来源：CRISPR/Cas9-coupled recombineering for metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
谷氨酸棒状杆菌是氨基酸生产的重要工业微生物，但其基因组编辑长期依赖随机突变和低效的双交换重组。本研究开发了一种基于RecT重组酶与CRISPR/Cas9反选择系统偶联的快速基因组编辑策略，可在两周内构建七种不同突变体，实现γ-氨基丁酸（GABA）生产的组合基因敲除优化。该系统无需筛选标记，可迭代操作，最终菌株不含质粒。
研究背景
氨基酸发酵生产长期依赖谷氨酸棒状杆菌，传统菌株改造主要依靠随机突变。尽管系统化工程改造该菌株的兴趣日益增长，其基因组编辑仍依赖基于罕见双交换事件的过时重组方案，耗时费力。近年发展的重组工程方法虽可实现少数碱基的定向突变，但需要靶基因特异性生物传感器和荧光激活细胞分选（FACS）进行无标记筛选，系统化基因组编辑依然困难。CRISPR/Cas系统已在人类、哺乳动物、植物和微生物中得到广泛应用，本研究旨在将其与重组工程偶联，开发适用于谷氨酸棒状杆菌的快速、无痕、迭代基因组编辑策略。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用细菌菌株和质粒列于表S1。大肠杆菌DH5α用于常规克隆工作。谷氨酸棒状杆菌L-谷氨酸高产菌株ATCC 13032作为敲除和GABA过表达的研究菌株。大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭载体pEKEx1用作CRISPR/Cas9系统的骨架。
大肠杆菌使用Luria-Bertani（LB）肉汤（10g/L NaCl、10g/L胰蛋白胨和5g/L酵母提取物）和LB琼脂（LB添加1.5%（w/v）琼脂）培养。需要时添加25µg/mL卡那霉素（Km）进行筛选。
谷氨酸棒状杆菌常规培养使用RG培养基，含10g/L葡萄糖、30g/L山梨醇、40g/L脑心浸液（BHI）和10g/L牛肉提取物。制备谷氨酸棒状杆菌电转感受态细胞所用NCM、BHIS、BHIN和LBBHIS培养基按Ruan等（2015）描述配制。
GABA生产时，谷氨酸棒状杆菌菌株在GAP-seed培养基中种子培养，该培养基含40g/L葡萄糖、0.4g/L MgSO₄·7H₂O、10g/L FeSO₄·7H₂O、10g/L MnSO₄·5H₂O、1g/L KH₂PO₄、4g/L尿素、200µg/L硫胺素-HCl、50µg/L生物素和55mL/L商品酱油（Soy Sauce Jin Gold F3，Sempio，韩国）。种子转接至GAP-main培养基，含70g/L葡萄糖、0.4g/L MgSO₄·7H₂O、10g/L FeSO₄·7H₂O、10g/L MnSO₄·5H₂O、30g/L (NH₄)₂SO₄、1g/L KH₂PO₄、200µg/L硫胺素-HCl、4µg/L生物素、15mL/L商品酱油和50g/L CaCO₃。GAP-seed和GAP-main培养基制备时分别加入5M KOH溶液调节pH至pH7.0和pH8.0。
【数据】培养基：LB/RG/GAP-seed/GAP-main；卡那霉素浓度：25µg/mL；葡萄糖浓度：10-70g/L；pH：7.0/8.0；温度：原文未详述
2.2 常规谷氨酸棒状杆菌转化方案
除非另有说明，谷氨酸棒状杆菌的常规质粒转化按Park等（2014）描述的电穿孔方案进行，转化子的恢复和铺板分别在RG培养基和添加适当抗生素的RG琼脂上进行。
【数据】转化方法：电穿孔；培养基：RG；抗生素：原文未详述
2.3 六聚组氨酸标签RecT载体的构建
本研究构建了基于pCC1的谷氨酸棒状杆菌载体，该载体与pEKEx1衍生载体兼容。四个不同质粒重组得到目标载体pTacCC1。
