来源：Modular engineering of precursor supply enables high-efficiency de novo pseudouridine production in Escherichia coli（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
假尿苷（Ψ）是mRNA疫苗与RNA药物稳定性修饰的关键核苷，但天然来源稀缺、化学合成成本高。本研究以UMP过量生产菌株为底盘，通过组装内源四酶下游通路、阻断假尿苷回收、改造转运系统、三层重构氨甲酰磷酸代谢以及动态调控PRPP-R5P供给，最终在5-L补料分批发酵中实现31.8 g/L假尿苷产量和0.88 g/L/h的生产率。该工作为核苷类生物制造提供了可扩展的模块化工程范式。
研究背景
假尿苷是RNA中含量最丰富的修饰核苷，在增强RNA稳定性、提高翻译效率和降低先天免疫激活方面发挥关键作用。mRNA疫苗和RNA疗法的快速扩张对假尿苷的高效经济制造提出了强烈需求。然而，天然假尿苷极为稀缺，化学合成成本高昂且环境负担重，因此亟需能以廉价碳源从头合成假尿苷的微生物细胞工厂。
大肠杆菌已成为假尿苷生物合成的有前景底盘。早期工作通过引入YjjG和ΨMP糖苷合成酶PsuG建立了从UMP到假尿苷的基础路线；Zhou等人构建了首条从葡萄糖出发的完全从头合成途径，通过增强嘧啶前体供给获得7.9 g/L假尿苷；Zhang等人通过戊糖磷酸途径强化和RBS调谐将产量提升至27.5 g/L；Wang等人则采用生长阶段依赖的pgi调控解决生长与生产之间的矛盾。尽管如此，前体供给的协同调控与下游通路的紧凑组装仍待系统优化。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于补充表S1。底盘菌株大肠杆菌UR1为前期构建的UMP过量生产菌株，携带经修饰的枯草芽孢杆菌F126 pyr操纵子。大肠杆菌DH5α用于质粒克隆与扩增。常规培养在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37°C、220 rpm进行。抗生素终浓度如下：氨苄青霉素100 mg/L、卡那霉素50 mg/L、壮观霉素100 mg/L。
【数据】培养基：LB；温度：37°C；转速：220 rpm；氨苄青霉素：100 mg/L；卡那霉素：50 mg/L；壮观霉素：100 mg/L
2.2 质粒构建
本研究所用引物序列列于补充表S2。重组质粒采用载体线性化、PCR扩增和Exnase II介导重组的流程构建。限制性内切酶（FastDigest®系列）购自Thermo Fisher Scientific，PCR试剂和ClonExpress® II一步克隆试剂盒购自南京Vazyme。为获得Ptrc–rihA表达盒，以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用引物SaII-Ptrc-rihA-S和HindIII-rihA-Ptrc-A扩增rihA基因，同时引入Ptrc启动子及SalI/HindIII酶切位点。载体pCS经SalI/HindIII双酶切线性化后与PCR片段组装，生成pCS-Ptrc-rihA。阳性克隆在卡那霉素平板上筛选，用PCS-JD-S/PCS-JD-A引物进行菌落PCR验证并测序确认。基于pCS-Ptrc-rihA，使用引物KpnI-Ptrc-yeiN-S和ApaI-yeiN-Ptrc-A扩增yeiN并插入KpnI/ApaI双酶切的pCS-Ptrc-rihA骨架，构建Ptrc–yeiN表达盒。验证正确的重组质粒命名为PCS-Ptrc-rihA-yeiN。
【数据】引物：SaII-Ptrc-rihA-S/HindIII-rihA-Ptrc-A、KpnI-Ptrc-yeiN-S/ApaI-yeiN-Ptrc-A；酶切位点：SalI/HindIII、KpnI/ApaI；抗性标记：卡那霉素
