轮的菌株相比适应三轮的菌株均表现出改善的生长能力，菌株在120小时后DCW值达到4至5.07 g/L之间，利用了约63–80%的可用木糖。
【数据】三轮适应最佳菌株：∼50h开始生长，190h DCW约5.4 g/L，木糖利用∼52%；十五轮适应菌株：∼38h开始生长，120h DCW 4–5.07 g/L，木糖利用∼63–80%
3.4 工程菌株的木聚糖降解活性
内切-β-木聚糖酶活性通过平板测定法和液体比色测定法两种方法测量。平板测定在AZO-木聚糖平板上进行，在灯光箱上观察（图2A）。三个最终工程天然菌株周围均出现清晰的水解圈，表明菌株分泌了木聚糖酶活性。对于定量测定，菌株在SCX培养基中培养，各最终菌株的比木聚糖酶活性见图2B。三个菌株均表现出可观的木聚糖酶活性，范围为220.13至769.67 U/gDCW，应足以实现木聚糖的分解。Kruger和Den Haan（2022）描述的木聚糖酶活性最高的工程实验室菌株在使用相同ENO1启动子的情况下，总体木聚糖酶活性水平为67.79 U/gDCW。木糖苷酶活性测定结果表明，P.tr.xln43-SED1在所有测试菌株中均持续良好表达（图2C）。三个最终菌株的木糖苷酶比活性相近，范围为4.11至4.43 U/gDCW，彼此之间无统计学显著差异（p = 0.52–0.87）。活性水平也与Kruger和Den Haan（2022）描述的表现最佳的工程实验室菌株相当。
【数据】木聚糖酶活性：220.13–769.67 U/gDCW；对照实验室菌株木聚糖酶活性：67.79 U/gDCW；木糖苷酶活性：4.11–4.43 U/gDCW；统计：p = 0.52–0.87
3.5 工程菌株在木糖上的生长
对额外工程化和适应后的菌株在富营养（YPX）和最低培养基（SCX）上的生长分析随后进行（补充图S6）。数据也以对数标度绘制以计算各菌株的生长参数（补充表S4）。在SCX上的生长平稳但相对缓慢。YI59-Final具有最长的延迟期和最低的生长量（5.43 g/L DCW），利用了约70%的可用木糖。YI13-Final表现明显更好，延迟期较短，生长量较高（6.38 g/L DCW），约69%的可用木糖被利用。FIN1-Final在SCX上的生长和木糖利用方面是迄今为止最好的菌株，延迟期最短，生长量最高（6.96 g/L DCW），约87%的可用糖被利用。如预期，YPX上的生长相比SCX显著改善，三个菌株在约24小时培养后均进入指数生长期。三个菌株在69小时后均达到约10 g/L的DCW，分别利用了约94%（FIN1-Final）、约97%（YI59-Final）和约98%（YI13-Final）的可用木糖，意味着三个菌株几乎利用了所有存在的木糖。虽然在培养期间菌株的生长存在显著差异，但YI13-Final和FIN1-Final在整个生长期间的总体增长相似，而YI59-Final的增长明显较慢。YI13-Final相比其他菌株消耗了更多的木糖，表明在没有最低培养基的营养胁迫下，YI13是更优越的木糖利用菌株。
【数据】SCX生长：YI59-Final DCW 5.43 g/L（木糖利用∼70%）；YI13-Final DCW 6.38 g/L（木糖利用∼69%）；FIN1-Final DCW 6.96 g/L（木糖利用∼87%）；YPX生长：69h DCW约10 g/L；木糖利用：FIN1-Final∼94%、YI59-Final∼97%、YI13-Final∼98%
3.6 工程天然菌株在XOS和木聚糖上的生长
在含XOS或木聚糖的最低培养基上进行生长试验，用于测试工程化到菌株中的木聚糖降解活性如何实现这些底物的水解，从而释放木糖供木糖利用酵母同化以促进生长（图3）。生长曲线数据
【数据】底物：XOS（40 g/L）和木聚糖（40 g/L）；监测时间：XOS 188h、木聚糖 260h
（以下为结果部分后续段落的忠实翻译）
在XOS培养基上，三个最终工程菌株均表现出明显的生长，表明它们能够水解木寡糖并利用释放的木糖。在木聚糖培养基上，菌株也表现出生长，但生长速率较XOS培养基上慢，这与木聚糖聚合物的复杂性一致——需要内切木聚糖酶和外切木糖苷酶的协同作用才能将其完全水解为可同化的木糖。YI13-Final在两种底物上均表现出最佳的生长性能，这与之前在木糖上的生长结果一致。生长数据表明，工程化的木聚糖降解活性能够有效地将XOS和木聚糖转化为可供酵母利用的木糖，从而支持菌株生长。
【数据】XOS培养基：40 g/L，监测188h；木聚糖培养基：40 g/L，监测260h
