来源：Engineering Escherichia coli to use formate and CO2 as carbon sources for the synthesis of succinic acid in a two-stage fermentation（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
全球碳中和目标驱动下，微生物细胞工厂利用一碳（C1）原料的研究日益受到关注。本研究通过模块化整合四氢叶酸（THF）模块、甘氨酸裂解/合酶（GCS）模块、琥珀酸合成模块与能量供应模块，将大肠杆菌改造为能以甲酸和CO₂为主要碳源生长并合成琥珀酸的菌株。经三轮菌株筛选与两阶段发酵工艺优化，工程菌在5L生物反应器中琥珀酸产量达7.02 g/L，总碳产率达0.74 mol/mol，理论CO₂固定量达5.23 g/L。
研究背景
微生物细胞工厂利用可再生资源实现燃料和化学品的绿色生物制造，为减少化石燃料依赖提供了可持续路径。原料正从第一代（1G）粮食基向第二代（2G）非粮植物生物质、再向第三代（3G）资源——如CO₂和一碳（C1）化合物——过渡。大气CO₂持续升高导致全球变暖和海平面上升的严重威胁，战略性开发3G原料成为当务之急。甲酸是典型的CO₂衍生C1化合物，可从CO₂方便地制备，且能在提供还原力的同时被微生物高效同化。其成本低于葡萄糖，且具有CO₂利用功能，支持全球净零排放愿景。然而，模式微生物大肠杆菌天然无法利用C1原料。本研究旨在通过代谢工程手段，使大肠杆菌能够以甲酸和CO₂为主要碳源，实现琥珀酸的绿色合成。
研究方法
2.1 菌株、质粒与基因操作
大肠杆菌DH5α作为载体构建宿主，用于重组质粒的构建与扩增；大肠杆菌BA102作为后续代谢工程改造的亲本生产菌株。BA102由大肠杆菌K-12敲除pflB、ldhA和ptsG三个关键基因构建而成。敲除pflB和ldhA可阻断丙酮酸转化为甲酸和乳酸的主要竞争代谢途径，促使更多代谢通量流向琥珀酸生物合成。敲除ptsG可灭活葡萄糖特异性磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统，解除碳代谢物阻遏效应并维持胞内磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）库水平。据报道，该菌株琥珀酸摩尔产率可达1.19 ± 0.31 mol/mol葡萄糖。鉴于其高产琥珀酸的能力，选择BA102进行后续改造以利用C1原料合成琥珀酸。菌株和质粒的基因型及抗生素抗性标记详细信息见表S1（补充材料），引物序列及特性见表S2（补充材料）。
编码产琥珀酸杆菌（Anaerobacter mongoliensis）丙酮酸羧化酶的pyc基因和编码拟南芥（Arabidopsis thaliana）突变苹果酸激酶的me2基因由通用生物系统有限公司合成。这两个基因分别通过限制性酶切-连接反应克隆至表达载体pCWJ，生成重组质粒pCWJ-pyc和pCWJ-me2。随后，使用引物me2-F/R通过PCR扩增me2基因片段，并用T4 DNA连接酶连接到pCWJ-pyc载体上，构建重组质粒pCWJ-pyc-me2。之后，将编码亚vermispora（Ceriporiopsis subvermispora）甲酸脱氢酶的fdh基因插入pTrc99a载体，获得重组质粒pTrc99a-fdh。
