来源：Transcriptome-informed engineering of regulatory targets and glucose utilization pathways in Escherichia coli for improved L-tryptophan biosynthetic efficiency（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-色氨酸是重要的芳香族氨基酸，其微生物发酵生产常受复杂调控网络制约。本研究对高产菌株W-24进行比较转录组分析，系统揭示了中心碳代谢、氨基酸合成及全局调控网络的转录重塑特征。研究鉴定了ArcA和AsnC两个正调控靶点，并基于转录组线索构建了GalP/Glf–Glk介导的非PTS葡萄糖利用途径。最终工程菌株在5-L生物反应器中产L-色氨酸52.44 g/L，葡萄糖得率0.228 g/g，较亲本菌株分别提高23.24%和9.64%。
研究背景
L-色氨酸是必需芳香族氨基酸，不仅是蛋白质合成的基本构件，也是药物中间体、食品添加剂、营养保健品等功能化学品的重要前体。与传统的提取法和化学合成法相比，微生物发酵在环境可持续性、规模化能力及经济可行性方面具有显著优势，已成为工业L-色氨酸生产的主流路线。大肠杆菌因遗传背景清晰、生长快速、代谢工程工具丰富而被广泛用于构建L-色氨酸生产菌株。近年来，通过理性代谢工程与进化工程策略——包括解除关键酶反馈抑制、增强前体供给、阻断竞争途径、优化产物外排及自适应实验室进化——微生物L-色氨酸产量已获得大幅提升。然而，高产菌株的代谢表型往往涉及全局性调控网络的协同重组，单一途径改造难以突破瓶颈，亟需从系统层面解析限速因素。
研究方法
2.1 菌株、质粒与引物
本研究所用菌株、质粒及引物列于补充表S1–S3。L-色氨酸生产菌株W-24由大肠杆菌W3110经多轮诱变和代谢工程改造获得。大肠杆菌DH5α用于质粒构建和扩增，W-24及其衍生菌株用于基因功能验证和L-色氨酸生产。基因过表达采用pTrc99a质粒。需要维持质粒时，培养基中添加氨苄青霉素至终浓度100 mg/L。
【数据】氨苄青霉素浓度：100 mg/L；菌株：E. coli W3110衍生W-24、DH5α；质粒：pTrc99a
2.2 基因操作
基因删除和染色体整合采用基于CRISPR/Cas12a的基因组编辑系统，操作流程参照Zhu等（2022）的描述。进行基因删除或表达盒整合时，从大肠杆菌基因组DNA扩增约500-bp的同源臂。随后根据实验设计扩增目标表达盒或删除供体片段。供体DNA片段采用Gibson Assembly组装。针对目标基因组位点的特异性crRNA序列使用CRISPR-DT在线工具设计，克隆至pcrEG中构建引导质粒（Zhu等，2019）。将供体DNA、pEcCpf1及相应引导质粒共转化至受体菌株，进行同源重组介导的基因组编辑。重组菌株经菌落PCR和DNA测序验证后方可用于后续实验。验证完成后，在菌株表征和发酵实验前消除基因组编辑质粒pEcCpf1和pcrEG。基因过表达时，将目标基因克隆至pTrc99a，受Ptrc启动子控制。重组质粒经DNA测序确认后转化至相应宿主菌株进行后续研究。
【数据】同源臂长度：约500 bp；基因组编辑系统：CRISPR/Cas12a；组装方法：Gibson Assembly；验证方法：菌落PCR + DNA测序
2.3 摇瓶培养