2.3 重组菌株构建
基因组编辑采用CRISPR/Cas9系统，质粒pREDCas9和pGRB由天津大学陈涛教授惠赠。所有gRNA引物、编辑位点和供体DNA结构列于补充表S3。靶标特异性sgRNA（20 bp前间隔序列）使用Cas-Designer平台设计。以yeiN整合至ygaY位点为例：gRNA片段通过gRNA-ygaY-S/gRNA-ygaY-A引物扩增后经退火产生，pGRB骨架用pGRB-S/pGRB-A引物线性化，与退火gRNA组装获得pGRB-ygaY。供体DNA通过重叠PCR制备，包含三个片段：上游同源臂（UP-ygaY-S/UP-ygaY-Ptrc-A）、Ptrc–yeiN片段（Ptrc-yeiN-S/yeiN-Ptrc-A）和下游同源臂（DN-Ptrc-ygaY-S/DN-ygaY-A）。携带pREDCas9的细胞经L-阿拉伯糖诱导后，用10%甘油洗涤制备电转感受态细胞。约500–800 ng供体DNA和200 ng pGRB-ygaY共电转，在LB中恢复1 h后涂布于含氨苄青霉素（100 mg/L）和壮观霉素（100 mg/L）的LB琼脂平板，30–32°C培养。阳性克隆通过菌落PCR（如UP-ygaY-S/DN-ygaY-A）和测序确认。pGRB通过L-阿拉伯糖诱导去除，pREDCas9在42°C孵育下消除，获得无质粒重组菌株。
【数据】电转：500–800 ng供体DNA + 200 ng pGRB；恢复时间：1 h；培养温度：30–32°C；抗生素：氨苄青霉素100 mg/L + 壮观霉素100 mg/L
2.4 argF和pgi调控模块构建
argF和pgi调控模块采用相同的pREDCas9/pGRB CRISPR/Cas9编辑系统构建。gRNA序列用Cas-Designer设计并克隆至pGRB，生成pGRB-argF和pGRB-pgi。上下游同源臂从大肠杆菌MG1655基因组扩增，调控元件分别使用对应PpyrB或生长相关启动子PrpsL/PrpsT/PrrnC的引物扩增。供体DNA片段通过重叠PCR组装。将供体DNA与pGRB-argF或pGRB-pgi共电转至携带pREDCas9的菌株中，正确重组子通过菌落PCR和测序鉴定。pGRB和pREDCas9按照2.3节所述标准程序去除。
【数据】启动子：PpyrB、PrpsL、PrpsT、PrrnC；编辑系统：CRISPR/Cas9
2.5 摇瓶发酵
#### 2.5.1 种子与发酵培养基
种子培养基（每L）：25 g葡萄糖、1.2 g KH₂PO₄、5 g酵母提取物、0.5 g MgSO₄、10 mg FeSO₄·7H₂O、10 mg MnSO₄·H₂O、3 g蛋白胨、VB1/VB3/VB5/VB12各1.3 mg、1 mg VH、2%（v/v）酚红、消泡剂按需添加，pH调至6.9–7.1。发酵培养基（每L）：20 g葡萄糖、2 g柠檬酸钠、5 g蛋白胨、2 g KH₂PO₄、2 g MgSO₄·7H₂O、4 g酵母提取物、20 mg FeSO₄·7H₂O、10 mg MnSO₄·H₂O、VB1/VB3/VB5/VB12/VH各2 mg、2%（v/v）酚红、消泡剂按需添加，pH调至6.9–7.1。
【数据】种子培养基葡萄糖：25 g/L；发酵培养基葡萄糖：20 g/L；pH：6.9–7.1；酚红：2%（v/v）
#### 2.5.2 摇瓶操作流程
单菌落接种至5 mL LB，37°C、220 rpm培养12 h。取三环转接至斜面培养（12 h），再进行第二次斜面活化。活化细胞接种至30 mL种子培养基，培养至OD₆₀₀ ≈ 10，按10%（v/v）接种量转接至发酵培养基。发酵在37°C、220 rpm条件下进行24 h。酚红作为pH指示剂，氨水用于维持中性pH，当持续碱性表明碳源耗尽时补充葡萄糖。
【数据】种子培养：37°C、220 rpm、12 h；接种量：10%（v/v）；发酵时间：24 h；OD₆₀₀：≈10
2.6 5-L补料分批发酵
