来源：MACBETH: Multiplex automated Corynebacterium glutamicum base editing method（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
谷氨酸棒状杆菌是年产量超500万吨氨基酸的重要工业微生物，但现有CRISPR/Cas9编辑系统依赖外源DNA模板且多重编辑效率低下。本研究开发了MACBETH方法——将CRISPR/Cas9与胞苷脱氨酶（AID）融合，无需外源DNA模板即可实现单、双、三位点编辑，效率分别高达100%、87.2%和23.3%。该技术还成功应用于谷氨酸生产菌株的代谢工程改造，并实现了机器人自动化操作，为工业菌株的规模化理性设计提供了全新平台。
研究背景
CRISPR/Cas系统虽已部分解决了细菌基因组编辑中筛选标记和菌落筛选的繁琐问题，但每个靶位点仍需要外源DNA模板——因为CRISPR/Cas引入的双链断裂（DSB）对缺乏非同源末端连接（NHEJ）机制的大多数细菌是致死的。DSB虽是强大的反选择标记，但随着靶位点数量增加，细胞存活率急剧下降，严重限制了细菌的多重基因组编辑。此外，在质粒上组装多个同源供体既费时又复杂。
谷氨酸棒状杆菌作为年产量超500万吨氨基酸的重要工业微生物，已成为代谢工程中生产燃料、化学品和药物的热门模式宿主。传统等位基因交换方法操作繁琐，而新近发展的CRISPR/Cas9或Cpf1编辑方法仍有待改进。开发更简单便捷的细菌基因组编辑方法，是该领域亟待解决的核心问题。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株列于表S1。大肠杆菌DH5α用于常规克隆，在37°C需氧条件下于Luria-Bertani（LB）肉汤中培养。根据需要向LB肉汤中添加卡那霉素（Km，50 μg/mL）或氯霉素（Cm，20 μg/mL）。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。谷氨酸棒状杆菌菌株在30°C需氧条件下于添加5 g/L葡萄糖的LB肉汤（LBG培养基）中培养。根据需要向培养基中添加Km（15 μg/mL）、Cm（5 μg/mL）或异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG，1 mM）。
【数据】大肠杆菌DH5α培养温度：37°C；培养基：LB；Km浓度：50 μg/mL；Cm浓度：20 μg/mL；谷氨酸棒状杆菌培养温度：30°C；培养基：LBG（含5 g/L葡萄糖）；Km浓度：15 μg/mL；Cm浓度：5 μg/mL；IPTG浓度：1 mM
2.2 质粒与gRNA设计
本研究所用质粒列于表S1。为在谷氨酸棒状杆菌中表达dCas9、AID及d/nCas9-AID融合蛋白，将编码基因克隆至pXMJ19质粒，置于IPTG诱导型启动子P_tac控制下。nCas9(D10A)-AID融合蛋白的核苷酸序列见表S2。
gRNA表达盒由以下元件组成：强组成型启动子P_11F（源自谷氨酸棒状杆菌P_cspB的衍生物）、20-bp引导序列（特异性DNA结合互补区）、Cas9结合发夹结构、源自化脓性链球菌的转录终止子及rrnB终止子。本研究所用gRNA表达盒的核苷酸序列见表S3，完整引导序列列表见表S4。gRNA表达盒克隆至pEC-XK99E质粒用于谷氨酸棒状杆菌表达。
为快速简便构建gRNA表达质粒，采用Golden Gate组装策略。首先，去除携带gRNA表达盒的pEC-XK99E的BsaI位点。其次，将质粒中20-bp引导序列区域替换为BsaI-ccdB-BsaI盒，生成pgRNA-ccdB。第三，一对24-bp引物退火形成带有粘性末端的双链DNA（dsDNA）。第四，利用Golden Gate组装反应将dsDNA连接至pgRNA-ccdB，生成含引导序列的gRNA表达质粒。
