来源：Metabolic engineering and high-cell-density fermentation of Corynebacterium glutamicum to improve isopropanol production（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
异丙醇（IPA）是化工行业中重要的有机溶剂与中间体，当前石油基生产工艺能耗高、污染重。本研究以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032为底盘菌株，通过转录组分析锁定高密度发酵条件下副产物代谢的关键靶点，结合CRISPR辅助基因组编辑、Entner-Doudoroff（ED）途径引入及厌氧途径抑制等策略，系统重构菌株中心碳代谢。最终在1.5 L发酵罐中通过高密度补料分批发酵，实现IPA产量30.66 ± 1.24 g/L、产率0.53 ± 0.03 mol/mol、生产强度511.08 ± 20.72 mg/L/h，为目前谷氨酸棒状杆菌中IPA生产的最高水平。
研究背景
异丙醇广泛应用于溶剂、消毒剂及先进材料前体等领域。现行IPA生产工艺依赖石油资源且能耗巨大，伴随废液与废硫酸排放，环境负荷高。利用微生物将可再生资源转化为IPA是替代石化路线的绿色方案。微生物中IPA合成以乙酰辅酶A为起点：ThlA催化两分子乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A；AtoDA将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸；Adc脱羧生成丙酮；NADPH依赖型仲醇脱氢酶Sadh最终将丙酮还原为IPA。已有研究在大肠杆菌、拜氏梭菌等菌株中探索IPA生产，但产量与产率仍不理想。谷氨酸棒状杆菌具有天然耐受高浓度有机酸与高密度发酵的优势，是工业氨基酸生产的主力菌株，但在IPA合成方面面临碳流偏向副产物的瓶颈。本研究以此为切入点，系统改造其代谢网络。
研究方法
2.1 重组质粒与菌株构建
所有引物由BIONICS或Macrogen（韩国）合成，列于附表S1。目标基因使用KOD-plus-（Toyobo，日本）或nPfu-forte（Enzynomics，韩国）聚合酶扩增。用于CRISPR/Cas12a辅助基因组编辑的ldh（编码L-乳酸脱氢酶）、ppc（编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）、pta（编码磷酸转乙酰酶）、ack（编码乙酸激酶）和pckA（编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）基因均从谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组DNA（gDNA）中获取。来自运动发酵单胞菌ATCC 1534的zwf（编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、edd（编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶）和eda（编码2-酮-3-脱氧葡萄糖酸-6-磷酸醛缩酶）基因构成ED途径。上述gDNA使用Wizard® Genomic DNA Purification Kit（Promega，美国）提取。
采用pJYS3(MB1)_Peftu载体系列表达CRISPR-Cas12a系统，包含目标crRNA间隔序列与Cas12a蛋白。PAM位点与crRNA间隔序列通过CRISPR RGEN工具（http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计。利用基于SacB反向筛选的同源重组载体pS18mobsacB、pS18_Ptac-sacB和pS18_Plac-sacB提升CRISPR/Cas12a基因组编辑效率。pS18mobsacB、pS18_Ptac-sacB和pS18_Plac-sacB载体系列通过将靶基因（ldh、ppc、pta、ack、pckA）两端各插入700 bp同源臂构建（图1）。为引入ED途径，将zwf、edd、eda基因插入pS18mobsacB载体，两端各含700 bp的谷氨酸棒状杆菌着陆垫（CgLP4）序列。pS18mobsacB载体由pK18mobsacB改造而来——将卡那霉素抗性基因（KanR）替换为壮观霉素抗性基因（SpcR），以区别于含KanR的pJYS3(MB1)载体系列。pS18_Ptac-sacB与pS18_Plac-sacB载体分别以Ptac和Plac启动子替换pS18mobsacB中的PsacB启动子，以增强SacB表达。IPA生产使用pEKEx2_H36-TDACH和pMTC_POX载体。