p15A复制起点以引物p15A_Gib_F（GGAGTGTATACTGGCTTACTATG）和p15A_Gib_R（ACATGAGAATTACAACTTATATCGTATG）从pACYC184扩增；pCC1复制起点以引物pCC1_Gib_F（CATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTAGTTCTCCCGCTGCTTGCTC）和pCC1_Gib_R（CGATAAGCTCCGGATCCTCTAATGCATGCTAGTGTGGTGAG）从pKCA212-MCS扩增；Ptac-rrnB T1T2以引物pTac_Gib_F（TAGAGGATCCGGAGCTTATCG）和rrnB_Gib_R（CGGATACATATTTGAATGTATTTAG）从pTac15K扩增；壮观霉素抗性基因aadA以引物aadA_Gib_F（CATAGTAAGCCAGTATACACTCCGACCGAGTGAGCTAGCTATTTG）和aadA_Gib_R（CTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTGAGCAATAACTAGCATAAC）从pCDFDuet-1扩增。扩增片段经Gibson组装（Gibson等，2009）构建pTacCC1。
编码RecT的基因以引物SLIC2_RecT_F（TCACACAGGAAACAGAATTCATGACTAAGCAACCACCAATC）和SLIC2_RecT_R（ATGCCTGCAGGTCGACTTATTCCTCTGAATTATCGATTACAC）从大肠杆菌K-12 MG1655基因组DNA扩增。扩增产物通过一步序列和连接非依赖性克隆（SLIC）方案（Jeong等，2012）克隆至经EcoRI和SalI消化的pTacCC1载体。产物随后导入染色体携带lacI^Q的E. coli XL1-Blue，细胞在添加80g/L葡萄糖的LB-Sm培养基中恢复和生长。采用该特定菌株和葡萄糖补充是为了最小化克隆质粒中RecT的表达，该表达会促进质粒自身基因与宿主染色体上相应recT基因的重组，导致质粒上recT基因丢失（注S1）。序列确认后的最终质粒导入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032以制备重组工程基础菌株。携带完整pTacCC1-recT的谷氨酸棒状杆菌转化菌落通过菌落PCR进一步筛选。
为增强重组工程基础菌株中RecT的表达，以引物His-recT_F（ATGCATCACCACCATCACCATATGACTAAGCAACCACCAAT）和RBS-Ptac_R（GAATTCTGTTTCCTGTGTGA）扩增pTacCC1-recT质粒，将六聚组氨酸标签融合至RecT的N端。扩增DNA片段经T4多核苷酸激酶（T4 PNK）和T4 DNA连接酶进行5'-磷酸化和连接，随后导入XL1-Blue。由于recT基因在质粒制备过程中持续丢失（注S1），pTacCC1-HrT连接产物导入后生长的XL1-Blue菌落立即从平板上收获并裂解以提取内部质粒。纯化的完整和受损pTacCC1-HrT质粒异质群体随后通过电穿孔导入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。携带完整pTacCC1-HrT的谷氨酸棒状杆菌菌落通过菌落PCR和后续质粒测序筛选。
【数据】载体骨架：pTacCC1/pEKEx1；抗生素标记：aadA（壮观霉素抗性）；葡萄糖浓度：80g/L；RecT来源：E. coli K-12 MG1655；His标签位置：N端
2.4 （d）Cas9-sgRNA载体的生成
化脓链球菌天然cas9基因以引物123_F（CGACCTGCAGATGGATAAGAAATACTCAAT）和123_R（TTGGCTGCAGTCAGTCACCTCCTAGCTGAC）从基因组DNA扩增。扩增的天然cas9基因和pEKEx1经PstI消化并连接，构建pEKEx1-Cas9spacer，在核糖体结合位点（AGGA）和起始密码子之间含有49-bp间隔序列。间隔区中不必要的片段通过以His_Cas9_F（ATGCATCACCACCATCACCATATGGATAAGAAATACTCAATAGGCT）和RBS-Ptac_R扩增质粒并以T4 PNK和T4 DNA连接酶连接替换为编码N端六聚组氨酸的序列，得到pEKEx1-Cas9。