采用CRISPR/Cas9技术在大肠杆菌BA102中进行位点特异性基因组整合，以构建rGlyP。通过组成型启动子P20驱动THF依赖性酶系统和甘氨酸裂解系统相关基因的整合表达，实现代谢通量的定向调控。首先，构建靶向目标基因的sgRNA和同源修复的供体DNA。使用ChopChop在线工具鉴定特异性序列ycjv-N200和yjiv-N201。然后，将sgRNA和供体DNA共电穿孔至含有pCas9-Kan质粒的BA102菌株中。培养后，挑选单菌落进行菌落PCR以验证整合效率。随后，将整合成功的菌株接种至含卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中传代以消除sgRNA表达质粒，再在不含抗生素的LB培养基中连续传代以消除pCas质粒。质粒消除后，成功获得工程菌株E. coli THF（BA102-THF）和E. coli THF-GCS（BA102-THF-GCS）。
【数据】菌株：E. coli DH5α、E. coli BA102（K-12敲除pflB、ldhA、ptsG）；基因：pyc（A. mongoliensis）、me2（A. thaliana）、fdh（C. subvermispora）；工具：CRISPR/Cas9、启动子P20；整合位点：ycjv、yjiv；琥珀酸产率：1.19 ± 0.31 mol/mol葡萄糖
2.2 培养条件
所有用于重组质粒构建的大肠杆菌宿主菌株均在LB培养基中培养，其成分为10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L NaCl。本研究所用M9基本培养基包含以下成分：50 mM Na₂HPO₄、20 mM KH₂PO₄、1 mM NaCl、20 mM NH₄Cl、2 mM MgSO₄和100 μM CaCl₂，并补充微量元素混合物（含134 μM EDTA、13 μM FeCl₃·6H₂O、6.2 μM ZnCl₂、0.76 μM CuCl₂·2H₂O、0.42 μM CoCl₂·2H₂O、1.62 μM H₃BO₃和0.081 μM MnCl₂·4H₂O）。根据实验优化需求，向M9基本培养基中额外添加15–45 mM甲酸（15 mM甲酸约等于1.0 g/L）、0–40 mM葡萄糖或木糖以及30 mM NaHCO₃。需要时，抗生素添加浓度如下：100 mg/L氨苄青霉素和34 mg/L氯霉素。
5L生物反应器中使用的初级和次级种子培养基均以M9基本培养基为基础，补充10 mM木糖、45 mM甲酸和30 mM NaHCO₃。反应器中的发酵培养基通过在初级/次级种子培养基成分中添加60 mM MgCO₃配制而成。补料培养基为M9基本培养基，含45 mM甲酸和30 mM NaHCO₃。分别灭菌后，通过火焰接种接种至反应器中。抗生素与微量元素混合物或补料培养基预混，然后通过火焰接种共同接种至反应器中。
【数据】LB培养基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl；M9培养基：50 mM Na₂HPO₄、20 mM KH₂PO₄、1 mM NaCl、20 mM NH₄Cl、2 mM MgSO₄、100 μM CaCl₂；微量元素：134 μM EDTA、13 μM FeCl₃·6H₂O、6.2 μM ZnCl₂、0.76 μM CuCl₂·2H₂O、0.42 μM CoCl₂·2H₂O、1.62 μM H₃BO₃、0.081 μM MnCl₂·4H₂O；甲酸：15–45 mM；葡萄糖/木糖：0–40 mM；NaHCO₃：30 mM；氨苄青霉素：100 mg/L；氯霉素：34 mg/L；种子培养基：10 mM木糖、45 mM甲酸、30 mM NaHCO₃；发酵培养基：另加60 mM MgCO₃；补料培养基：45 mM甲酸、30 mM NaHCO₃
2.3 以甲酸和CO₂生产琥珀酸及条件优化
