来源：Engineering Escherichia coli for continuous L-valine production via two-stage biofilm and metabolic regulation（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
氨基酸连续微生物发酵长期受制于途径控制不佳与细胞截留不足。本研究构建了一株兼具增强生物膜形成与蓝光激活代谢能力的大肠杆菌：生长期以氰胺诱导系统驱动fliA表达加速生物膜形成，生产期以光遗传工具pDawn瞬时激活ilvCDE提升催化效率。最终菌株PDDI3-fliA+pDawn-ilvCDE在50 L生物反应器中连续发酵462小时，L-缬氨酸产量达71.63 g/L，糖酸转化率0.57 g/g，为目前大肠杆菌中报道的最高值。
研究背景
L-缬氨酸作为支链氨基酸，在饲料与医药等行业具有重要应用。微生物发酵因其可持续性与环境友好性，已成为L-缬氨酸生产的主流途径。大肠杆菌凭借遗传背景清晰、生长快速、代谢可塑性突出等优势，是广泛使用的生产宿主。然而，传统发酵过程仍受制于细胞截留不足、产量偏低、代谢瓶颈等问题，实现高效的连续转化存在困难。生物膜因高耐受性可保护细胞免受恶劣环境影响，结合固定化载体还能提升发酵的持续性与连续性。已有研究尝试增强大肠杆菌生物膜形成，但如何将生长阶段的生物膜调控与生产阶段的代谢通量优化相耦合，仍是连续发酵的关键难题。
研究方法
2.1 微生物、质粒与培养条件
氰胺、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素和链霉素购自Aldrich（中国上海）。除非另有说明，其他试剂购买后直接使用。本研究所用菌株和质粒汇总于表S1和表S2，引物及序列列于表S3。质粒pCas和pTarget用于基因组编辑，pTrc99a、pRSFDuet、pACYCDuet和pDawn用于基因表达。为便于理解菌株构建过程，图S1展示了操作流程示意。大肠杆菌菌株045作为L-缬氨酸生产菌株，同时作为遗传修饰的亲本菌株。大肠杆菌在37°C的LB培养基中培养，培养基成分为（g/L）：酵母提取物5、蛋白胨10、NaCl 10。异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）、氰胺和蓝光用于诱导基因表达。
【数据】培养基：LB（酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L）；温度：37°C；诱导剂：IPTG、氰胺、蓝光
2.2 工程菌株的构建
采用CRISPR-Cas9辅助的同源重组方法对大肠杆菌045进行基因敲除，包括∆fliA、∆flgN、∆flgK和∆flgL。靶向目的基因的sgRNA克隆至pTarget载体，带有同源臂的供体DNA片段共转化以完成编辑。阳性克隆通过菌落PCR筛选，并经Sanger测序确认。基因组编辑完成后，通过非选择性条件下连续传代消除pCas和pTarget质粒。按照标准分子克隆技术，将相应编码序列插入pTrc99a和pRSFDuet质粒，构建氰胺诱导系统。同样地，pACYCDuet和pDawn质粒用于光遗传介导的L-缬氨酸代谢系统调控。在大肠杆菌045中过表达+motA+B、+flgM、+fliA和+flgK+L，以评估鞭毛运动性对生物膜形成的影响。合成启动子PDDI2和PDDI3用于pRSFDuet衍生载体中的可调表达，光诱导表达则通过pDawn系统实现。
【数据】基因编辑：CRISPR-Cas9；敲除基因：fliA、flgN、flgK、flgL；过表达基因：motA+B、flgM、fliA、flgK+L；载体：pCas/pTarget（编辑）、pTrc99a/pRSFDuet（氰胺诱导）、pACYCDuet/pDawn（光遗传）
2.3 生物量、葡萄糖浓度与L-缬氨酸浓度检测
生物量以600 nm处吸光度定量。OD值趋于平稳后记录OD600。葡萄糖浓度采用3,5-二硝基水杨酸法测定。L-缬氨酸浓度通过高效液相色谱分析，流动相为乙腈/水（50:50，v/v）和50 mM乙酸钠，流速0.6 mL/min，UV检测波长360 nm。
【数据】OD检测波长：600 nm；葡萄糖测定：DNS法；HPLC条件：乙腈/水（50:50，v/v）+ 50 mM乙酸钠，流速0.6 mL/min，检测波长360 nm
2.4 生长曲线测定与生物膜定量