为构建碱基编辑后可轻松消除的pnCas9(D10A)-AID_TS和pupp-gRNA^N°Per质粒，采用先前描述的策略。在pnCas9(D10A)-AID的Rep蛋白中引入P47S替换，产生温度敏感型pnCas9(D10A)-AID_TS。从pupp-gRNA中去除分配蛋白Per的编码基因，产生分离不稳定的pupp-gRNA^N°Per。本研究所用引物列于表S5。
【数据】gRNA表达盒组成：P_11F启动子 + 20-bp引导序列 + Cas9结合发夹 + 终止子；质粒：pXMJ19、pEC-XK99E；诱导剂：IPTG；温度敏感型质粒构建：Rep蛋白P47S突变
2.3 谷氨酸棒状杆菌中的碱基编辑
将d/nCas9-AID表达质粒（约2 μg）和gRNA表达质粒（约1 μg）通过电穿孔共转化至谷氨酸棒状杆菌。细胞在30°C恢复2–3小时，然后涂布于添加Km和Cm的LBHIS平板上。平板在30°C孵育2–3天直至菌落出现。挑取菌落，在添加Km和Cm的LBG培养基中需氧培养。随后，将细胞转移至添加Km、Cm和IPTG的新鲜LBG培养基中，初始光密度（OD600 nm）为0.5以诱导d/nCas9-AID表达。培养约12小时后，培养物OD600 nm达到约10.0。细胞用无菌0.85% NaCl溶液洗涤两次并重悬。
分析upp基因失活频率时，将细胞重悬液稀释后涂布于CGXII平板或添加100 μM 5-氟尿嘧啶的CGXII平板上。通过计数形成的菌落计算失活频率。为通过Sanger测序验证编辑事件，挑取菌落并用PCR扩增靶区域。用于PCR扩增和测序的引物列于表S5。谷氨酸棒状杆菌感受态细胞制备和电转化按先前描述的方案进行。
为测定细胞存活率，将转化nCas9-AID和gRNA表达质粒的细胞分别涂布于添加Km和Cm的LBHIS平板及添加Km、Cm和IPTG的LBHIS平板。平板在30°C孵育，细胞存活率通过IPTG平板菌落数除以无IPTG平板菌落数计算。
【数据】电转化质粒量：d/nCas9-AID质粒约2 μg，gRNA质粒约1 μg；恢复条件：30°C，2–3 h；平板孵育：30°C，2–3天；诱导OD600：0.5；诱导时间：约12 h；诱导后OD600：约10.0；洗涤液：0.85% NaCl；筛选平板：CGXII + 100 μM 5-氟尿嘧啶
2.4 质粒消除
为获得无质粒菌株，将含pnCas9(D10A)-AID_TS和pupp-gRNA^N°Per质粒的已编辑谷氨酸棒状杆菌在LBG培养基中37°C过夜培养。培养物用无菌0.85% NaCl溶液稀释后涂布于LBG、LBG+Km、LBG+Cm和LBG+Km+Cm平板。30°C孵育48小时后，通过计数菌落计算pnCas9(D10A)-AID_TS和pupp-gRNA^N°Per质粒的丢失率。
【数据】质粒消除温度：37°C；时间：过夜；平板孵育：30°C，48 h；培养基：LBG
2.5 谷氨酸棒状杆菌谷氨酸生产发酵
碱基编辑细胞的pnCas9(D10A)-AID_TS和podhA-pyk-ldhA-gRNA^N°Per质粒首先通过在37°C无抗生素培养基中过夜孵育消除。其次，培养物用无菌0.85% NaCl溶液稀释，涂布于LBG平板，孵育48小时。第三，挑取菌落接种至含LBG培养基的96孔板中。30°C、750 rpm摇床（INFORS HT Multitron）过夜孵育后，将细胞转移至含2.5 μg/L生物素的改良CGXII培养基96孔板中。第四，指数生长期细胞转移至含600 µL添加1 μg/L生物素的改良CGXII培养基的96孔板中进行谷氨酸生产测试。16小时后取样，使用基于谷氨酸氧化酶的测定方法定量胞外谷氨酸浓度。
谷氨酸高产突变株接种至含30 mL添加1 μg/L生物素的改良CGXII培养基的500 mL摇瓶中进一步验证谷氨酸产量。使用SBA-40D生物传感器分析仪定量胞外谷氨酸浓度。改良CGXII极限培养基每升含：60 g葡萄糖、20 g (NH4)2SO4、5 g尿素、1 g KH2PO4、1 g K2HPO4、0.25 g MgSO4·7H2O、42 g 3-吗啉丙磺酸、10 mg CaCl2、10 mg FeSO4·7H2O、10 mg MnSO4·H2O、1 mg ZnSO4·7H2O、0.2 mg CuSO4、0.02 mg NiCl2·6H2O、30 mg原儿茶酸及适量生物素。