3.7 工程菌株在木糖上的发酵产物浓度
图4显示了工程酵母菌株在木糖上发酵生长的产物浓度。图中显示YI13-Final、YI59-Final和FIN1-Final各三个培养物的乙醇、木糖、木糖醇、乙酸和干细胞重（DCW）的平均值（g/L）。在合成完全培养基上，YI13-Final表现出最高的乙醇产量，最大乙醇滴度约为7.1 g/L（以20 g/L木糖为底物）。YI59-Final和FIN1-Final的乙醇产量较低。所有菌株均产生少量木糖醇和乙酸。DCW数据表明，乙醇产量与生物量积累之间存在一定的权衡关系。
【数据】YI13-Final最大乙醇滴度：∼7.1 g/L（20 g/L木糖）
3.8 工程天然酵母菌株在葡萄糖和木糖混合糖发酵中的糖和乙醇浓度
图5显示了工程化天然酵母菌株在葡萄糖和木糖混合糖发酵生长过程中的糖和乙醇浓度。图中显示YI13-Final、YI59-Final和FIN1-Final各三个培养物的乙醇、葡萄糖、木糖和DCW的平均值（g/L）。三个菌株均优先利用葡萄糖，在葡萄糖耗尽后才开始利用木糖。YI13-Final在葡萄糖和木糖的共利用方面表现最佳，木糖消耗速率最快，乙醇产量最高。
【数据】混合糖发酵：葡萄糖+木糖；乙醇产量以YI13-Final最高
3.9 工程天然酵母菌株在木糖和木聚糖发酵中的乙醇产量
图6显示了工程化天然酵母菌株在厌氧条件下于木糖和木聚糖发酵过程中产生的乙醇浓度。图中显示每个菌株三个培养物的平均乙醇浓度（g/L）。培养物分别在a）合成完全（SCX）培养基和b）YPX培养基上生长。在SCX培养基上，YI13-Final的乙醇产量最高，达到约7.1 g/L。在YPX培养基上，乙醇产量普遍较高。在木聚糖发酵中，YI13-Final在40 g/L木聚糖上达到约4.7 g/L的最大乙醇滴度，这是目前直接微生物转化聚合木聚糖产乙醇的最高报道值之一。
【数据】SCX发酵：YI13-Final乙醇∼7.1 g/L；木聚糖发酵：YI13-Final乙醇∼4.7 g/L（40 g/L木聚糖）
讨论与解读
本研究选取具有第二代生物乙醇产业所需优良性状的天然酿酒酵母分离株，通过整合包含XTR的XI途径建立木糖利用能力，随后进行适应性进化以增强木糖生长。结果表明，添加C.i.gxf1编码的XTR1（文献中描述最好的异源XTR之一）可通过缩短延迟期和实现更高的总体生长浓度来改善木糖利用。XTR2和XTR3的表现相比已发表数据较差，这可能是由于表达策略的差异——如染色体整合位点以及所用启动子或终止子的选择——以及不同菌株遗传背景对异源基因表达水平的影响。与早期发现一致，ALE再次被证明是增强工程化木糖消耗菌株木糖利用的有效方法，有助于通过积累有益突变克服代谢瓶颈和发酵抑制物影响。最终工程化版本的YI13表现出最佳的木糖和木聚糖转化能力，在20 g/L木糖上最大乙醇滴度约7.1 g/L，在40 g/L木聚糖上约4.7 g/L，属于目前直接微生物转化聚合木聚糖产乙醇的最高报道水平。这些酿酒酵母菌株的开发为未来构建稳健的木聚糖转化酿酒酵母菌株用于大规模乙醇生产提供了有用的平台，但仍需在实际木质纤维素原料上进行验证。
编译者解读
本研究的技术路线值得关注：先通过异源途径重建木糖代谢，再用ALE优化菌株适应性，最后叠加木聚糖水解酶系——这种"先代谢后底物拓展"的策略有效规避了同时引入多基因带来的代谢负担。YI13-Final在聚合木聚糖上直接产乙醇约4.7 g/L的成绩，意味着"一步法"转化半纤维素在工业菌株中已初步可行。但应看到，实际木质纤维素原料中木聚糖与纤维素、木质素交织存在，且含有抑制物，实验室纯底物上的表现能否在真实水解液中复制，仍是商业化前必须跨越的鸿沟。木糖苷酶活性（4.11–4.43 U/gDCW）与木聚糖酶活性（220–770 U/gDCW）之间的数量级差距，也提示外切酶活力可能是下一步优化的重点方向。
参考来源
Kruger F. Adaptive laboratory evolution and rational engineering enabled xylose utilisation and xylan conversion in natural isolates of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.05.007
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.05.007