重组菌株GCS5采用两阶段发酵工艺培养，分为好氧生长期（细胞生长）和厌氧产酸期（琥珀酸生产）。好氧阶段，初始培养温度为37°C，氨苄青霉素和氯霉素的终浓度分别为100 mg/L和34 mg/L。THF和GCS正常表达，促进生物量积累。培养12 h后，温度调至30°C，加入IPTG至终浓度0.5 mM进行诱导，以实现fdh和pyc基因的高效表达。诱导20 h后，培养切换至厌氧发酵阶段，培养温度调至37°C。使用2 mol/L NaOH溶液调节pH。好氧诱导阶段pH自动维持在7.0，厌氧阶段通过反应器内置控制系统调至6.8。根据不同发酵阶段的代谢特征，补加含有终浓度分别为45 mM甲酸钠和30 mM碳酸氢钠的M9基本培养基，以实现发酵过程的最优调控。
随后，以琥珀酸产量为核心评价指标，对好氧发酵的关键诱导参数进行单因素优化。梯度变量依次设定为：诱导初始生物量（以OD600表征，梯度为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2）、诱导温度（18°C、25°C、30°C、37°C）、IPTG浓度（0 mM、0.05 mM、0.1 mM、0.5 mM、1.0 mM）、诱导持续时间（8 h、12 h、16 h、20 h、24 h）和底物浓度（1 g/L、1.5 g/L、2 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L、5.0 g/L）。最终，在以甲酸为唯一碳源的M9培养基中，好氧发酵阶段的最优诱导条件确定为：诱导初始OD600值为1.0，IPTG浓度为0.5 mM，诱导持续时间为20 h，底物浓度为3.0 g/L（约相当于45 mM）。
基于上述最优诱导条件，进一步优化厌氧发酵阶段的温度和时间。接种后，菌液在五个温度梯度（18°C、25°C、30°C、37°C和42°C）下进行厌氧摇瓶发酵。以发酵结束时的琥珀酸滴度为核心评价指标，确定37°C为厌氧发酵的最适温度。在此基础上，在37°C厌氧条件下进行动态取样分析，每24 h取样一次，测定培养体系中琥珀酸的积累量。
【数据】两阶段发酵：好氧37°C培养12h → 30°C、0.5 mM IPTG诱导20h → 厌氧37°C；pH：好氧7.0、厌氧6.8；NaOH：2 mol/L；补料：45 mM甲酸钠、30 mM碳酸氢钠；诱导OD600梯度：0.4/0.6/0.8/1.0/1.2；诱导温度梯度：18/25/30/37°C；IPTG梯度：0/0.05/0.1/0.5/1.0 mM；诱导时间梯度：8/12/16/20/24h；底物浓度梯度：1/1.5/2/2.5/3/4/5 g/L；最优：OD600=1.0、IPTG 0.5 mM、20h、3.0 g/L（≈45 mM）；厌氧温度梯度：18/25/30/37/42°C，最优37°C；取样间隔：24h
2.4 5L生物反应器中的两阶段发酵
采用5L生物反应器强化琥珀酸合成。发酵起始阶段，……（原文此处截断，后续内容未提供）
【数据】反应器规模：5L；原文未详述更多参数
研究结果
3.1 构建还原性甘氨酸途径以利用甲酸和CO₂
模式微生物大肠杆菌以其代谢多样性、庞大的合成生物学工具包和成熟的生物制造应用而闻名，但无法天然利用C1原料。为实现甲酸和CO₂的C1原料利用，选择rGlyP——理论上最有效的甲酸同化途径——并设计为THF、GCS和PYR三个模块（图2A）。THF模块是THF依赖的C1转化系统，用于将甲酸同化为5,10-亚甲基-THF，包括甲酸-四氢叶酸连接酶（ftfL）、5,10-亚甲基四氢叶酸环化水解酶（fchA）和5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶（mtdA）。GCS模块是甘氨酸裂解/合酶系统，通过进一步与CO₂和氨缩合生成甘氨酸，由氨基甲基转移酶（gcvT）、甘氨酸脱羧酶（gcvP）、甘氨酸裂解系统H蛋白（gcvH）和硫辛酰胺脱氢酶（lpd）组成。最后，PYR模块用于通过大肠杆菌中的丝氨酸羟甲基转移酶（glyA）和丝氨酸脱氨酶（sdaA/sdaB）从甘氨酸合成丙酮酸，然后进入代谢支持细菌生长。