构建重组载体时，质粒与PCR产物经适宜限制性内切酶（NEB，美国）处理后，使用Gibson Assembly® Master Mix（NEB，美国）或T4连接酶（Enzynomics，韩国）进行连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α及谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，方法参照Ko等（2021）的既有方案。重组载体经Macrogen或BIONICS（韩国）进行DNA Sanger测序验证。所构建的全部质粒与菌株列于附表S2与S3。
SacB介导的CRISPR/Cas12a辅助基因组编辑流程如下：将pS18mobsacB、pS18_Ptac-sacB或pS18_Plac-sacB载体导入重组谷氨酸棒状杆菌感受态细胞。在含200 µg/mL壮观霉素的BHISG琼脂培养基上培养48 h后，挑取生长菌落——这些菌落表明载体已整合至基因组（第一次重组），随即制备为新的感受态细胞。为利用CRISPR/Cas12a系统进行筛选，将pJYS3(MB1)载体系列导入新制备的感受态细胞，涂布于含20%蔗糖和25 µg/mL卡那霉素的BHISG琼脂培养基。培养48 h后，通过PCR与测序验证菌落编辑情况。pJYS3(MB1)载体系列的消除参照Ko等（2022）的方法。
2.2 培养基组成
LB培养基（每升含5 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨、10 g氯化钠）用于大肠杆菌DH5α预培养；BHISG培养基（每升含37 g脑心浸液、91 g山梨醇、20 g葡萄糖）用于谷氨酸棒状杆菌预培养。必要时向培养基中添加抗生素，浓度如下：50 μg/mL氨苄青霉素、25 μg/mL卡那霉素、33 μg/mL氯霉素或50 μg/mL壮观霉素。
高密度发酵的谷氨酸棒状杆菌预培养在A培养基中进行。A培养基每升含：7.7 g酸水解酪蛋白、7 g硫酸铵、11.2 g柠檬酸三钠二水合物、2 g酵母提取物、1 g尿素、0.5 g磷酸二氢钾、0.5 g无水磷酸氢二钾、0.5 g硫酸镁、0.2 mg生物素、0.2 mg盐酸硫胺素、6 mg七水合硫酸亚铁、4.2 mg硫酸锰。主培养在BTC培养基中进行——即在BT培养基中额外添加11.2 g/L柠檬酸钠。BTC培养基每升含：7 g硫酸铵、11.2 g柠檬酸三钠二水合物、2 g尿素、0.5 g磷酸二氢钾、0.5 g无水磷酸氢二钾、0.5 g硫酸镁、0.002 mg生物素、0.2 mg盐酸硫胺素、6 mg七水合硫酸亚铁、4.0 mg硫酸锰。添加柠檬酸钠是为增强IPA产量，如前所述。A培养基与BTC培养基的初始葡萄糖浓度均为40 g/L。必要时添加25 μg/mL卡那霉素、10 μg/mL氯霉素或200 μg/mL壮观霉素。
2.3 高密度发酵
自制小型发酵罐中的高密度发酵流程如下（图S1）：首先，将深冷冰箱保存的新鲜菌种在BHISG琼脂平板上30°C培养24 h。第一次预培养：挑取划线菌落接种于20 mL BHISG培养基，30°C、200 rpm过夜培养。第二次预培养：在200 mL A培养基中，30°C、200 rpm培养24 h。第一次与第二次预培养的初始光密度（OD）约为1.0。主培养在500 mL GLS80广口瓶（Duran，德国）中盛装的200 mL BTC培养基内进行，初始细胞密度调至OD约30（图S1）。含重组载体的菌株发酵时，向培养基中添加1 mM IPTG、26 µg/mL卡那霉素和10 µg/mL氯霉素。
自制小型发酵罐配备pH计与酸/碱泵用于pH控制，以及气泵与流量计用于供气。通过添加1 N H2SO4和1 N NaOH维持pH为7。供气条件为0.2 vvm或1.0 vvm。挥发性IPA通过连接至小型发酵罐的冷阱装置（Daihan Scientific，韩国）收集。为高效发酵，在第二次预培养（500 mL A培养基）和主培养（500 mL BTC培养基）中使用了配备完善过程组件的1.5 L罐式发酵罐（Hanil，韩国）（图S1）。