大肠杆菌在不同氰胺浓度和光照条件下的生长曲线按前述方法测定。简要而言，大肠杆菌于37°C、220 rpm过夜培养，然后用新鲜LB培养基稀释至初始OD600为0.1。每2小时用紫外-可见分光光度计测定OD600。氰胺浓度分别设为10 mM、20 mM和30 mM。为研究蓝光对细胞生长的影响，培养物分别暴露于不同蓝光强度（300 lx、600 lx和900 lx），或以完全黑暗作为对照。生物膜形成定量采用结晶紫染色法。经孵育、洗涤、固定和染料溶解步骤后，记录570 nm处吸光度。
【数据】初始OD600：0.1；测定间隔：2 h；氰胺浓度：10/20/30 mM；蓝光强度：300/600/900 lx；结晶紫染色检测波长：570 nm
2.5 运动性测定
采用群游（swarming）和泳动（swimming）实验评估软琼脂平板上的运动表型。群游运动在群游琼脂平板上评估，培养基含（g/L）：蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10、葡萄糖3、Eiken琼脂3。取1.2 μL菌液点样于平板中央，平板于25°C静置孵育16小时。泳动运动在泳动琼脂平板上进行，培养基含（g/L）：蛋白胨10、NaCl 7、Eiken琼脂5。用无菌接种针穿刺琼脂中心接种大肠杆菌，平板于25°C静置直立孵育40小时。
【数据】群游平板：蛋白胨10/酵母提取物5/NaCl 10/葡萄糖3/Eiken琼脂3（g/L），点样量1.2 μL，25°C、16 h；泳动平板：蛋白胨10/NaCl 7/Eiken琼脂5（g/L），穿刺接种，25°C、40 h
2.6 工程菌鞭毛与生物膜的视觉分析
采用扫描电子显微镜（SEM，Regulus8100，Hitachi，日本）观察大肠杆菌菌株在玻璃片和棉纤维（CF）上的表面附着差异。SEM还用于评估大肠杆菌细胞的形态完整性。经适当固定和脱水处理后，菌悬液进行细胞切片处理。透射电子显微镜（TEM，HT-7800，Hitachi，日本）用于采集鞭毛图像，加速电压约80 kV～120 kV。为可视化工程菌株的生物膜形成，使用4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞染色，以Zeiss LSM880共聚焦激光扫描显微镜成像。
【数据】SEM：Regulus8100（Hitachi）；TEM：HT-7800（Hitachi），加速电压80–120 kV；染色：DAPI；成像：Zeiss LSM880共聚焦显微镜
2.7 相对荧光强度分析与实时定量PCR
相对荧光强度分析在四种大肠杆菌菌株上进行：Ptrc-eGFP、PDDI2-eGFP、PDDI3-eGFP和野生型大肠杆菌045。各菌株于LB培养基中37°C、220 rpm过夜培养。其中，Ptrc-eGFP菌株以0.5 mM IPTG诱导，PDDI2-eGFP和PDDI3-eGFP菌株以不同浓度氰胺（10 mM、20 mM和30 mM）诱导。待菌悬液OD600稀释至0.5后，在激发波长490 nm、发射波长530 nm处测量荧光强度。相对荧光强度按以下公式计算：FP/OD = (FP − FPbp)/(OD − ODbp)，其中FPbp为野生型菌株的背景荧光值，ODbp为培养基的背景OD值。大肠杆菌045及工程菌株于25°C、200 rpm培养至对数中期（OD600 ≈ 0.6），随后加入IPTG和氰胺诱导基因表达。之后离心收集细胞，通过实时定量PCR（qRT-PCR）定量鞭毛运动相关基因（motA、motB、flgM、flgN、fliA、flgK、flgL）和L-缬氨酸生物合成途径基因（ilvC、ilvD、ilvE、ilvI、ilvH）的转录水平。使用Vazyme细菌RNA提取试剂盒（RC113-C1）按说明书提取总RNA，并以HiScript® II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper，R223–01，Vazyme）合成cDNA。qRT-PCR使用AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix（Q141–02，Vazyme）进行，扩增引物设计见表S4。相对表达量以16S rRNA为内参，采用2–ΔΔCt法计算。
【数据】IPTG浓度：0.5 mM；氰胺浓度：10/20/30 mM；荧光检测：激发490 nm/发射530 nm；诱导时机：OD600≈0.6；qRT-PCR内参：16S rRNA；定量方法：2–ΔΔCt
2.8 两阶段调控工程菌的连续发酵