除非另有说明，种子制备和摇瓶发酵采用相同培养条件。从LB琼脂平板挑取单菌落，接种至50-mL三角瓶中的10 mL LB培养基，于37°C、220 rpm培养约12 h制备种子液。随后，将3 mL种子液转移至含27 mL发酵培养基的500-mL三角瓶中，于37°C、220 rpm培养。发酵过程中，按需补加30%（w/v）葡萄糖溶液以维持碳源供给，用25%（v/v）氨水调节pH。采集发酵样品用于分析L-色氨酸效价、残余葡萄糖浓度和细胞生长。所有基于pTrc99a的过表达菌株，以终浓度0.5 mM的IPTG诱导基因表达。发酵培养基成分如下（g/L）：酵母提取物2.0；(NH4)2SO4 4.0；柠檬酸钠2.0；K2HPO4 6.0；KH2PO4 2.5；MgSO4·7H2O 2.0；谷氨酸钠0.5；葡萄糖20.0。此外，补加FeSO4·7H2O（30 mg/L）、MnSO4·H2O（5 mg/L）、生物素（0.1 mg/L）及维生素B1、B3、B5、B12（各0.2 mg/L）。
【数据】种子培养：10 mL LB、50-mL瓶、37°C、220 rpm、12 h；接种量：3 mL/27 mL；IPTG：0.5 mM；葡萄糖补加：30% (w/v)；pH调节：25% (v/v) NH3·H2O；发酵培养基组分：酵母提取物2.0 g/L、(NH4)2SO4 4.0 g/L、柠檬酸钠2.0 g/L、K2HPO4 6.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、谷氨酸钠0.5 g/L、葡萄糖20.0 g/L；微量元素：FeSO4·7H2O 30 mg/L、MnSO4·H2O 5 mg/L、生物素0.1 mg/L、维生素B1/B3/B5/B12各0.2 mg/L
2.4 5-L生物反应器补料分批发酵
放大发酵时，从LB琼脂平板挑取单菌落，接种至含120 mL LB培养基的500-mL摇瓶中，于37°C、220 rpm培养6–8 h。随后将种子液转移至含1.88 L种子培养基的5-L生物反应器中，继续培养10–12 h。所得种子培养液用于接种含新鲜发酵培养基的5-L生物反应器，初始工作体积调至2.0 L。补料分批发酵采用间歇补糖策略，在葡萄糖耗尽后启动补料。初始葡萄糖接近耗尽后，向反应器流加80%（w/v）葡萄糖溶液，维持残余葡萄糖浓度低于0.10%。通过自动调节搅拌转速和通气速率将溶解氧（DO）维持在25%。通过自动流加25%（v/v）氨水将pH控制在7.0 ± 0.02。种子培养基成分（g/L）：酵母提取物1.5；(NH4)2SO4 4.0；柠檬酸钠1.6；K2HPO4 6.0；KH2PO4 2.5；MgSO4·7H2O 1.5；葡萄糖40.0。培养基另补加10 mg/L FeSO4·7H2O、5 mg/L MnSO4·H2O、0.1 mg/L生物素及0.2 mg/L各维生素B1、B3、B5、B12。发酵培养基成分（g/L）：酵母提取物2.0；(NH4)2SO4 4.0；柠檬酸钠2.0；K2HPO4 6.0；KH2PO4 2.5；MgSO4·7H2O 2.0；谷氨酸钠0.5；L-异亮氨酸0.5；甜菜碱0.5；葡萄糖10.0。另补加30 mg/L FeSO4·7H2O、5 mg/L MnSO4·H2O、0.1 mg/L生物素及0.2 mg/L各维生素B1、B3、B5、B12。
【数据】种子培养：120 mL LB、500-mL瓶、37°C、220 rpm、6–8 h；二级种子：1.88 L种子培养基、5-L罐、10–12 h；初始工作体积：2.0 L；补糖：80% (w/v)葡萄糖、残余葡萄糖<0.10%；DO：25%；pH：7.0 ± 0.02；种子培养基：酵母提取物1.5 g/L、(NH4)2SO4 4.0 g/L、柠檬酸钠1.6 g/L、K2HPO4 6.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、葡萄糖40.0 g/L；发酵培养基：酵母提取物2.0 g/L、(NH4)2SO4 4.0 g/L、柠檬酸钠2.0 g/L、K2HPO4 6.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、谷氨酸钠0.5 g/L、L-异亮氨酸0.5 g/L、甜菜碱0.5 g/L、葡萄糖10.0 g/L
