来源：Metabolic engineering of Escherichia coli for enhanced biosynthesis of polydatin（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
虎杖苷是一种具有药物开发潜力的生物活性二苯乙烯类化合物，但天然来源含量低、提取效率差。本研究通过系统代谢工程改造大肠杆菌，依次破解了白藜芦醇合酶（STS）可溶性差、糖基转移酶表达不足、前体供给受限、转录抑制因子调控等多重瓶颈，最终在3-L发酵罐中实现虎杖苷产量14.9 g/L。研究展示了多策略递进式优化的微生物细胞工厂构建范式。
研究背景
虎杖苷主要从药用植物虎杖中提取，具有抗炎、抗癌、抗氧化等生物活性。与苷元白藜芦醇相比，虎杖苷水溶性和生物利用度更优，2024年全球市场估值约264.6亿美元。然而，虎杖中虎杖苷含量仅为干重的0.3%–0.8%，大规模植物提取效率低且不可持续。构建微生物细胞工厂是替代植物提取的可行路径，但虎杖苷在大肠杆菌中的从头生物合成仍面临酶表达差、前体供给不足等挑战。
研究方法
2.1 培养基、菌株与质粒
菌株培养和质粒组装使用Luria-Bertani（LB）培养基。摇瓶培养使用M9H1培养基，成分包括：30 g/L甘油、6.78 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、5 g/L酵母提取物、1 g/L (NH₄)₂SO₄、0.5 g/L NaCl、2 g/L MOPS、0.12 g/L MgSO₄、0.011 g/L CaCl₂。补料分批发酵使用M9H2培养基，成分包括：30 g/L甘油、6.78 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、10 g/L酵母提取物、5 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L NaCl、2 g/L MOPS、0.12 g/L MgSO₄、0.011 g/L CaCl₂、6 mg/L FeSO₄·7H₂O、2 mg/L ZnSO₄·7H₂O、2 mg/L MnCl₂·4H₂O、1 mg/L CoCl₂·6H₂O、0.3 mg/L CuSO₄·5H₂O。必要时添加抗生素：壮观霉素120 mg/L、氨苄青霉素100 mg/L、卡那霉素50 mg/L。质粒扩增使用大肠杆菌DH5α，重组蛋白生产使用BL21(DE3)，虎杖苷生产菌株为E. coli BW25113(F')。途径组装使用pZE12和pCS27质粒，蛋白表达使用pET-Duet1载体。
【数据】M9H1培养基：30 g/L甘油、6.78 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、5 g/L酵母提取物、1 g/L (NH₄)₂SO₄；M9H2培养基：30 g/L甘油、10 g/L酵母提取物、5 g/L (NH₄)₂SO₄；抗生素：壮观霉素120 mg/L、氨苄青霉素100 mg/L、卡那霉素50 mg/L
2.2 DNA操作
来自葡萄（V. vinifera）的Vvsts、来自虎杖（P. cuspidatum）的Pcr3gat、来自短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）的Bbxfpk基因由上海桑贡生物科技有限公司合成。pET-VvSTS质粒通过将Vvsts克隆至pET-duet1的BamHI和XhoI位点构建。pZE50trc-VvSTS、pZElpp1.2-VvSTS和pZElpp4.2-VvSTS质粒通过将Vvsts克隆至pZE50trc、pZElpp1.2和pZElpp4.2的KpnI和XbaI位点构建。pZE50trc-VvSTS-PcR3GAT、pZElpp1.2-VvSTS-PcR3GAT和pZElpp4.2-VvSTS-PcR3GAT质粒通过将Vvsts和Pcr3gat克隆至相应载体（使用KpnI、HindIII和XbaI位点）构建。pCS-At4CL1质粒通过将拟南芥（A. thaliana）At4CL1基因克隆至pCS27的KpnI和BamHI位点构建。pCS-IbpAB、pCS-Sigma32、pCS-DnaKJ和pCS-GroLS质粒分别通过将来自BW25113的ibpA-ibpB、sigma32、dnaK-dnaJ和groELS克隆至pCS27的KpnI和BamHI位点构建。pCS-ibpAB-At4CL1、pCS-sigma32-At4CL1、pCS-dnaKJ-At4CL1和pCS-groLS-At4CL1质粒通过将PlacO1-ibpAB、PlacO1-sigma32、PlacO1-dnaKJ、PlacO1-groLS克隆至pCS-At4CL1的BcuI和SacI位点构建。