六聚组氨酸标签、密码子优化的cas9和dcas9基因分别以引物4dmC_F（TCACACAGGAAACAGAATTCATGCATCATCATCATCATCATATGGACAAGAAGTACTCCATCGGC）和4dmC_R（GCAGGTCGACGGATCCAAGCTTTCAGTCGCCGCC）从pCRISPR-Cas9和pCRISPR-dCas9扩增（Tong等，2015）。密码子优化的cas9和dcas9基因通过SLIC（Jeong等，2012）克隆至经EcoRI和BamHI消化的pEKEx1，分别构建pEKEx1-Cas9opt和pEKEx1-dCas9opt。
为构建温度敏感型载体，pEKEx1中的pBL1复制起点按Nakamura等（2006）描述的方法转换为温度敏感版本（pBL1ts）。简要而言，以引物pBL1ts_F（TCTCTGGCTGAATTGGAAGTCATGG；下划线碱基将dC突变为dT）和pBL1ts_R（TGACCCCCAGCGAGAGTGAG）扩增pEKEx1，经T4 PNK和T4 DNA连接酶进行5'-磷酸化和连接，构建pEKTs1。随后以引物Ts_121_1F（CTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGT）和Ts_121_1R（AGACCCATCATAGTTTGCCCCCGCGACATTGACCATAAAT）扩增的温度敏感复制起点pBL1ts与以引物Ts_Cas9_1F（GGGCAAACTATGATGGGTCT）和Ts_Cas9_1R（ATGTTGTGTGGAATTGTGAG）从pEKEx1-Cas9opt扩增的PCR产物经Gibson组装（Gibson等，2009）连接。所得质粒pEKTs1-Cas9opt导入E. coli BL21(DE3)，再次制备用于StuI限制性内切酶消化。
质粒pUC19-sgRNA用作扩增侧翼为T1/TE终止子的sgRNA支架的模板。编码sgRNA支架和T1/TE终止子的DNA片段以引物EcoRI_sgRNA-T1TE+（ATGCTCGAATTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTCACTCGAGCCAGGCATCAAATA）和HindIII_T1TE-（ATGCTCAAGCTTTATAAACGCAGAAAGGCCCAC）从质粒pWAS扩增。扩增片段和质粒pUC19经EcoRI和HindIII消化并相互连接，构建pUC19-sgRNA。
以pUC19-sgRNA为模板，sgRNA靶标首先以引物M9_F（TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGG-N20-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT）和M5A_R（TATAGATATCCCGCGGTATATTAATTAATATAAACGCAGAAAGGCCC）通过PCR构建，其中M9_F包含20-nt目标序列（表S2）。进行第二轮PCR……
【数据】Cas9来源：S. pyogenes；密码子优化：放线菌优化；间隔序列：49-bp；His标签位置：N端；sgRNA靶标长度：20-nt
研究结果
3.1 验证谷氨酸棒状杆菌中功能性Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物的表达
为测试Cas9-sgRNA系统能否引入双链断裂（DSB）并进一步诱导目标基因组位点的修饰，首先需要验证Cas9和sgRNA在谷氨酸棒状杆菌中的功能性。为在谷氨酸棒状杆菌中表达Cas9，构建了携带化脓链球菌cas9基因的质粒pEKEx1-Cas9（表S1）。然而，多次尝试转化后均无法获得携带该质粒的谷氨酸棒状杆菌菌落，这似乎是由于毒性Cas9在高水平下的泄漏表达所致（注S2）。经过各种尝试，偶然发现携带针对放线菌使用进行密码子优化的cas9基因的质粒pEKEx1-Cas9opt（Tong等，2015）可以成功转化谷氨酸棒状杆菌（表S1和注S2）。