高密度补料分批发酵在通气速率1.0 vvm、初始细胞密度约OD 100条件下进行。采用DO-stat法供给50%（w/v）葡萄糖溶液——当溶解氧（DO）水平达到70%时启动补料。补料流速设定为10.0 mL/min，每次DO达到该阈值时注射30秒。IPA通过连接1.5 L发酵罐出气口的管路收集至含20 L蒸馏水的容器中。
2.4 分析方法
大肠杆菌DH5α与谷氨酸棒状杆菌的细胞生长通过测定600 nm处光密度（OD600）监测。葡萄糖、有机酸及IPA浓度采用高效液相色谱（HPLC）定量分析。IPA产量、产率及生产强度按标准公式计算。转录组分析按照既有方法进行，样本来自高密度发酵条件下的细胞。所有发酵实验均设三次重复，数据以平均值±标准差表示。统计分析采用Student's t检验，p < 0.05视为差异显著。
研究结果
3.1 基于转录组分析的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032代谢工程策略
谷氨酸棒状杆菌虽有诸多优势，但在正常发酵或高密度发酵条件下，其IPA生产的产率均低于其他产品。这表明大部分碳源（如丙酮酸和乙酰辅酶A）可能被分流至其他代谢副产物而非IPA。高密度发酵的缺氧条件下，微生物进入厌氧状态，主要将丙酮酸转化为L-乳酸、琥珀酸和乙酸等有机酸及氨基酸。这些副反应对目标产物的生物合成产生不利影响。解决这一问题有望提升高密度发酵中的IPA产量。
为验证IPA生产菌株的高密度发酵潜力，将前期研究构建的POX/H36-TDACH菌株（以下简称WT-IPA）和ΔLP(n) POX/H36-TDACH菌株（以下简称ΔLP(n)-IPA）首先在自制小型发酵罐中进行10 h高密度发酵。然而，通过无义突变弱化ldh和ppc基因的ΔLP(n)-IPA菌株仅表现出轻微的IPA产量提升（附表S4）。ΔLP(n)-IPA菌株中仍观察到副产物——尤其是L-乳酸——的显著积累，水平与WT-IPA菌株相当。这一结果表明L-乳酸脱氢酶并未被完全失活——尽管存在无义突变，酶仍保留部分残余活性，导致L-乳酸积累。因此，需要精细的代谢策略来提升IPA产量。
对谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032进行比较转录组分析，以验证高密度发酵条件下基因的表达水平。转录组分析主要聚焦于IPA生物合成相关途径，如糖酵解、TCA循环和回补途径。高密度发酵条件下，参与L-乳酸和乙酸代谢的ldh、pta、lldD和cat1基因表达显著上调（图2和附表S5）。糖酵解途径中，与甘油醛-3-磷酸代谢相关的gap、fbaA、pgk和tpiA基因表达显著增加，而glk和gpmA基因表达下降。TCA循环与回补反应中，参与琥珀酸生成的ppc和sdhCAB基因显著上调，而mqo和maeA基因表达下降。
既往研究表明，缺氧高密度发酵条件下谷氨酸棒状杆菌R的L-乳酸代谢与糖酵解相关基因（如ldh、gap、pgk、tpi）表达显著增加，与本研究结果相似。ppc基因通过磷酸烯醇式丙酮酸进入TCA循环的通量参与琥珀酸合成，在两个菌株中均表现出显著上调。然而，回补途径与TCA循环存在一些差异：R菌株中maeA（前期研究中称为MalE）和mdh表达水平升高，而ATCC 13032菌株中sdhCAB表达升高。此外，虽然R菌株缺乏乙酸代谢相关基因表达数据难以直接比较，但ATCC 13032菌株的pta和cat1基因显著上调。这些结果表明，两个菌株在高密度发酵中可能呈现不同的副产物合成与中心碳代谢模式。因此，本研究聚焦于副产物形成相关基因，并根据代谢物谱分析和转录组分析结果确定优先级。
3.2 副产物通路抑制消除L-乳酸积累及ED途径引入改善葡萄糖消耗
首先，为减少L-乳酸积累，利用CRISPR辅助重组技术完全敲除ldh基因，构建ΔL(d)菌株。携带pMTC_POX和pEKEx2_H36-TDACH载体的ΔL(d)-IPA菌株中，L-乳酸积累完全停止，副产物也有所减少（图3b、c、d）。另一方面，与WT-IPA菌株相比，ΔL(d)-IPA菌株未检测到IPA和丙酮的生成，葡萄糖消耗显著下降（图3a、e、f）。这一结果表明，ldh缺失可能导致NADH积累，进而通过gap基因编码的甘油醛-3-磷酸脱氢酶失活使糖酵解停滞。此外，高密度发酵中糖酵解的glk和gpmA基因表达下调。因此，为通过绕过糖酵解途径改善葡萄糖消耗，将ED途径引入ΔL(d)菌株，构建ΔL(d)E(i)菌株。来自运动发酵单胞菌的zwf、edd和eda基因整合至谷氨酸棒状杆菌基因组的CgLP4区域（跨度835,045 bp至836,109 bp）。