pCS-mCherry质粒通过将mCherry基因插入pCS27的KpnI和BamHI位点获得。pCS50trc-mCherry、pCSlpp1.2-mCherry、pCSlpp4.2-mCherry质粒分别用P50trc、Plpp1.2、Plpp4.2替换PlacO1构建。pZE-RgTAL通过将红冬孢酵母（Rhodotorula glutinis）Rgtal基因插入pZE12的KpnI和XbaI位点合成。pZElpp1.2-VvSTS-lac-RgTAL质粒通过将PlacO1-RgTAL克隆至pZElpp1.2-VvSTS的BcuI和SacI位点构建。pZElpp1.2-VvSTS-lac-RgTAL-RgTAL质粒通过将PlacO1-RgTAL-RgTAL克隆至pZElpp1.2-VvSTS的BcuI和SacI位点构建。CRISPR-Cas9介导的基因插入和敲除参照既有方案（Cheng et al., 2025）。
【数据】克隆位点：BamHI/XhoI、KpnI/XbaI、KpnI/HindIII、BcuI/SacI等；基因来源：葡萄Vvsts、虎杖Pcr3gat、短双歧杆菌Bbxfpk、拟南芥At4CL1、红冬孢酵母Rgtal
2.3 蛋白纯化与SDS-PAGE分析
单菌落接种于4 mL LB培养基，37°C、200 rpm过夜培养。取1 mL培养物接种至50 mL LB中，相同温度和转速培养至OD600达0.6。加入0.5 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白生产，温度降至30°C，继续培养20小时。培养结束后，6000 rpm、4°C离心10分钟收集菌体。沉淀用裂解缓冲液重悬，超声破碎。裂解后样品6000 rpm、4°C离心10分钟，收集上清，沉淀用裂解缓冲液复溶。通过SDS-PAGE分析可溶与不可溶组分评估蛋白溶解度，ImageJ软件进行灰度定量。
【数据】培养条件：37°C、200 rpm；诱导：0.5 mM IPTG、30°C、20 h；离心：6000 rpm、4°C、10 min
2.4 虎杖苷生物合成
摇瓶实验：菌株先在4 mL LB中37°C、220 rpm培养12小时。取1 mL培养物转接至250 mL挡板瓶中的50 mL M9H1培养基，相同条件培养至OD600达0.6，用0.5 mM IPTG诱导，培养温度降至30°C。饲喂实验中，向培养物中添加对香豆酸（2.0 g/L）。
放大发酵：菌株先在4 mL LB中37°C、220 rpm培养12小时。随后取1 mL培养物加入50 mL M9H2培养基继续培养12小时。培养物接种至含1 L M9H2培养基的3-L生物反应器。用50% NH₄OH自动维持pH 6.9。通气量和溶氧（DO）分别维持在1.5 L/min和30%饱和度。OD600达10时，用0.5 mM IPTG诱导，温度降至30°C，DO水平随后调整至20%。此外，从24小时至60小时，以5.5 mL/h的恒定速率补加含25 g/L酵母提取物和15 g/L蛋白胨的补料液。
【数据】饲喂浓度：对香豆酸2.0 g/L；发酵条件：pH 6.9、通气量1.5 L/min、DO 30%→20%、诱导OD600=10、0.5 mM IPTG、30°C；补料：25 g/L酵母提取物+15 g/L蛋白胨、5.5 mL/h、24–60 h
2.5 荧光测量
细胞先在4 mL LB中37°C过夜培养。取10 μL培养物转接至黑色透明底96孔微孔板（Corning，NY，USA）中的200 μL M9H培养基（含适量抗生素）。样品在Synergy™微孔板读数仪（BioTek Instruments，VT，USA）中30°C培养24小时。每10分钟测量OD600和荧光（580 nm激发，620 nm发射）。每个条件设三次重复，荧光值归一化至对应OD600值。
【数据】荧光测量：激发580 nm、发射620 nm；间隔10 min；30°C、24 h；三次重复
2.6 实时荧光定量PCR（qPCR）分析
OD600达1.2–1.5时取2 mL样品，6000 rpm离心5分钟收集沉淀。使用Eastep® Super试剂盒（Promega，中国）提取总RNA。DNase I去除残留基因组DNA，NanoDrop测定RNA浓度。500 ng总RNA经First-strand cDNA合成Mix（Lablead，中国）逆转录为cDNA。使用2 × Realab Green PCR Fast Mixture（Lablead，中国）在QuantStudio 1系统（Thermo Fisher，美国）上进行qPCR。以看家基因rrsA作为内参。
【数据】取样OD600：1.2–1.5；RNA用量：500 ng；内参基因：rrsA
2.7 分析方法