Cas9-sgRNA系统仅需一个sgRNA表达单元，而Cas9-双RNA系统需要分别侧翼为启动子和终止子的crRNA和tracrRNA基因。选择使用sgRNA而非双RNA系统，以避免启动子和终止子序列的重复使用，简化CRISPR/Cas9系统载体。为制备用于基因组靶向的Cas9-sgRNA载体（pCG9系列）（表S1），利用pEKEx1-Cas9opt的StuI位点，使侧翼为tac启动子和T1/TE终止子的sgRNA序列可通过延伸PCR和Gibson组装（Gibson等，2009）轻松整合，无需干扰cas9基因（图1a和表S2）。该sgRNA基因克隆策略允许高效构建Cas9-sgRNA载体，无需检查4.1-kb的cas9基因。
作为概念验证，首先构建了靶向精氨酸阻遏基因argR的质粒pCG9-argR1（guide序列信息见表S1），以检测Cas9-sgRNA RNP复合物在谷氨酸棒状杆菌中的体内功能性。然而，即使在没有IPTG诱导的情况下，用pCG9-argR1电穿孔谷氨酸棒状杆菌也未形成任何菌落（图1b）。另一方面，导入Cas9载体pEKEx1-Cas9opt、sgRNA载体pEKEx1-argR1和dCas9-sgRNA载体pdCG9-argR1时可观察到转化菌落。由于功能性Cas9-sgRNA复合物在染色体上诱导DSB对许多细菌是致死的（Bikard等，2012；Cui和Bikard，2016；Gomaa等，2014；Oh和van Pijkeren，2014；Vercoe等，2013），上述结果表明存在功能性Cas9-sgRNA复合物的泄漏表达。这一观察进一步表明，谷氨酸棒状杆菌缺乏高效重组途径和DSB修复途径——例如非同源末端连接（NHEJ）途径——是基因组修复效率低下的原因（Resende等，2011）。
由于使用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑需要PAM序列，我们检测了PAM序列在谷氨酸棒状杆菌基因组中出现的频率。化脓链球菌Cas9识别的PAM序列为NGG，在谷氨酸棒状杆菌中频繁出现。统计上，谷氨酸棒状杆菌的GC含量在染色体大部分区域介于50%至60%之间（平均GC含量为53.8%）。因此，谷氨酸棒状杆菌基因组中PAM的预期频率为0.145，按(0.538 × 0.5)² × 2计算。这表明谷氨酸棒状杆菌任意100-bp双链DNA片段中预计存在超过14个PAM位点。这一简单计算推断，在敲除目标基因选择靶位点时，PAM要求不太可能构成限制。
【数据】PAM频率：0.145（计算值）；GC含量：53.8%（平均）；100-bp片段PAM数：>14；转化结果：pCG9-argR1零菌落
3.2 引入同源臂不足以实现HDR
由于谷氨酸棒状杆菌无法修复DSB，将同源模板DNA与Cas9-sgRNA载体pCG9-argR1一起导入谷氨酸棒状杆菌，以在最简组件条件下诱导切割靶位点的重组并敲除目标基因。当pCG9-argR1与不同长度的双链DNA（dsDNA）——包括线性和复制型质粒形式——一起导入时，未能观察到任何阳性突变体，这些dsDNA包含壮观霉素抗性基因aadA及其与sgRNA靶位点上下游各100-、500-和1000-bp的同源序列。虽然有报道称以质粒形式导入细胞的同源臂可促进靶位点的重组工程（Jiang等，2015），但将同源臂整合入pCG9-argR1不足以在谷氨酸棒状杆菌中诱导目标位点的预期修饰。
当两侧各含40或50nt同源臂的单链寡脱氧核糖核苷酸（ssODN）作为复制叉后随链引物导入时，也未观察到阳性转化子。设计用于替换几个bp或删除几个bp至数百bp的ssODN均未导致成功敲除。我们还尝试了各种类型的错配，包括C-C错配、反复摆动和5-nt连续错配，这些错配据报道可抑制核苷酸切除修复（NER）途径并促进ssODN介导的基因组工程（Thomason等，2014）。然而，未观察到敲除菌落（数据未显示）。
【数据】同源臂长度：100/500/1000-bp（dsDNA）、40/50-nt（ssODN）；结果：无阳性转化子
