来源：Development of novel and efficient Corynebacterium glutamicum gene expression systems for industrial enzyme production（Journal of Microbiological Methods）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
工业酶生产对微生物表达系统提出三重需求：无抗生素抗性标记、诱导剂成本低廉、蛋白可分泌至胞外。本研究利用CRISPR-Cpf1基因编辑技术，敲除谷氨酸棒杆菌的丙氨酸消旋酶基因`alr`与谷氨酸消旋酶基因`murI`，并整合枯草芽孢杆菌阿拉伯糖通透酶基因`araE`，构建了严格依赖D-丙氨酸生长的工程宿主菌。在此基础上开发了以`alr`为筛选标记、T7转录系统驱动表达、AraR-OR\\(A1\\)/OR\\(A2\\)负调控系统响应L-阿拉伯糖诱导的Sec型与Tat型两种分泌表达载体，并以嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶AmyF为报告蛋白验证了系统的高效性。
研究背景
理想的工业酶微生物表达系统需具备功能互补型筛选标记、经济型诱导剂以及胞外蛋白分泌能力。谷氨酸棒杆菌是工业氨基酸生产的重要菌株，但常用表达载体依赖抗生素抗性标记，且缺乏廉价诱导系统。D-丙氨酸是细菌肽聚糖合成的必需组分，直接参与细胞壁生长过程中相邻肽聚糖链的交联。丙氨酸消旋酶催化L-与D-丙氨酸间的可逆消旋反应，在谷氨酸棒杆菌中由唯一的`alr`基因编码。由于D-丙氨酸不存在于常见复合培养基中，该消旋反应对细菌生长至关重要——这使其成为理想的营养缺陷型筛选标记。另一方面，谷氨酸棒杆菌染色体缺乏L-阿拉伯糖利用相关基因簇，不具备吸收L-阿拉伯糖的能力，而枯草芽孢杆菌的`araE`基因编码L-阿拉伯糖转运蛋白。本研究通过CRISPR-Cpf1系统实现`alr`基因置换为`araE`，并进一步敲除`murI`基因，构建可吸收阿拉伯糖且严格依赖D-丙氨酸的工程宿主，进而组装阿拉伯糖诱导的分泌表达系统。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用细菌菌株与质粒列于原文表1。大肠杆菌菌株在LB肉汤中、200 rpm、37°C条件下培养，或在LB琼脂平板上、37°C条件下培养；谷氨酸棒杆菌菌株常规在LBHI培养基中、200 rpm、30°C条件下培养，或在LBHI琼脂平板上、30°C条件下培养。如需要，卡那霉素浓度为30 mg L⁻¹（用于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌），D-丙氨酸和D-谷氨酸浓度均为0.4 g L⁻¹（用于谷氨酸棒杆菌ATCC13032的`alr`或`murI`缺失衍生物）。
【数据】培养基：LB/LBHI；转速：200 rpm；温度：37°C（E. coli）/30°C（C. glutamicum）；卡那霉素：30 mg L⁻¹；D-丙氨酸：0.4 g L⁻¹；D-谷氨酸：0.4 g L⁻¹
2.2 分子生物学常规操作
质粒DNA和基因组DNA分别使用TIANprep Mini Plasmid Kit和TIANamp Bacteria DNA Kit（TIANGEN，北京，中国）制备。原文表2所列引物及克隆/表达盒由Sangon（上海，中国）人工合成，PCR扩增使用PrimeSTAR™ HS DNA Polymerase，按制造商方案（TaKaRa，大连，中国）进行。PCR产物纯化、酶切、DNA底物连接、转化以及大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌转化子的筛选均按课题组前期研究所述方案进行。多片段融合使用Beyotime（上海，中国）无缝克隆试剂盒。
【数据】PCR酶：PrimeSTAR™ HS DNA Polymerase；无缝克隆试剂盒：Beyotime；引物合成：Sangon
2.3 利用all-in-one CRISPR-Cpf1质粒系统构建C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI菌株