高效液相色谱（HPLC）配备反相Diamonsil C18色谱柱（5 µm，250 × 4.6 mm）定量对香豆酸、白藜芦醇和虎杖苷。培养样品（400 µL）用甲醇提取（800 µL），12,000 rpm离心10分钟。上清液经0.22 µm滤膜过滤。流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）。色谱分离在40°C、1 mL/min流速下进行，梯度程序：0–13 min，10–65% B；13–15 min，65–100% B；15–16 min，100–10% B；16–22 min，10% B。产物和中间体浓度根据255 nm紫外吸收确定。
【数据】色谱柱：Diamonsil C18（5 µm，250 × 4.6 mm）；柱温：40°C；流速：1 mL/min；检测波长：255 nm；样品提取：400 µL样品+800 µL甲醇、12,000 rpm离心10 min
研究结果
3.1 提高VvSTS在大肠杆菌中的表达水平
高效生产虎杖苷需要建立将对香豆酸转化为虎杖苷的生物合成途径。来自拟南芥的At4CL1和来自葡萄的VvSTS可催化对香豆酸转化为白藜芦醇。白藜芦醇随后转化为虎杖苷可由地衣芽孢杆菌YjiC或虎杖PcR3GAT催化。然而，YjiC底物特异性宽泛，会产生多种白藜芦醇糖基化副产物。相比之下，PcR3GAT特异性催化白藜芦醇3位糖基化生成虎杖苷。因此，本研究选用At4CL1、VvSTS和PcR3GAT构建虎杖苷生物合成途径（图2A）。将pCS-At4CL1和pZE50trc-VvSTS-PcR3GAT质粒导入E. coli BW25113(F')构建菌株SHK01。添加2 g/L对香豆酸后，SHK01仅产生39.3 ± 4.6 mg/L虎杖苷（图2B），同时有1.9 g/L对香豆酸未转化。将At4CL1置于高拷贝质粒上增强其表达，结果并未提高虎杖苷产量（图S1），提示VvSTS催化的反应是途径中的限速步骤。
通过SDS-PAGE验证VvSTS在大肠杆菌中的表达，结果显示超过86%的VvSTS蛋白为不溶状态（图S2A）。鉴于分子伴侣和热激蛋白在改善蛋白溶解度方面发挥关键作用，研究采用热激蛋白IbpAB、Sigma32、DnaKJ和GroELS提高VvSTS溶解度，分别构建菌株SHK03-06。如图2C所示，携带GroELS的菌株SHK06虎杖苷产量最高，达63.2 ± 7.3 mg/L，较SHK01提高61%。SDS-PAGE分析进一步证实可溶性VvSTS蛋白比例从14%增加至60%（图S2A），与饲喂实验结果一致。
接下来，研究聚焦于优化启动子强度以进一步提高VvSTS表达水平。将原始P50trc启动子替换为更强启动子Plpp1.2和Plpp4.2，分别构建菌株SHK07和SHK08。饲喂实验表明，使用更强启动子驱动VvSTS表达显著提高了虎杖苷产量（图2D）。其中，在Plpp1.2启动子下表达VvSTS的菌株SHK07产量最高，达2.0 ± 0.1 g/L。同时观察到SHK07积累的对香豆酸水平最低，这可能与其在测试菌株中细胞密度最高有关——对香豆酸具有已知的细胞毒性。而菌株SHK08中更强的Plpp4.2启动子反而使虎杖苷产量降至348.7 ± 95.3 mg/L。SDS-PAGE分析显示，在Plpp1.2启动子控制下，VvSTS表达量提高3.3倍，且大部分蛋白以可溶形式存在。然而，SHK08中Plpp4.2启动子虽使VvSTS表达量更高，但大部分蛋白为不溶状态（图S2B）。此外，表现最佳的菌株SHK07积累了175.6 ± 25.4 mg/L白藜芦醇，表明PcR3GAT有限的转化能力是该菌株的新瓶颈。
【数据】SHK01虎杖苷：39.3 ± 4.6 mg/L（2 g/L对香豆酸饲喂）；SHK06虎杖苷：63.2 ± 7.3 mg/L（+61%）；可溶性VvSTS：14%→60%；SHK07虎杖苷：2.0 ± 0.1 g/L；SHK08虎杖苷：348.7 ± 95.3 mg/L；SHK07白藜芦醇积累：175.6 ± 25.4 mg/L
3.2 通过基因组整合精细调控PcR3GAT表达水平
为进一步优化虎杖苷生产，研究将Pcr3gat基因直接整合至基因组——这是避免高拷贝质粒引起生产不稳定性的常用方法。首先评估了使用不同启动子进行基因组整合PcR3GAT对虎杖苷生产的影响。将P50trc-Pcr3gat、Plpp1.2-Pcr3gat和Plpp4.2-Pcr3gat表达盒分别整合至E. coli BW25113(F')的yjiP位点，构建菌株SHK09、SHK10和SHK11。如图3A所示，直接向培养物中添加前体对香豆酸后，虎杖苷产量与启动子强度呈明显正相关。其中，携带Plpp4.2强启动子驱动PcR3GAT的菌株SHK11产量最高，达489.2 ± 60.0 mg/L。