【数据】摇床转速：750 rpm；培养温度：30°C；谷氨酸生产时间：16 h；生物素浓度：2.5 μg/L（预培养）和1 μg/L（生产）；培养基体积：600 µL（96孔板）和30 mL（500 mL摇瓶）；CGXII培养基葡萄糖：60 g/L
2.6 谷氨酸棒状杆菌基因缺失
谷氨酸棒状杆菌基因缺失突变体通过自杀质粒pK18mobsacB进行等位基因交换构建。将靶基因左右同源臂连接产生突变等位基因，克隆至pK18mobsacB。所得质粒通过电穿孔转化至谷氨酸棒状杆菌。基因缺失按先前描述的程序进行。
【数据】自杀质粒：pK18mobsacB；转化方法：电穿孔
2.7 酶活测定
Ald、LdhA和AdhA酶活测定按先前描述的方法稍作修改进行。收集指数期细胞，用50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）洗涤两次。细胞沉淀用相同缓冲液重悬，使用机械破碎仪（FastPrep®24, MP）通过珠磨破碎。裂解液在18,000×g、4°C离心30分钟，上清液用于酶活测定。
反应混合物含预热的50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）、5 mM MgSO4、0.5 mM NAD+及底物（Ald用340 mM乙醇，LdhA用100 mM L-乳酸，AdhA用1 mM乙醛）。通过添加无细胞提取物启动反应。比活力（U/mg）定义为每分钟每毫克总蛋白产生1 µmol NADH的酶量。
【数据】缓冲液：50 mM磷酸钾（pH 7.4）；离心：18,000×g，4°C，30 min；MgSO4：5 mM；NAD+：0.5 mM；底物：340 mM乙醇（Ald）、100 mM L-乳酸（LdhA）、1 mM乙醛（AdhA）
2.8 全基因组靶点分析
（原文此节内容未完整提供，具体分析流程未详述）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 CRISPR/Cas9-AID在谷氨酸棒状杆菌中的可编程碱基编辑
为测试CRISPR/Cas9-AID是否可作为谷氨酸棒状杆菌的有效碱基编辑工具，我们将dCas9（化脓性链球菌Cas9的核酸酶缺陷突变体）与AID同源物（海七鳃鳗PmCDA1）的融合蛋白克隆至pXMJ19质粒，置于IPTG诱导型tac启动子下。为便于后续gRNA编程，将gRNA盒克隆至pTrcmob质粒中强组成型启动子P_cspB变体下游。
为便于快速表型鉴定，选择编码谷氨酸棒状杆菌尿嘧啶磷酸核糖转移酶的upp基因作为首个编辑靶点。尿嘧啶磷酸核糖转移酶可将5-氟尿嘧啶转化为5-氟-dUMP，后者抑制胸苷酸合酶导致细胞死亡。我们设计gRNA引导CRISPR/dCas9-AID将484位C转换为T，产生早期终止密码子。为确认早期终止密码子能使upp基因失活，首先用传统等位基因交换方法构建了upp C484T突变体。所得upp C484T突变菌株对5-氟尿嘧啶不敏感，证明upp基因可作为评估谷氨酸棒状杆菌基因组编辑效率的报告基因。
CRISPR/dCas9-AID介导的碱基编辑效率最高达11.2%。为确认CRISPR/dCas9-AID碱基编辑器是upp失活频率升高的原因，进行了几组对照实验。含空质粒pXMJ19时upp基因自然失活频率为1.28 ± 0.68 × 10⁻⁶。单独过表达dCas9时，upp失活频率略有升高——dCas9与DNA的松散结合可能增加了诱变因子的DNA可及性。为评估AID过表达的致突变效应，分别克隆并过表达AID和dCas9-AID融合蛋白，upp基因失活频率升高一个数量级至2.85 ± 0.80 × 10⁻⁵和3.97 ± 1.10 × 10⁻⁵，与AID过表达本身可增加随机突变率的结论一致。为排除dCas9-gRNA复合物增加突变频率的可能性，共表达dCas9和upp-gRNA，未观察到upp基因失活频率的明显升高。