根据CHOPCHOP在线软件确定谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体`alr`基因中的alr-crRNA靶序列（CGCGCCGCCATTGATCGCAATATTG），作为CRISPR-Cpf1质粒系统的靶位点。以pJYS3-△crtYf（11,982 bp）为模板、alr-cr-F/alr-cr-R引物对进行反向PCR，线性PCR产物经DpnI酶消化并环化，所得质粒命名为pJYS3-△crtYf-la（11,982 bp）。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体为模板、alrU-F/alrU-R引物对扩增`alr`上游同源臂（alrU，1057 bp），以alrD-F/alrD-R引物对扩增`alr`下游同源臂（alrD，1145 bp）；以枯草芽孢杆菌168染色体为模板、araE-F/araE-R引物对扩增`araE`基因（1681 bp）。以pJYS3-△crtYf-la为模板、pJYS3-cr-F/pJYS3-cr-R引物对进行PCR，产物片段命名为pJYS3-△crtYf-la △HR（9887 bp）。利用无缝克隆技术将alrU、araE、alrD和pJYS3-△crtYf-la △HR四个片段融合，所得敲除质粒命名为pJYS3-△alr∷araE（13,078 bp）。
将敲除质粒pJYS3-△alr∷araE转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞，在含卡那霉素和D-丙氨酸的LBHIS平板上生长的菌落，用AE-CX-F/AE-CX-R引物对进行菌落PCR检测。敲除突变体通过PCR和扩增子测序确认。突变体在含D-丙氨酸的液体LBHI培养基中、30°C培养24 h，培养物涂布于含D-丙氨酸的LBHI平板、30°C培养36 h，挑取单菌落分别接种于含D-丙氨酸的LBHI平板和含卡那霉素与D-丙氨酸的LBHI平板，30°C培养36 h。能够在含D-丙氨酸的LBHI平板上生长而不能在含卡那霉素和D-丙氨酸的LBHI平板上生长的菌落中，pJYS3-△alr∷araE质粒已被消除，所得无质粒敲除突变体命名为C. glutamicum Δalr∷araE。
C. glutamicum ΔmurI和C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI菌株的构建步骤与C. glutamicum Δalr∷araE一致。确定C. glutamicum Δalr∷araE染色体`murI`基因中的murI-crRNA序列（TATCGGTGATACTGCCAATGG）作为CRISPR-Cpf1质粒系统的靶位点。使用murI-cr-F/murI-cr-R引物对构建质粒pJYS3-△crtYf-lm（11,982 bp），其中crtYf-crRNA被murI-crRNA序列替代。murI-U-F/murI-U-R和murI-D-F/murI-D-R引物对分别用于扩增上游和下游同源臂（murIU，1022 bp；murID，1066 bp）。pJYS3-cr-F/pJYS3-cr-R引物对用于扩增线性pJYS3-△crtYf-lm △HR（9887 bp），其中crtYf-HR1和crtYf-HR2片段已被删除。将murIU、murID和pJYS3-△crtYf-lm △HR三个片段融合，所得敲除质粒命名为pJYS3-△murI（11,975 bp）。将pJYS3-△murI分别转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032和C. glutamicum Δalr∷araE感受态细胞，在含卡那霉素和D-谷氨酸的LBHIS平板上生长的菌落用murI-CX-F/murI-CX-R引物对进行菌落PCR检测。阳性菌落中的pJYS3-△murI被消除，最终敲除突变体分别命名为C. glutamicum ΔmurI和C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI。
【数据】alr-crRNA靶序列：CGCGCCGCCATTGATCGCAATATTG；murI-crRNA靶序列：TATCGGTGATACTGCCAATGG；alrU：1057 bp；alrD：1145 bp；araE：1681 bp；murIU：1022 bp；murID：1066 bp；pJYS3-△alr∷araE：13,078 bp；pJYS3-△murI：11,975 bp；培养时间：24 h/36 h；温度：30°C