随后，将Plpp4.2-Pcr3gat表达盒逐步整合至E. coli BW25113(F')基因组的yjiP、gapC、yncI、mbhA和ylbE位点，构建分别携带1至5个Pcr3gat拷贝的菌株SHK11-15。如图3B所示，增加Pcr3gat拷贝数提高了虎杖苷产量，同时前体对香豆酸和白藜芦醇水平相应降低。其中，携带4个Pcr3gat拷贝的菌株SHK14产量最高，达4.3 ± 0.1 g/L，对香豆酸转化摩尔收率为92.7%。拷贝数增至5个未进一步提高虎杖苷产量，表明4个Pcr3gat拷贝是该生物合成途径的最佳选择。
【数据】SHK11虎杖苷：489.2 ± 60.0 mg/L；SHK14虎杖苷：4.3 ± 0.1 g/L；对香豆酸转化摩尔收率：92.7%；Pcr3gat拷贝数：1–5个（4个为最优）
3.3 通过增强前体供给实现虎杖苷从头合成
为实现虎杖苷从头合成，构建pZE-RgTAL质粒用于将酪氨酸转化为对香豆酸。添加4 g/L酪氨酸后，携带pZE-RgTAL的E. coli BW25113(F')菌株在48小时内产生3.3 ± 0.1 g/L对香豆酸（图S4），表明RgTAL具有高催化活性。随后将RgTAL导入菌株SHK14构建菌株SHK16用于虎杖苷从头生产。然而，如图4A所示，仅合成205.9 ± 4.9 mg/L虎杖苷，且整个发酵过程中未检测到对香豆酸或酪氨酸积累，表明前体供给不足。
为增强碳流向莽草酸途径分配，引入反馈抗性突变体——3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶（AroGfbr）和预苯酸脱水酶（TyrAfbr），以减轻莽草酸途径的反馈抑制。将这些基因插入SHK16基因组构建菌株SHK17，虎杖苷产量增至1.2 ± 0.1 g/L（图4B）。随后，为增强酪氨酸生产，在SHK17中失活分支酸变位酶（PheA）构建菌株SHK18，虎杖苷产量进一步升至2.5 ± 0.1 g/L（图4C）。
接下来研究聚焦于提高细胞内E4P（赤藓糖-4-磷酸）的可利用性——这是莽草酸途径的关键前体。既往研究表明，提高E4P水平可增强莽草酸途径通量。为此，将来自短双歧杆菌的磷酸酮醇酶（BbXfpk）和大肠杆菌的磷酸转乙酰酶（EcPta）导入SHK18构建菌株SHK19，虎杖苷产量小幅升至2.7 ± 0.1 g/L（图4D）。为继续提高E4P浓度，在SHK19中过表达大肠杆菌转酮醇酶（TktA）和转醛醇酶（TalB）构建菌株SHK20。如图4E所示，虎杖苷产量提升至2.8 ± 0.1 g/L。值得注意的是，未观察到途径中间体积累，表明仍需进一步增强莽草酸途径以实现更高产量。
【数据】RgTAL产对香豆酸：3.3 ± 0.1 g/L（4 g/L酪氨酸、48 h）；SHK16虎杖苷：205.9 ± 4.9 mg/L；SHK17虎杖苷：1.2 ± 0.1 g/L；SHK18虎杖苷：2.5 ± 0.1 g/L；SHK19虎杖苷：2.7 ± 0.1 g/L；SHK20虎杖苷：2.8 ± 0.1 g/L
3.4 工程化转录抑制因子TyrR以进一步提高产量
为进一步提高虎杖苷产量，研究探索了工程化转录调控因子TyrR——已知其对莽草酸途径基因施加严格的转录抑制。首先验证了其对产量的影响。
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略在大肠杆菌中实现了虎杖苷的高效生物合成。关键瓶颈——STS可溶性差——通过热激蛋白共表达和启动子优化得以解决，转化能力提高50倍。多拷贝基因组整合精细调控PcR3GAT表达，使对香豆酸转化摩尔收率达92.7%。引入TyrR突变体平衡前体生物合成与细胞生长，最终通过增强RgTAL表达、提高丙二酰辅酶A可利用性及优化发酵条件，终产量达14.9 ± 0.3 g/L，得率0.14 g/g。
编译者解读：本研究是典型的"瓶颈逐级破解"式代谢工程范例——从单酶可溶性入手，依次解决表达水平、前体供给、转录调控和发酵工艺问题，每一步都有定量数据支撑决策。值得注意的是，研究对"强启动子不一定更好"这一反直觉现象的细致分析（Plpp4.2导致蛋白不可溶），体现了蛋白质量与数量平衡的重要性。从产业应用看，14.9 g/L的产量已具备一定商业化潜力，但0.14 g/g的得率仍有提升空间。未来若能将多轮基因组整合策略与动态调控结合，有望进一步降低生产成本。
参考来源
Sheng H. Metabolic engineering of Escherichia coli for enhanced biosynthesis of polydatin. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133106
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133106