#### 2.6.1 种子与发酵培养基
种子培养基（每L）：30 g葡萄糖、5 g酵母提取物、3 g蛋白胨、1.2 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄、10 mg FeSO₄·7H₂O、10 mg MnSO₄·H₂O、VB1/VB3/VB5/VB12各1.3 mg、1 mg VH、2%（v/v）酚红，pH 6.9–7.1。发酵培养基（每L）：20 g葡萄糖、2 g柠檬酸钠、5 g蛋白胨、0.3 g L-甲硫氨酸、2 g KH₂PO₄、2 g MgSO₄·7H₂O、20 mg FeSO₄·7H₂O、4 g酵母提取物、10 mg MnSO₄·H₂O、VB1/VB3/VB5/VB12各1 mg、0.5 mg VH，pH 6.9–7.1。
【数据】种子培养基葡萄糖：30 g/L；发酵培养基葡萄糖：20 g/L；L-甲硫氨酸：0.3 g/L；pH：6.9–7.1
#### 2.6.2 发酵操作流程
种子培养采用两步活化法，从甘油保存管接种至LB后转入种子培养基。种子培养在37°C进行，用氨水维持pH 6.8–7.2，DO控制在30–50%。当OD₆₀₀达到约15时，按30%（v/v）接种量转接至5-L生物反应器（工作体积3 L）。发酵在37°C、DO 35–50%条件下运行。采用80%（w/v）葡萄糖溶液补料，维持残糖0.1–5 g/L，使用SBA生物传感器分析仪监测。每2 h取样一次。
【数据】接种量：30%（v/v）；工作体积：3 L；温度：37°C；DO：35–50%；残糖：0.1–5 g/L；补料葡萄糖：80%（w/v）；取样间隔：2 h
2.7 分析方法
细胞生长通过OD₆₀₀监测。发酵液经离心（12,000 ×g，5 min）和0.22 μm滤膜过滤。所有报道的假尿苷、尿苷和尿嘧啶滴度均指培养上清液中的胞外浓度。假尿苷、尿苷和尿嘧啶通过等度HPLC定量，使用Titank C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）。流动相为5%甲醇和95%磷酸盐溶液（v/v），流速1.0 mL/min，柱温30°C，检测波长254 nm。发酵液中残余葡萄糖浓度使用SBA生物传感器分析仪（山东省科学院生物研究所）测定。简要流程：1.5 mL发酵样品在13,000 rpm离心3 min，收集上清液并按需用去离子水稀释，随后按照制造商说明用SBA生物传感器测量葡萄糖浓度。
【数据】离心：12,000 ×g、5 min；HPLC柱：Titank C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：30°C；检测波长：254 nm；离心：13,000 rpm、3 min
2.8 统计分析
所有实验至少设置三个生物学重复。两组比较采用双尾Student's t检验，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）加Tukey事后检验。统计学显著性定义为p < 0.05。数据分析使用OriginPro 2023和GraphPad Prism 9软件。
【数据】生物学重复：≥3；显著性阈值：p < 0.05；软件：OriginPro 2023、GraphPad Prism 9
研究结果
3.1 单向假尿苷合成与积累模块的构建
#### 3.1.1 下游假尿苷合成途径的组装
从葡萄糖出发的假尿苷从头生产始于建立不依赖昂贵核苷碱基补料的下游途径。UMP过量生产底盘大肠杆菌UR1携带经工程改造的枯草芽孢杆菌pyr操纵子，可增强嘧啶通量并缓解UMP反馈抑制。在此基础上，我们组装了一个紧凑的四酶模块，通过UMP去磷酸化、尿苷裂解、核糖磷酸化和ΨMP形成及去磷酸化的顺序反应将UMP转化为假尿苷（图2A）。为最小化下游分支的异源负担，四个假尿苷途径酶均选自大肠杆菌内源酶库。双功能5′-核苷酸酶YjjG被选为同时催化UMP水解和ΨMP去磷酸化的酶，因为已有报道表明其在所测试的磷酸酶中对ΨMP具有优异的底物特异性和催化效率。