2.5 RNA测序与转录组分析
高产菌株W-24的样品在发酵10 h和26 h采集，分别对应指数期和稳定期，命名为W24-1和W24-2。野生型菌株E-WT样品在26 h（稳定期）采集用于比较转录组分析。每个样品取5 mL发酵液，4°C离心收集菌体，立即液氮速冻，−80°C保存备用。总RNA提取、文库构建、RNA测序及生物信息学分析由广州基迪奥生物科技有限公司完成。质量过滤后，将clean reads比对至参考基因组进行表达分析。差异表达基因（DEGs）采用DESeq2鉴定，显著性阈值为|log2FC| ≥ 1且错误发现率（FDR）< 0.05。功能注释、KEGG通路分类、富集分析及热图可视化使用OmicShare（Omicsmart）在线生物信息学平台完成。
【数据】取样时间点：10 h（指数期）、26 h（稳定期）；样品量：5 mL；DEG阈值：|log2FC| ≥ 1、FDR < 0.05；分析工具：DESeq2、OmicShare
2.6 细胞生长与代谢物分析
细胞生长通过测定600 nm处光密度（OD600）监测。样品用去离子水适当稀释后，使用紫外-可见分光光度计测定。葡萄糖浓度采用生物传感分析仪（SBA-40C，山东省科学院，中国）测定。发酵样品适当稀释后，12,000 rpm离心5 min，取上清进行分析。L-色氨酸浓度采用高效液相色谱（HPLC）测定。发酵样品离心后，上清经0.22-μm滤膜过滤后进行检测。样品在HPLC分析前用邻苯二甲醛（OPA）衍生化（Zhu等，2026）。葡萄糖得率按L-色氨酸产量与葡萄糖消耗量之比计算。所有实验至少设置三个生物学重复，结果以平均值±标准差（SD）表示。
【数据】OD600测定；离心：12,000 rpm、5 min；滤膜：0.22-μm；衍生化：OPA；重复数：≥3个生物学重复
研究结果
3.1 L-色氨酸生产菌株与野生型菌株的全局转录组分析
大肠杆菌W-24是基于野生型菌株E. coli W3110，通过ARTP诱变和多轮理性代谢工程改造获得的L-色氨酸高产菌株。为深入了解其高产表型相关的全局转录调控网络和潜在代谢重编程，研究采集了野生型菌株（E-WT）和W-24指数期（10 h，命名为W24-1）及稳定期（26 h，命名为W24-2）的样品进行转录组分析。选择26 h取样点代表W-24的稳定期，此时工程菌株处于相对稳定的生理状态，适合进行比较转录组分析。两株菌在相同发酵条件下培养，并在相同发酵时间点取样，以实现比较转录组分析。DEGs以|log2FC| ≥ 1和FDR < 0.05为阈值进行鉴定。
转录组数据显示，与E-WT相比，W24-2中共鉴定到2169个DEGs，其中770个基因显著上调，1399个基因显著下调。此外，从指数期到稳定期（W24-1 vs. W24-2）的转变过程中，超过2058个基因表现出显著的转录变化（图1A和B）。火山图分析进一步揭示了两组比较中广泛的转录改变，且下调基因数量超过上调基因。这些结果表明，高水平L-色氨酸生产伴随着广泛的转录重编程，工程菌株通过遗传修饰和发酵阶段转变的联合作用，形成了与野生型菌株截然不同的转录谱。
为表征DEGs的功能分布，进行了KEGG分类分析（图1C）。结果显示，两组比较中的DEGs主要富集于"代谢"和"环境信息处理"类别。在次级通路层面，碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢和膜转运含有大量DEGs。值得注意的是，在E-WT与W24-2的比较中，分别有167、140和143个DEGs归属于碳水化合物代谢、氨基酸代谢和膜转运通路。在膜转运类别中，鉴定到的DEGs主要归类于ABC转运蛋白、细菌分泌系统和PTS系统通路（图S1）。这些发现表明，高产菌株与野生型菌株之间在这些生物学过程中发生了广泛的转录变化。