2.4 谷氨酸棒杆菌分泌型基因表达载体pAU30S和pAU30T的构建
构建载体pAU30的详细流程见图1。首先，使用rep-F/rep-R引物对从谷氨酸棒杆菌载体pAU2 PCR扩增含有rep (pBL1)和rep (pMB1)的片段（3669 bp）。使用alr-F和alr-R引物对从谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体PCR扩增酶编码基因`alr`（1200 bp）。两个PCR产物经KpnI和SacI酶切、连接并转化至E. coli Δalr Δdadx感受态细胞，混合物涂布于不含D-丙氨酸的LB平板。平板上生长的菌落判定为转化子，所得质粒命名为pAU28（4857 bp）。将载体pAU28转化至C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI，以确认`alr`和rep (pBL1)在谷氨酸棒杆菌中的功能。
第二步，使用T7-F/T7-R引物对从大肠杆菌BL21 (DE3)染色体PCR扩增T7 RNA聚合酶编码基因T7 gene 1（2818 bp）。PCR产物经PstI和SalI酶切，连接到经相同酶切的pAU28中，所得质粒命名为pAU29（7642 bp）。第三步，使用araR-F/araR-R引物对从枯草芽孢杆菌168染色体PCR扩增阻遏蛋白编码基因`araR`（1260 bp）。PCR产物经BamHI和StuI酶切，连接到经相同酶切的pAU29中，所得质粒命名为pAU30（8925 bp）。人工合成的克隆/表达盒S-box和T-box经SmaI和ClaI酶切，连接到经相同酶切的pAU30中，所得质粒分别命名为pAU30S（9312 bp）和pAU30T（9297 bp）。
【数据】rep (pBL1)+rep (pMB1)片段：3669 bp；alr基因：1200 bp；T7 gene 1：2818 bp；araR基因：1260 bp；pAU28：4857 bp；pAU29：7642 bp；pAU30：8925 bp；pAU30S：9312 bp；pAU30T：9297 bp；限制酶：KpnI/SacI/PstI/SalI/BamHI/StuI/SmaI/ClaI
2.5 利用反转录PCR检测araE、T7 gene 1和araR基因在谷氨酸棒杆菌中的表达
使用Tiangen（北京）的RNAprep Pure kit制备C. glutamicum Δalr∷araE、C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI/pAU29和C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI/pAU30菌株的总RNA。cDNA合成按照Tiangen Quantscript RT kit说明书进行。以C. glutamicum Δalr∷araE总cDNA为模板、araE-F1/araE-R1引物对PCR扩增`araE`基因；以C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI/pAU29总cDNA为模板、T7-F1/T7-R1引物对PCR扩增T7 gene 1；以C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI/pAU30总cDNA为模板、araR-F1/araR-R1引物对PCR扩增`araR`基因。重组酶编码基因`recA`被选作反转录的参考基因。
【数据】RNA提取试剂盒：RNAprep Pure kit（Tiangen）；cDNA合成：Quantscript RT kit（Tiangen）；参考基因：recA
研究结果
3.1 工程宿主菌C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI的构建
为使all-in-one CRISPR-Cpf1质粒系统产生引导Cpf1蛋白切割`alr`基因靶位点的小发夹结构RNA，通过反向PCR和环化反应将质粒pJYS3-△crtYf中的crtYf-crRNA序列替换为谷氨酸棒杆菌染色体`alr`基因的alr-crRNA序列。pJYS3-△crtYf-la中alr-crRNA序列的DNA测序进一步确认了替换的正确性。枯草芽孢杆菌L-阿拉伯糖相关化合物通透酶编码基因`araE`被用于确保阿拉伯糖能够透过谷氨酸棒杆菌细胞膜。`araE`基因采用长正向引物引入的异源强tac-M启动子，以提高其在谷氨酸棒杆菌中的表达水平。谷氨酸棒杆菌`alr`基因上游同源臂alrU、下游同源臂alrD、`araE`基因和pJYS3-△crtYf-la △HR片段连接在一起，生成敲除质粒pJYS3-△alr∷araE。