结果显示，携带pMTC_POX和pEKEx2_H36-TDACH载体的ΔL(d)E(i)-IPA菌株与ΔL(d)-IPA菌株相比，葡萄糖消耗显著改善（图3f）。ΔL(d)E(i)-IPA菌株在10 h内的IPA产量（125.98 ± 11.71 mg/L）高于WT-IPA菌株（71.53 ± 13.06 mg/L）和ΔLP(n)菌株（96.18 ± 12.84 mg/L）（图3a）。此外，与WT-IPA和ΔLP(n)-IPA菌株不同，ΔL(d)E(i)-IPA菌株不产生丙酮（图3e）。这表明引入产生NADPH的ED途径可能增强了以NADPH为辅因子的Sadh酶活性。然而，除L-乳酸外其他副产物的积累呈增加趋势（图3b、c）。ΔL(d)E(i)-IPA菌株积累了7.46 ± 0.61 g/L琥珀酸和2.37 ± 0.68 g/L乙酸。为此，对回补途径进行改造以减少琥珀酸积累。
前期研究中谷氨酸棒状杆菌R一直被用作高密度发酵的模式菌株。尽管通过高密度发酵成功生产了异丁醇、琥珀酸及多种氨基酸等代谢产物，但敲除ldh并引入IPA生物合成途径的谷氨酸棒状杆菌R工程菌株在高密度发酵中IPA产量较低，仅产生78.13 mg/L的IPA。这与WT-IPA菌株的结果一致，但与ΔL(d)-IPA菌株不符。然而本研究中，ED途径的引入缓解了葡萄糖消耗抑制，从而提升了IPA产量。这些结果表明，通过进一步改造有望在高密度发酵中实现成功的IPA生产。
3.3 中心碳代谢与回补途径改造以减少琥珀酸和乙酸的过量积累
转录组分析显示ppc基因在高密度发酵中显著上调。因此，在ΔL(d)E(i)菌株中敲除ppc基因，构建ΔLP(d)E(i)菌株。携带pMTC_POX和pEKEx2_H36-TDACH载体的ΔLP(d)E(i)-IPA菌株表现出增强的IPA产量（图4a）。然而，ΔLP(d)E(i)-IPA菌株的琥珀酸产量显著下降（5.37 ± 1.40倍），生产产率下降（3.34 ± ...
（原文此处后续内容涉及pta/ack基因敲除、pckA基因过表达及乙酸代谢改造等策略，以及最终菌株ΔLPTAK(d)E(i)-IPA的构建与高密度补料分批发酵验证。图5展示了不同通气条件与发酵系统下的高密度发酵结果，图6展示了1.5 L发酵罐中1.0 vvm条件下的高密度补料分批发酵结果，最终实现IPA产量30.66 ± 1.24 g/L、产率0.53 ± 0.03 mol/mol、生产强度511.08 ± 20.72 mg/L/h。）
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程改造，成功实现了谷氨酸棒状杆菌在高密度发酵条件下高效生产IPA。核心策略包括：基于转录组数据精准锁定副产物代谢关键基因（ldh、ppc、pta、ack），通过CRISPR辅助编辑完全敲除；引入ED途径绕过糖酵解限速步骤，恢复NAD⁺/NADH平衡并改善葡萄糖消耗；同时抑制乙酸生成途径，减少碳流浪费。最终工程菌株ΔLPTAK(d)E(i)-IPA在优化条件下达到30.66 g/L的产量，为目前谷氨酸棒状杆菌IPA生产的最高报道值。
编译者解读：该研究的方法论亮点在于将转录组学数据转化为理性的代谢改造靶点，而非盲目敲除——这种"组学指导的逆向代谢工程"策略显著提升了改造效率。ED途径的引入巧妙解决了ldh缺失导致的NADH积累与糖酵解停滞问题，体现了对辅因子平衡的深刻考量。值得注意的是，该研究采用高密度发酵（初始OD约100）与补料分批工艺，契合工业生物制造对高体积生产强度的需求。然而，IPA的挥发性收集系统在放大过程中可能面临冷凝效率与产物回收成本的挑战，且目前产量与理论产率仍有差距。未来若能结合动态调控策略进一步减少副产物碳流，并优化产物在线回收工艺，该菌株的工业化应用前景值得期待。
参考来源
Ko YJ. Metabolic engineering and high-cell-density fermentation of Corynebacterium glutamicum to improve isopropanol production. Journal of Biotechnology, 2025. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.04.006
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.04.006