3.3 重组工程偶联CRISPR/Cas9促进基因敲除
上述结果表明谷氨酸棒状杆菌的内源重组途径效率低下。因此，我们决定引入额外的重组酶以促进靶位点的重组，这已被证明可用于一些为细菌基因组工程开发的CRISPR/Cas9系统（Bassalo等，2016；Choi和Lee，2016；Jiang等，2013，2015；Oh和van Pijkeren，2014；Reisch和Prather，2015）。大肠杆菌前噬菌体重组酶RecT此前被报道最适合谷氨酸棒状杆菌中ssODN的重组（Binder等，2013）。然而，使用该方法筛选突变体存在问题，需要基于FACS的筛选。这促使我们开发了用于谷氨酸棒状杆菌基因组工程的CRISPR/Cas9偶联重组工程策略；RecT和ssODN编辑基因组，而Cas9-sgRNA RNP复合物通过引入不可修复的DSB阻止未编辑细胞的存活，从而产生反选择效应，正如Oh和van Pijkeren（2014）所讨论的（图2）。
更详细地描述，与RecT蛋白偶联的ssODN在复制过程中用作冈崎片段的引物。由于ssODN退火导致sgRNA靶标结合序列的丢失，Cas9-sgRNA复合物仅作用于未编辑的细胞。此外，卡那霉素抗性基因被引入Cas9-sgRNA载体，使得未转化该载体的细胞在卡那霉素存在下无法存活。因此，通过这种双重反选择系统可以高效筛选基因组已编辑的细胞（图2）。
为在无调控的tac启动子下组成型表达recT基因，构建了质粒pTacCC1-HrT（图S2a和表S1）。首先导入pTacCC1-HrT使细胞具备重组能力，随后导入pCG9-argR1和ssODN以敲除目标基因（图3a和表S4）。选择argR基因作为敲除靶基因，据此设计了长度为80bp的ssODN（ssODNargR_400）以删除argR基因的400bp；此处选择400-bp缺失是为了通过PCR（引物信息见表S3）和后续凝胶电泳轻松快速验证基因敲除成功，而非通过测序。使用该系统，可以获得argR基因缺失400bp的谷氨酸棒状杆菌突变体（图3b），但结果不易重复；十次实验中仅两次成功实现基因敲除。
【数据】ssODN长度：80bp；缺失大小：400bp；成功率：2/10（20%）
3.4 CRISPR/Cas9偶联重组工程系统的优化
讨论与解读
本研究成功开发了CRISPR/Cas9偶联重组工程系统，实现了谷氨酸棒状杆菌多个基因的快速、高效、无痕敲除。该系统将RecT重组酶介导的ssODN基因组编辑与Cas9-sgRNA反选择机制相结合，通过双重反选择高效富集编辑细胞。研究中发现天然cas9基因的泄漏表达对谷氨酸棒状杆菌具有毒性，而密码子优化的cas9可解决这一问题；同时，简单的同源臂或ssODN导入不足以实现同源定向修复，必须引入外源重组酶。该系统可在两周内构建七种不同突变体，用于研究三个基因组合敲除对GABA生产的影响。该基因组工程策略将加速谷氨酸棒状杆菌这一重要工业菌株的代谢工程改造，用于从可再生非粮食生物质生产氨基酸和其他目标化学品。本研究所用的开发策略经适当调整后，可普遍适用于其他微生物基因组工程系统的开发。
编译者解读：该研究巧妙地将RecT介导的重组工程与CRISPR/Cas9反选择偶联，解决了谷氨酸棒状杆菌缺乏高效内源重组和DSB修复途径的瓶颈。值得注意的是，研究者在优化过程中系统排查了多个失败路径（同源臂、ssODN、错配设计），这种"负面结果"的完整记录对后续研究具有重要参考价值。从合成生物学应用角度看，该系统的迭代性和无质粒终态设计使其成为工业菌株连续改造的实用工具，但初始敲除效率（2/10）提示该系统在通量方面仍有优化空间。
参考来源
Cho, J.S., et al. CRISPR/Cas9-coupled recombineering for metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum. Metabolic Engineering, 2017.
DOI: 10.1016/j.ymben.2017.06.010
DOI: 10.1016/j.ymben.2017.06.010