受初步结果鼓舞，我们寻求进一步提高碱基编辑效率。Nishida等人发现Cas9衍生切口酶nCas9(H840A)和nCas9(D10A)可分别通过靶链或互补链引入DNA切口来改变碱基编辑效率。因此，我们将dCas9替换为nCas9(H840A)或nCas9(D10A)并测定upp基因失活频率。结果显示，nCas9(H840A)-AID对编辑效率无明显影响，而nCas9(D10A)-AID将碱基编辑效率显著提高至62.4 ± 8.2%。这与互补链切口可显著提高真核细胞碱基编辑效率的先前报道一致。
我们还对随机挑取的10个菌落进行了靶区域测序，发现10个中有7个含有设计的早期终止密码子。为证明gRNA特异性对靶向编辑至关重要，将靶向rfp基因的gRNA与nCas9(D10A)-AID在基因组中插入rfp基因的工程谷氨酸棒状杆菌菌株中共表达。结果表明upp基因失活频率与转化空质粒的细胞相似，显著低于任何AID过表达对照实验——因为大多数nCas9(D10A)-AID-gRNA复合物被引导至rfp靶区域，显著降低了游离AID蛋白浓度，导致随机突变频率降低。同时，RFP荧光输出测定和基因测序结果显示rfp基因编辑效率达90%。值得注意的是，过表达CRISPR/nCas9(D10A)-AID和靶gRNA进行碱基编辑时细胞存活率超过90%。由于nCas9(D10A)-AID表现出最佳编辑性能，后续实验均使用该融合蛋白。
【数据】dCas9-AID编辑效率：最高11.2%；自然失活频率：1.28 ± 0.68 × 10⁻⁶；AID过表达失活频率：2.85 ± 0.80 × 10⁻⁵；dCas9-AID过表达失活频率：3.97 ± 1.10 × 10⁻⁵；nCas9(D10A)-AID编辑效率：62.4 ± 8.2%；测序验证：10个菌落中7个含目标突变；rfp编辑效率：90%；细胞存活率：>90%
3.2 质粒消除
连续菌株工程和工业应用需要消除用于递送nCas9(D10A)-AID和gRNA的质粒。为此，根据先前描述的策略构建了温度敏感型nCas9(D10A)-AID表达质粒和分离不稳定型gRNA表达质粒，开发了质粒消除系统。以upp为靶基因测试新构建质粒的碱基编辑效率，获得67.6 ± 3.7%的高编辑效率，证明这些修饰不影响碱基编辑。随后将碱基编辑的谷氨酸棒状杆菌菌株在37°C无抗生素LBG培养基中过夜培养，两种质粒的丢失率均为90.5 ± 2.8%，便于质粒轻松消除。
【数据】质粒消除后编辑效率：67.6 ± 3.7%；质粒丢失率：90.5 ± 2.8%；消除条件：37°C，无抗生素，过夜
3.3 宽靶向窗口
据报道，Cas9-AID介导的碱基编辑具有5 nt靶向窗口，PAM序列上游−16至−20位置的所有C均可被编辑。在我们的案例中，靶区域测序表明upp基因−15和−16位置及rfp−21位置的C在许多菌落中也被编辑，提示靶区域内/附近的其他C也易受碱基编辑影响。
为研究CRISPR/nCas9(D10A)-AID在谷氨酸棒状杆菌中的靶向窗口，我们另选四个基因（ald、csp、ldhA和adhA）通过碱基编辑引入早期终止密码子。结合靶基因upp和rfp，覆盖了PAM序列上游−16至−20位置。通过测序靶区域确定编辑效率。结果表明，所有五个位置均可被CRISPR/nCas9(D10A)-AID介导的碱基编辑器高效编辑，效率均超过50%。
为确认引入的早期终止密码子与完全基因敲除（缺失）具有相同的基因失活效果，分别构建了ald、ldhA和adhA敲除（缺失）突变体。对Ald、LdhA和AdhA进行基于细胞裂解物的酶活测定，发现碱基编辑和敲除（缺失）突变体具有相似的酶活，均远低于野生型菌株。这种宽靶向窗口是高度期望的特性，因为它显著增加了全基因组基因失活应用中可编辑靶点的数量。
【数据】靶向窗口：PAM上游−16至−20位置；编辑效率：均>50%；酶活比较：碱基编辑与敲除突变体相似，均远低于野生型