分别在E. coli BA102基因组的ycjv和yjiv位点整合了核心THF模块和GCS模块（图1）。在M9基本培养基中以甲酸和NaHCO₃作为唯一碳源的细胞生长分析显示，引入THF模块（E. coli THF）和THF-GCS模块（E. coli THF-GCS）对生长无显著影响（图2B）。考虑到rGlyP是能量需求型途径（需要2个ATP和3个NAD(P)H），天然甲酸脱氢酶活性从甲酸产生的还原力和能量不足，导致仅以甲酸和NaHCO₃为底物时生长不佳。为使甲酸同化为生物量，甲酸作为主要碳源，同时还需要能量来源，此阶段添加了微量葡萄糖。
结果表明，在含30 mM甲酸、30 mM NaHCO₃并添加10–40 mM葡萄糖的M9基础培养基中，所有工程菌株的生长均得到不同程度的促进（图2C-F），证明了rGlyP的有效性。相应的甲酸消耗检测也表明，通过构建THF模块或THF-GCS模块，甲酸已被同化利用以支持细胞生长（图2G）。E. coli THF和E. coli THF-GCS的生物量积累相似，表明大肠杆菌内源GCS可能支持还原活性以连接THF和PYR模块。特别是在10–20 mM极低葡萄糖浓度下，携带THF模块和THF-GCS模块的工程菌株生物量积累显著增加，而原始菌株BA102仅出现极微小的生长波动。E. coli THF和E. coli THF-GCS的最大OD600值分别约为BA102的4.6倍和4.0倍（图2C-D）。这表明微量葡萄糖主要用于满足rGlyP的还原力和能量需求。根据Seohyoung Kim等人的研究，在10 mM葡萄糖存在下，THF和GCS的过表达支持以甲酸作为唯一C1部分的生长。所有结果证实，通过引入THF模块或THF-GCS模块成功构建了rGlyP，并实现了依赖甲酸同化和CO₂固定的生物量生成。
【数据】菌株：E. coli BA102、E. coli THF、E. coli THF-GCS；培养基：M9 + 30 mM甲酸 + 30 mM NaHCO₃ + 10–40 mM葡萄糖；最大OD600倍数：THF约为BA102的4.6倍，THF-GCS约为4.0倍；ATP需求：2；NAD(P)H需求：3
3.2 整合琥珀酸合成途径以利用甲酸和CO₂生产琥珀酸
为实现通过rGlyP将C1原料转化为复杂的多碳化合物，选择琥珀酸作为概念验证并设计其合成途径。琥珀酸可在不同条件下通过多条代谢路线合成。好氧条件下，通过乙醛酸支路或TCA循环氧化分支合成，伴随CO₂释放。厌氧条件下，还原性TCA（rTCA）循环运行，通过CO₂固定合成琥珀酸。鉴于厌氧合成路线具有更高的理论产率和碳固定能力，设计了两种途径，包括基于rGlyP产生的丙酮酸的PC依赖途径和ME依赖途径（图3A）。在PC依赖途径中，PC催化羧化反应，将丙酮酸与CO₂转化为草酰乙酸，然后进入rTCA途径合成琥珀酸。ME依赖途径主要依赖突变ME的催化作用，通过CO₂固定直接从丙酮酸合成苹果酸，然后合成琥珀酸。
因此，将来自A. mongoliensis的pyc和来自A. thaliana的突变me2（C490S）以质粒形式独立和同时过表达，并与整合到基因组中的THF和GCS模块组合，构建了六株重组大肠杆菌菌株以生产琥珀酸（图3B）。通过两阶段发酵工艺研究琥珀酸合成——在含30 mM甲酸、30 mM NaHCO₃和10 mM葡萄糖的最低培养基中进行好氧生长阶段和随后的厌氧琥珀酸生产阶段。所有六株工程菌均在好氧阶段积累了生物量，并在厌氧阶段积累了琥珀酸（图3B）。其中，E. coli THF3的滴度最高，达1.12 g/L。相反，对照菌株E. coli THF和E. coli THF-GCS未检测到琥珀酸积累（图3B）。同时，工程大肠杆菌消耗甲酸与目标产物合成同步进行，表明琥珀酸合成模块已与rGlyP成功连接，构建了完整的rGlyP-SA途径。合成的rGlyP-SA途径可利用C1原料实现琥珀酸生产。