鉴于L-色氨酸生物合成涉及前体供给、竞争性代谢途径和复杂调控过程，这些结果提示氨基酸代谢网络、葡萄糖利用途径及相关调控因子可能促成了高产表型。因此，后续分析聚焦于L-色氨酸生物合成途径、竞争性氨基酸生物合成途径、全局调控网络和葡萄糖利用过程，以进一步探究L-色氨酸过量生产的机制。
【数据】W24-2 vs E-WT：2169个DEGs（770上调、1399下调）；W24-1 vs W24-2：>2058个DEGs；碳水化合物代谢：167个DEGs；氨基酸代谢：140个DEGs；膜转运：143个DEGs
3.2 L-色氨酸生物合成与前体竞争代谢途径的转录组分析
L-色氨酸生物合成起始于EMP途径产生的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸戊糖途径（PPP）产生的赤藓糖-4-磷酸（E4P）。这两个前体由DAHP合酶缩合形成DAHP，随后通过莽草酸途径和分支酸途径转化为L-色氨酸（图2A）。
比较转录组分析揭示了高产菌株中心碳代谢和芳香族氨基酸生物合成的广泛转录变化。与野生型菌株相比，参与TCA循环的多个关键基因——包括gltA、acnB、icd、sucA、sucC和sdhA——整体呈现下调趋势。相反，将碳流导向芳香族氨基酸生物合成的抗反馈抑制DAHP合酶基因aroG显著上调（log2FC = +6.727）。此外，色氨酸操纵子（trpEDCBA）呈现较高的转录水平。这些转录特征与菌株构建过程中实施的工程策略一致，并与W-24的高L-色氨酸生产表型相关。
除了L-色氨酸生物合成途径的激活，转录组分析还揭示了围绕三个关键代谢节点——PEP、丙酮酸（PYR）和草酰乙酸（OAA）——的广泛转录变化（图2B）。与E-WT相比，催化PEP转化为PYR的丙酮酸激酶基因pykF显著下调（log2FC = −6.844），而负责将PEP转化为OAA的PEP羧化酶基因ppc也表现出显著下调（log2FC = −3.099）。需要指出的是，ppc同时作为回补酶补充TCA循环。因此，其转录水平的降低可能具有超越OAA衍生氨基酸生物合成的更广泛生理影响，有待进一步研究。
对竞争L-色氨酸前体的代谢途径进一步分析显示，多个氨基酸生物合成途径受到不同程度的抑制（表1）。在OAA衍生的天冬氨酸家族氨基酸生物合成途径上游，参与OAA转化为L-天冬氨酸并进一步转化为天冬氨酸半醛（ASA）的关键基因aspC和asd均表现出不同程度的下调。这表明天冬氨酸家族氨基酸生物合成的共同上游反应发生了显著的转录变化。在ASA下游，L-赖氨酸生物合成分支相关基因——包括lysC、dapA和dapB——整体呈下降趋势，表明L-赖氨酸生物合成分支的转录活性普遍降低。同时，L-苏氨酸生物合成相关基因thrA、thrB和thrC也整体下调；其中thrA变化幅度相对较小，而下游基因thrB和thrC下降更为显著。此外，编码L-异亮氨酸生物合成分支（来源于L-苏氨酸）起始酶的ilvA同样呈下降趋势，参与支链氨基酸共同合成步骤的ilvC也呈现负log2FC值。总体而言，这些转录变化从OAA衍生的共同生物合成途径延伸到多个下游生物合成分支——包括L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸——证明高产菌株中天冬氨酸家族氨基酸生物合成网络发生了系统性转录重编程。这一转录模式与5-L生物反应器中的胞外氨基酸谱基本一致，其中L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸分别以相对较低的浓度积累：0.777、0.057、0.036和0.042 g/L。
与PYR代谢节点相关的氨基酸生物合成途径同样表现出明显的转录变化（图2B和表1）。在支链氨基酸生物合成过程中，催化L-缬氨酸和L-异亮氨酸共同生物合成途径起始步骤的乙酰乳酸合酶基因ilvI显著下调，参与支链氨基酸下游合成步骤的ilvC也呈负log2FC值。