种子培养和游离细胞发酵的培养基组成参照文献[15]。简要而言，将2 L种子培养液转入50 L锯齿形生物反应器。初始发酵于37°C进行，通气量1.3 m3/h，搅拌速度600 rpm，罐压0.05 MPa。通过补加氨水维持pH约7.0。每2小时取样监测葡萄糖浓度和OD600。当残余葡萄糖降至约1 g/L时，补入600 g/L葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度在1–2 g/L。当OD600达到40–50时，发酵转入催化阶段，此时搅拌和通气均降低……
【数据】种子液体积：2 L；反应器：50 L锯齿形；温度：37°C；通气量：1.3 m3/h；搅拌：600 rpm；罐压：0.05 MPa；pH：约7.0（氨水维持）；补糖：600 g/L葡萄糖液，维持1–2 g/L；阶段切换：OD600 40–50
研究结果
3.1 鞭毛运动基因对大肠杆菌生物膜形成的影响
如图1A所示，选取一组鞭毛和运动相关基因——包括motA、motB、fliA、flgM、flgN、flgK和flgL——进行遗传操作，以探究它们在大肠杆菌生物膜形成中的作用。为增强生长早期至生物膜发育阶段的细菌运动性，通过质粒表达构建了motA+B、flgM、fliA、flgN、flgK、flgL和flgK+L的过表达菌株。同时利用CRISPR-Cas9系统构建了fliA、flgN、flgK和flgL的敲除菌株，以阐明鞭毛功能和运动性对生物膜形成的影响。结果清晰显示，+fliA和+flgK+L菌株的生物膜形成较起始菌株大肠杆菌045分别显著增强了41.14%和39.87%，而敲除菌株则呈现相反趋势（图1B）。图1C中，通过TEM分析了各菌株的形态差异和鞭毛数量。与大肠杆菌045相比，鞭毛数量明显增加。+flgK+L菌株不仅呈现更多鞭毛，鞭毛长度也显著增长，证实fliA和flgK+L在鞭毛表型中发挥重要调控作用。此外，为考察工程菌株的运动性，进行了泳动和群游实验（图S2）。泳动描述细胞在液体或软半固体琼脂中的个体运动，群游则指细菌群体在半固体表面的协调集体运动。与大肠杆菌045不同，motA+B、fliA和flgK+L的过表达显著增强了细胞运动性，而其他基因几乎无影响。同时，菌落形态分析显示，大肠杆菌045呈现相对均一的菌落生长，而过表达菌株（motA+B、fliA和flgK+L）的菌落直径显著增大、表面纹路更复杂、厚度明显增加（表S5）。
【数据】生物膜增强：+fliA提升41.14%，+flgK+L提升39.87%；TEM观察：+flgK+L鞭毛数量增加且长度增长；运动性：motA+B、fliA、flgK+L过表达显著增强
3.2 新型氰胺诱导表达系统的构建及其对生物膜形成的增强
大肠杆菌的鞭毛赋予细胞向表面移动并驱动初始黏附所需的运动能力，从而促进生物膜形成。鉴于鞭毛运动相关基因调控对生物膜形成的积极作用，本研究构建了一种新型氰胺诱导表达系统以进一步增强生物膜发育（图2A），该系统同时还能降低生长阶段有害细菌污染的风险。尽管氰胺具有一定细胞毒性，OD600的波动表明10 mM氰胺对细胞生长影响极小（图2B）。随着氰胺浓度升高，其对大肠杆菌生长增殖的抑制作用愈发明显。同时值得注意的是，10 mM氰胺诱导对蜡样芽孢杆菌——污染的主要来源——的抑制作用显著且明确。为成功构建氰胺诱导表达系统，来源于酿酒酵母的两个启动子DDI2和DDI3经过密码子优化以适用于大肠杆菌表达。令人意外的是，两个DDI启动子均表现出不依赖温度的诱导特性，这有利于大肠杆菌所需的恒温发酵。相比之下，以Ptrc-eGFP菌株为对照，25°C和37°C下的荧光强度结果表明trc启动子具有温度依赖性（图2C）。此外，DDI3启动子在10 mM氰胺条件下表现出最高的诱导效率，这与图2B的趋势一致。与对照菌株相比的轻微形态变化也凸显了该系统在大肠杆菌中应用的可行性（图S3A）。如图2E所示，通过定量fliA、flgK和flgL的表达，进一步证实DDI3启动子在选定诱导条件下有效驱动了这些基因的转录。值得注意的是，DDI3启动子的引入不仅增加了鞭毛数量，还延长了鞭毛长度（表S6），菌株PDDI3-fliA和PDDI3-flgK+L的生物膜形成分别增加了54.7%和68.8%（图2D和图S3B）。此外，细胞附着的SEM和CLSM图像表明，过表达fliA和flgK+L介导的鞭毛运动性增强了细胞聚集，形成更致密、更有结构的生物膜（图S3C和S3D）。一般而言，稳健的细胞聚集和生物膜形成与增强的发酵和产物转化密切相关。如图S4A-S4C所示，大肠杆菌045、PDDI3-fliA和PDDI3-flgK+L的L-缬氨酸产量分别为84.42 g/L、87.35 g/L和65.64 g/L。