3.4 CRISPR/nCas9(D10A)-AID的多重基因组编辑
多重基因组编辑是CRISPR/Cas系统在真核生物中的优势。然而，在原核生物中实现多重编辑困难得多。因此，我们尝试通过同时表达靶向upp和rfp基因的gRNA在谷氨酸棒状杆菌中进行多重基因组编辑。经过一次传代，upp和rfp的独立失活频率分别为48.9 ± 5.8%和78.3 ± 8.1%，双表型失活频率达41.7 ± 6.9%。
一般来说，连续传代培养是延长编辑时间以提高基因组编辑效率的常用策略。为排除延长暴露于诱变环境的影响……（原文此段后续内容未完整提供）
【数据】upp独立失活频率：48.9 ± 5.8%；rfp独立失活频率：78.3 ± 8.1%；双表型失活频率：41.7 ± 6.9%；传代数：1次
3.5 多重碱基编辑提高谷氨酸产量
将MACBETH应用于谷氨酸生产菌株的代谢工程改造。谷氨酸棒状杆菌中谷氨酸合成途径涉及pyk（丙酮酸激酶编码基因）、ldhA（乳酸脱氢酶编码基因）和odhA（2-酮戊二酸脱氢酶复合物E1亚基编码基因）。通过多重碱基编辑同时失活这些基因，构建组合基因失活文库。
研究发现pyk&ldhA双失活菌株的谷氨酸产量提高了3倍。这一结果表明，通过阻断竞争途径和减少副产物积累，可以有效提高目标产物的产量。
【数据】pyk&ldhA双失活菌株谷氨酸产量：提高3倍；靶基因：pyk、ldhA、odhA
3.6 全基因组靶点分析
为评估MACBETH在全基因组规模基因失活中的适用性，对谷氨酸棒状杆菌基因组进行了靶点分析。结果显示，基因组中具有至少一个独特gRNA或可靶向密码子的可编辑基因数量众多。这些靶点在基因组中的相对位置分布广泛，覆盖了基因失活所需的各种位置。
【数据】可编辑基因数量：原文未详述；靶点分布：基因组范围内
3.7 自动化高通量基因失活
作为概念验证，利用集成机器人系统将MACBETH自动化，用于构建94个转录因子编码基因的阵列化全基因组基因失活文库。自动化流程包括集成机器人系统执行的步骤（白框）和离线使用其他高通量设备执行的步骤（灰框）。基因失活成功率达100%。
【数据】自动化构建基因失活文库：94个转录因子；成功率：100%
讨论与解读
本研究首次证明CRISPR/nCas9(D10A)-AID融合蛋白可用于细菌中的可编程、多重碱基编辑，效率高达100%。与先前基于锌指（ZF）或转录激活因子样效应物（TALE）融合脱氨酶在大肠杆菌中实现单一位点编辑（最高23%效率）的方法相比，CRISPR/Cas9系统具有简单性、高特异性和多重编辑能力等关键优势。此外，该碱基编辑系统的高效率显著减少了突变体验证的工作负担。
值得注意的是，与真核生物不同，大多数细菌缺乏NHEJ通路且同源重组（HR）能力很弱。因此，细菌中真正的基因组编辑效率依赖于低且物种依赖的HR效率。CRISPR/Cas9系统实质上是一种强大的反选择压力——大多数存活细胞即为基因组编辑细胞，表现为"表观"高编辑效率。这使得在细菌中实现超过两个位点的多重基因组编辑极为困难。MACBETH通过避免DSB的产生，从根本上解决了这一难题。
编译者解读
MACBETH的巧妙之处在于绕开了细菌编辑中"DSB致死"这一根本矛盾——用脱氨酶在单链上引入点突变而非制造双链断裂，既保证了编辑效率又维持了高细胞存活率。从合成生物学应用角度看，该方法无需外源DNA模板的特性大幅降低了GMO监管障碍，而自动化平台的整合使每月数千株工程菌的构建成为可能。局限在于碱基编辑仅能实现C-to-T类型的点突变，无法覆盖所有类型的基因改造需求。总体而言，MACBETH为工业菌株的规模化、系统化改造提供了切实可行的技术路径。
参考来源
Wang Y. MACBETH: Multiplex automated Corynebacterium glutamicum base editing method. Metabolic Engineering, 2018.
DOI: 10.1016/j.ymben.2018.02.016
DOI: 10.1016/j.ymben.2018.02.016