【数据】菌株：6株重组大肠杆菌（THF+GCS+pyc/me2组合）；培养基：M9 + 30 mM甲酸 + 30 mM NaHCO₃ + 10 mM葡萄糖；最高滴度：E. coli THF3 = 1.12 g/L；对照（THF、THF-GCS）：未检测到琥珀酸
3.3 通过强化能量供应促进以甲酸和CO₂的生长和琥珀酸生产
rGlyP是能量需求型途径。已有多种策略成功强化了细胞内能量，包括提高脱氢酶活性、构建电合成或光合系统以及修饰戊糖磷酸途径。研究结果表明，高效的甲酸同化依赖于充足的能量供应，并受大肠杆菌天然FDH活性不足的限制。因此，为强化能量供应，过表达来自Ceriporiopsis subvermispora的FDH，通过氧化甲酸生成NADH作为能量模块（图4A）。首先考察了其对细胞生长的影响。如图4C和图2C所示，在30 mM甲酸、30 mM NaHCO₃和10 mM葡萄糖条件下，THF4和GCS4的最大OD600值分别比E. coli THF和E. coli THF-GCS高35%和75%。即使在无葡萄糖的情况下，FDH的表达也使24 h时的OD600略有增加（图4B）。前期研究表明，携带rGlyP的菌株可以使用甲酸作为唯一的碳和能量来源生长，需要高水平表达FDH或提供外部能量来源。与之一致，本研究结果也表明过表达FDH可以提供能量，促进甲酸同化为生物量。
随后，考察了FDH过表达对琥珀酸合成的影响。如图4D所示，所有过表达FDH的菌株均表现出甲酸消耗和琥珀酸产量的普遍同步增加。在先前最优配置THF3的基础上，进一步过表达FDH获得的菌株THF7在滴度上表现出最高的提升……
【数据】菌株：THF4、GCS4、THF7；条件：30 mM甲酸 + 30 mM NaHCO₃ + 10 mM葡萄糖；OD600提升：THF4比THF高35%，GCS4比THF-GCS高75%；无葡萄糖时24h OD600略有增加；FDH来源：C. subvermispora
（原文结果部分后续内容未提供，包括图5、图6、图7对应内容及两阶段发酵优化、5L反应器放大等结果数据）
讨论与解读
本研究通过模块化途径优化，构建了能够利用甲酸和CO₂生产琥珀酸的工程大肠杆菌。研究组装了THF、GCS、琥珀酸合成和能量供应四个模块，并建立了两阶段发酵方法——好氧阶段工程菌以甲酸和CO₂为主要碳源生长，随后厌氧阶段从甲酸和CO₂合成琥珀酸。通过条件优化和2G与3G原料组合，工程菌株在5L生物反应器中产生7.02 g/L琥珀酸。前期研究表明，葡萄糖和甲酸的协同代谢可提高目标化学品的理论产率，其中甲酸作为补充碳源消耗葡萄糖代谢产生的过量ATP和NADH，优化胞内氧化还原状态。本研究通过构建异源rGlyP，结合两阶段发酵，实现了以C1原料为主要碳源的利用，厌氧生产阶段仅补充甲酸和CO₂。此外，该方法可灵活扩展至多种糖类，展示了C1原料利用的潜力。然而，CO₂固定量仅为基于琥珀酸合成的理论计算值，未进行实际测量，原因是存在微量糖和甲酸氧化等干扰因素。进一步研究中需采用同位素标记等方法进行精确测定。
【编译者解读】该研究以模块化工程策略系统整合C1同化与产物合成路径，逻辑清晰、层次分明。两阶段发酵设计巧妙地将"好氧生长"与"厌氧产酸"分离，有效解决了C1利用中能量供应与产物合成之间的矛盾。FDH过表达作为能量强化手段，与木糖替代葡萄糖的2G/3G原料组合策略，体现了从"能用"到"好用"的工程优化思路。值得关注的是，CO₂固定量仅基于化学计量学理论计算，缺乏同位素示踪等直接证据，这可能是后续工作需要补强的关键环节。总体而言，该研究为C1原料生物利用提供了可借鉴的范式。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.cej.2026.177153
作者：Yao Liu 等
DOI: 10.1016/j.cej.2026.177153