PDDI3-fliA的生产速率（2.56 g/L/h）和糖酸转化率（0.46 g/g）也略高于大肠杆菌045（2.23 g/L/h和0.42 g/g）和PDDI3-flgK+L（1.97 g/L/h和0.32 g/g）。同时值得注意的是，工程菌株PDDI3-fliA比大肠杆菌045更早进入生产阶段，这可能有助于缩短发酵周期并提高生产率。形成鲜明对比的是，PDDI3-flgK+L的L-缬氨酸产量大幅下降，可能是由于工程策略严重破坏了代谢平衡。尽管氰胺诱导表达系统在促进生物膜形成方面具有优势，但固定化连续发酵的结果并不理想（图S4D-S4F）。菌株PDDI3-fliA未能维持游离细胞发酵中观察到的协同特性，表明仅调控鞭毛相关基因和增强生物膜形成不足以解决连续发酵系统中L-缬氨酸产量下降的问题。
【数据】10 mM氰胺对生长影响最小；DDI3启动子在10 mM氰胺下诱导效率最高；PDDI3-fliA生物膜增加54.7%，PDDI3-flgK+L增加68.8%；L-缬氨酸产量：045为84.42 g/L、PDDI3-fliA为87.35 g/L、PDDI3-flgK+L为65.64 g/L；生产速率：PDDI3-fliA为2.56 g/L/h、045为2.23 g/L/h、PDDI3-flgK+L为1.97 g/L/h；转化率：PDDI3-fliA为0.46 g/g、045为0.42 g/g、PDDI3-flgK+L为0.32 g/g
3.3 蓝光激活的光遗传调控L-缬氨酸代谢及两阶段调控策略在连续发酵中的应用
除在生长阶段构建氰胺诱导表达系统以促进生物膜形成外，还通过蓝光激活进一步调控L-缬氨酸的代谢通量。细菌能够感知光线，光信号会改变其生活方式。此外，蓝光信号已在大肠杆菌W1688固定化发酵生产L-苏氨酸中得到充分探索和良好应用。根据L-缬氨酸的主要生物合成途径（图3A），葡萄糖作为唯一碳源，被大肠杆菌吸附后经Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径代谢产生丙酮酸。通过一系列酶促反应，丙酮酸最终转化为L-缬氨酸。其中，参与该过程的关键酶包括乙酰羟基酸合酶III（AHAS III，由ilvIH编码）、乙酰羟基酸异构还原酶（ilvC）、二羟基酸脱水酶（ilvD）和转氨酶（ilvE）。为确保高效酶表达，以ilvE作为报告基因筛选了组成型启动子PBS76、厌氧启动子Pldh和蓝光诱导光遗传质粒pDawn（图3B）。尽管原有的两阶段发酵过程涉及好氧生长阶段后接厌氧催化阶段，但研究发现……
【数据】碳源：葡萄糖（经EMP途径）；关键酶：AHAS III（ilvIH）、ilvC、ilvD、ilvE；筛选启动子：PBS76、Pldh、pDawn（以ilvE为报告基因）
3.4 两阶段调控策略对工程菌连续发酵的影响
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究构建了整合氰胺诱导表达系统与蓝光激活光遗传调控的两阶段调控策略，并应用于L-缬氨酸连续发酵。得益于鞭毛相关基因的促进作用，发现fliA介导的鞭毛功能和运动性影响大肠杆菌045的生物膜形成。在10 mM氰胺诱导下，菌株PDDI3-fliA在生长阶段的生物膜形成提升了54.7%。此外，通过光遗传调控对代谢通量中ilvCDE的瞬时激活显著提高了生产阶段的催化效率，使L-缬氨酸产量提升13.92%。最终，双重调控菌株PDDI3-fliA+pDawn-ilvCDE在50 L生物反应器中持续运行462小时，实现糖酸转化率0.57 g/g、产率2.05 g/L/h。该研究为耦合微生物生长与产物合成提供了宝贵见解和实用策略。
编译者解读：该研究巧妙地将"长得好"（生物膜形成）与"产得多"（代谢通量优化）两个目标拆解到发酵的不同阶段，以氰胺和蓝光两种正交诱导信号分别控制，避免了单一诱导策略难以兼顾生长与生产的矛盾。0.57 g/g的糖酸转化率刷新了大肠杆菌产L-缬氨酸的纪录，说明这种"先固菌、后激活"的两步策略在连续发酵中确有实效。值得关注的是，该平台具备通用性——更换途径基因即可扩展至其他氨基酸或高附加值化学品生产。不过，50 L规模与工业级仍有距离，且氰胺的细胞毒性及成本在更大规模下的表现尚待验证。
参考来源
Sun W. Engineering Escherichia coli for continuous L-valine production via two-stage biofilm and metabolic regulation. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.173965
DOI: 10.1016/j.cej.2026.173965