对于ΨMP形成，我们使用天然假尿苷单磷酸糖苷合成酶YeiN。尽管异源PsuG变体（如RsPsuG）在体外表现出高活性，但Wang等人证明内源EcYeiN/EcYjjG配对在大肠杆菌中支持更高的体内通量，因此我们在模块中使用这一完全内源的配对。对内源核糖核苷水解酶（RihA、RihB和RihC）的比较鉴定出RihA为最优酶，该结论基于全细胞生物催化测定。如图S1所示，过表达RihA的菌株实现最高假尿苷滴度（2.39 g/L）和最低残留尿苷（0.54 g/L），因此选择RihA用于途径组装。
逐步染色体整合阐明了限速步骤（图2B）。仅表达yeiN使假尿苷从0.03 g/L提升至1.13 g/L，表明ΨMP形成是首要限速步骤。添加rbsK使假尿苷浓度几乎翻倍至1.94 g/L，提示在该背景下R5P依赖的核糖利用用于ΨMP形成成为新的限制因素。值得注意的是，尽管尿苷和尿嘧啶的终点浓度没有显著变化，但假尿苷滴度的增加表明更多核糖被导向下游假尿苷途径。染色体整合rihA进一步将假尿苷产量提升至2.67 g/L，同时大幅降低尿苷。最后添加yjjG将滴度提升至2.98 g/L，同时将尿苷和尿嘧啶降至低水平，与去磷酸化能力增强一致。从0.03到2.98 g/L的逐步提升表明，嵌入UMP过量生产杂合底盘中的紧凑内源假尿苷模块（YjjG–RihA–RbsK–YeiN）能够在不需要大型异源多酶级联的情况下维持可观的碳通量流向假尿苷。这一遗传上简单、染色体编码的架构为后续系统级优化提供了坚实基础。
【数据】yeiN表达：假尿苷0.03→1.13 g/L；添加rbsK：→1.94 g/L；整合rihA：→2.67 g/L；添加yjjG：→2.98 g/L；RihA过表达：假尿苷2.39 g/L、残留尿苷0.54 g/L
#### 3.1.2 阻断假尿苷分解代谢与工程改造转运系统
在大肠杆菌中，假尿苷可被假尿苷激酶PsuK（YeiC）磷酸化再生为ΨMP，形成限制假尿苷净积累的回收循环。此前通过删除psuK基因破坏该循环的尝试仅适度提高假尿苷滴度，提示其他PfkB家族激酶存在补偿效应。鉴于YeiI与YeiC具有显著序列同源性且属于同一激酶家族，我们推测其可能提供这种冗余功能。该假说在菌株P5中得到验证——P5通过同时敲除yeiC和yeiI构建。yeiC和yeiI的同时敲除使假尿苷浓度提高7.7%，从2.98 g/L升至3.21 g/L（图3B）。这一结果证实，更广泛地破坏PfkB家族激酶是抑制假尿苷回收并提高产量的有效策略。
已有研究表明转运过程强烈影响假尿苷净积累和副产物谱，因此我们进一步工程改造了三个转运蛋白：尿嘧啶导入蛋白UraA、假尿苷特异性转运蛋白PsuT和广谱核苷透性酶NupC（图3A）。首先，我们采用"前体回收"策略，将uraA染色体整合至P5（获得菌株P6）以增强胞外尿嘧啶再摄取，该方法在其它核苷系统中已验证有效。菌株P6实现假尿苷滴度3.36 g/L，尿苷和尿嘧啶分别降低33.3%和24.1%（图3B）。其次，我们靶向PsuT以减少胞外假尿苷的无效循环。随后敲除psuT（菌株P7）使假尿苷滴度进一步升至3.62 g/L（图3B），与先前报道一致。相比之下，NupC的生理作用更为复杂：它虽以高亲和力导入尿苷，但也可能促进假尿苷摄取。尽管在其他系统中nupC与psuT一同被敲除以最小化假尿苷损失，但我们认为在严格从头合成且前体受限的背景下，保留NupC以增强尿苷补救比消除少量假尿苷导入更为有利。为验证这一点，我们在P7中过表达nupC，构建菌株P8。该策略进一步将假尿苷产量提升至4.08 g/L，并显著降低胞外尿苷和尿嘧啶（图3B），表明在这些条件下，改善尿苷回收的收益超过了残留假尿苷摄取的代价。
【数据】敲除yeiC/yeiI：假尿苷2.98→3.21 g/L（+7.7%）；整合uraA：→3.36 g/L，尿苷↓33.3%、尿嘧啶↓24.1%；敲除psuT：→3.62 g/L；过表达nupC：→4.08 g/L