【数据】aroG：log2FC = +6.727；pykF：log2FC = −6.844；ppc：log2FC = −3.099；胞外氨基酸浓度：L-天冬氨酸0.777 g/L、L-赖氨酸0.057 g/L、L-苏氨酸0.036 g/L、L-异亮氨酸0.042 g/L
3.3 全局调控网络的转录变化
3.4 候选转录调控因子的功能验证
3.5 非PTS葡萄糖摄取途径的构建与评估
3.6 5-L生物反应器中工程菌株WTRP26的补料分批发酵性能
【数据】L-色氨酸产量：52.44 g/L；葡萄糖得率：0.228 g/g；葡萄糖得率提高：23.24%；L-色氨酸效价提高：9.64%
讨论与解读
高产菌株的培育通常伴随着全局性代谢重编程，而非仅仅是目标生物合成途径表达增强。近年来，多组学研究为氨基酸过量生产的分子机制提供了重要见解。例如，Sun等对L-苯丙氨酸生产菌株进行转录组与代谢组联合分析，证明其高产表型源于中心碳代谢——包括EMP途径、PPP、TCA循环和芳香族氨基酸生物合成网络——的协同重组，而非单一代谢途径的改变。与以往聚焦于单个工程靶点的研究不同，本研究将比较转录组分析应用于经深度工程改造的L-色氨酸生产菌株，从而能够识别多轮代谢工程后仍然存在的调控和代谢瓶颈。
比较转录组分析揭示了L-色氨酸生产菌株W-24中广泛的转录重编程。除L-色氨酸生物合成基因表达增强外，多个竞争PEP、OAA和PYR衍生前体的氨基酸生物合成途径被协同抑制。这些转录变化与前体向L-色氨酸途径的增强分配一致，也印证了菌株构建中实施的竞争途径弱化策略。功能验证实验进一步鉴定了ArcA和AsnC作为L-色氨酸生物合成的正调控靶点——这一发现无法仅通过常规途径工程预测。转录组数据还揭示ptsG显著上调，提示PTS依赖性葡萄糖转运仍是限制前体高效利用的潜在瓶颈。基于这一线索，本研究构建了GalP/Glf–Glk介导的非PTS葡萄糖利用途径，在减少PTS依赖性PEP消耗的同时提高葡萄糖利用效率。最终工程菌株在5-L生物反应器中产L-色氨酸52.44 g/L，葡萄糖得率0.228 g/g，较亲本菌株分别提高23.24%和9.64%。
编译者解读
本研究展示了转录组学与代谢工程深度融合的典型范式——不是"先改造、后测序"的验证模式，而是"先测序、后设计"的指导模式。通过转录组数据精准定位ArcA和AsnC两个此前难以通过直觉预测的调控靶点，并识别出PTS系统这一隐蔽的葡萄糖利用瓶颈，体现了系统生物学方法在复杂表型解析中的独特价值。非PTS途径的构建策略尤其巧妙：既减少PEP消耗以增加芳香族前体供给，又规避了PTS对葡萄糖转运的调控限制。不过，葡萄糖得率0.228 g/g（理论得率约0.32 g/g）仍存在提升空间，ppc下调对TCA回补的潜在代价也值得后续关注。该框架对其它芳香族氨基酸——如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸——的高产菌株开发具有直接参考价值。
参考来源
Zhu, R. (2026). Transcriptome-informed engineering of regulatory targets and glucose utilization pathways in Escherichia coli for improved L-tryptophan biosynthetic efficiency. Food Bioscience, 109707. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109707
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109707