3.2 氨甲酰磷酸代谢的系统优化
氨甲酰磷酸是连接谷氨酰胺和碳酸氢盐与嘧啶及精氨酸生物合成的关键含氮前体。尽管UMP过量生产底盘UR1具备基础合成能力，但初步工程菌株P8的低假尿苷滴度（4.08 g/L）以及尿苷和尿嘧啶的极低积累（图3B）提示，上游前体供给不足可能是限制整体通量的关键因素。为验证这一假说并系统消除该限制，我们开发了分层的"生成–分配–转化"策略来重构氨甲酰磷酸代谢（图4A）。
首先在"生成"层面，我们将第二拷贝反馈不敏感的pyrAA/pyrAB_bsu_E951引入P8获得菌株P9，旨在直接增强氨甲酰磷酸的合成能力。假尿苷滴度因此提高38%至5.64 g/L（图4B），证实增强前体通量确实有效，支持了上游限制的推断。然而，菌株P9的OD₆₀₀下降19%，同时伴随尿苷（1.59 g/L）和尿嘧啶（2.26 g/L）的显著积累，表明天然代谢网络无法容纳增加的氨甲酰磷酸通量。为解决前体分配不佳的问题，我们首先采用静态敲除策略——删除精氨酸生物合成途径的关键基因argF，构建菌株P10。强制将氨甲酰磷酸导向假尿苷合成使假尿苷浓度升至6.96 g/L，比P9（5.64 g/L）提高约24%。然而，argF敲除同时导致精氨酸营养缺陷，严重损害细胞生长（OD₆₀₀降至29.1）并导致途径中间体持续积累。随后我们设计了一种条件调控方案，将argF置于嘧啶响应启动子PpyrB控制之下，构建菌株P11。该电路的设计逻辑是在发酵早期维持正常argF表达……
【数据】P9：假尿苷5.64 g/L（+38%），OD₆₀₀↓19%，尿苷1.59 g/L、尿嘧啶2.26 g/L；P10：假尿苷6.96 g/L（+24% vs P9），OD₆₀₀=29.1
（注：原文节选在P11处截断，后续发酵结果以5-L补料分批发酵终值呈现。）
5-L补料分批发酵性能
工程菌株P19在5-L生物反应器中进行补料分批发酵验证。发酵过程中监测假尿苷产量、细胞生长（OD₆₀₀）、残糖和关键中间体的时间曲线。最终，该菌株实现31.8 g/L假尿苷产量和0.88 g/L/h的生产率，据我们所知，这是目前报道的大肠杆菌从头合成假尿苷的最高生产率之一。
【数据】假尿苷产量：31.8 g/L；生产率：0.88 g/L/h；反应器：5-L；数据来源：三个生物学重复的均值
讨论与解读
本研究通过将紧凑的下游途径与前体代谢的多层调控相结合，在大肠杆菌中构建了高性能假尿苷细胞工厂。完全内源的下游途径与关键异源前体调控元件的组合，实现了氨甲酰磷酸分配的代谢物响应控制，以及生长偶联的碳分配策略，从而在PRPP-R5P供给与细胞适应性之间取得平衡。在增强前体通量条件下的系统优化实现了碳流完全导向假尿苷，获得了具有工业竞争力的生产率。该框架为核苷类生物制造提供了可扩展蓝图，展示了系统模块化与协调前体途径控制在推进微生物细胞工厂中的力量。
编译者解读：本研究的核心价值在于"模块化+动态调控"的系统思维——不是简单地叠加基因，而是通过内源酶筛选、转运工程、代谢物响应启动子和生长偶联启动子的组合，实现了前体供给与细胞生长之间的精细平衡。31.8 g/L的产量和0.88 g/L/h的生产率已达到工业应用门槛。值得关注的是，该策略强调"少异源、多调控"，降低了菌株的代谢负担和工业放大的不确定性。局限在于当前工作仍依赖葡萄糖为碳源，且5-L规模尚需进一步放大验证。这一"生成–分配–转化"三层优化框架对其它核苷类产品（如假尿苷衍生物、修饰核苷）的生物制造具有直接借鉴意义。
参考来源
Huang X. Modular engineering of precursor supply enables high-efficiency de novo pseudouridine production in Escherichia coli. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.174782
DOI: 10.1016/j.cej.2026.174782