本研究将`alr`基因用作谷氨酸棒杆菌无抗生素抗性标记表达载体的筛选标记，转化子筛选的初始策略基于对`alr`功能缺失的谷氨酸棒杆菌突变株的体内功能互补。谷氨酸棒杆菌染色体不存在L-阿拉伯糖利用相关基因簇，不具备吸收L-阿拉伯糖的能力。枯草芽孢杆菌能以L-阿拉伯糖为唯一碳源生长，`araE`基因产物是将L-阿拉伯糖转运进入细胞的转运蛋白。为获得丧失`alr`功能且能吸收L-阿拉伯糖的工程谷氨酸棒杆菌宿主菌，利用all-in-one CRISPR-Cpf1质粒系统在谷氨酸棒杆菌中进行了`alr`基因被`araE`基因的置换。将敲除质粒pJYS3-△alr∷araE转化至谷氨酸棒杆菌，通过菌落PCR鉴定阳性转化子。野生型菌株和阳性转化子的扩增片段长度分别为3695 bp和4307 bp，证明`alr`在染色体上被`araE`成功置换。该置换通过PCR和扩增子测序确认。阳性转化子中的pJYS3-△alr∷araE质粒被消除，生成突变体C. glutamicum Δalr∷araE。RT-PCR结果显示`araE`基因在C. glutamicum Δalr∷araE中良好表达（图2，泳道2）。这些结果证明C. glutamicum Δalr∷araE菌株构建成功。在不添加D-丙氨酸的固体培养基上培养C. glutamicum Δalr∷araE显示其生长能力微弱（表3）。
作为细菌肽聚糖的另一种必需D-氨基酸组分，D-谷氨酸通常由谷氨酸消旋酶从L-谷氨酸产生。某些细菌中存在一种名为D-氨基酸转氨酶（D-AAT）的酶，可催化D-谷氨酸与D-丙氨酸之间的转化。在谷氨酸棒杆菌中，D-谷氨酸来源于由`murI`基因编码的谷氨酸消旋酶催化的L-谷氨酸异构化。因此，`murI`基因的缺失可能阻止谷氨酸棒杆菌中D-Glu的生物合成以及随后D-谷氨酸向D-丙氨酸的转化。使用敲除质粒pJYS3-△murI在C. glutamicum Δalr∷araE中进行`murI`基因缺失突变体的构建。通过菌落PCR反应验证阳性转化子中的`murI`缺失——C. glutamicum Δalr∷araE菌株和阳性转化子的扩增片段长度分别为3520 bp和2698 bp——并进一步通过PCR和扩增子测序确认。阳性转化子中的pJYS3-△murI质粒被消除，生成最终工程宿主菌C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI。C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI在不添加D-丙氨酸的固体培养基上不能生长（表3）。
【数据】野生型扩增片段：3695 bp；阳性转化子（alr∷araE）扩增片段：4307 bp；Δalr∷araE菌株扩增片段：3520 bp；murI阳性转化子扩增片段：2698 bp；D-丙氨酸添加：0.4 g L⁻¹
3.2 谷氨酸棒杆菌分泌型基因表达载体pAU30S和pAU30T的构建
为克服谷氨酸棒杆菌载体中抗生素抗性标记的缺点，构建了微型大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pAU28。大肠杆菌质粒pBR322的复制起点rep (pMB1)和谷氨酸棒杆菌质粒pBL1的复制起点rep (pBL1)被用作载体pAU28的复制起点。`alr`基因被用作pAU28在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中的筛选标记。pAU28构建的常规分子克隆操作在实验室前期构建的E. coli Δalr Δdadx宿主菌中进行，该菌株的两个丙氨酸消旋酶同工酶编码基因`alr`和`dadx`均被删除。转化和培养实验表明，携带`alr`的载体pAU28对染色体`alr`缺失的体内功能互补，使C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI菌株在无外源D-丙氨酸的情况下正常生长，并提供维持质粒的选择压力。
源自大肠杆菌T7噬菌体的T7转录系统可通过T7 RNA聚合酶对T7启动子的特异性识别实现高效转录，其高效转录不需要宿主因子的参与。`araR`基因编码负调控枯草芽孢杆菌L-阿拉伯糖利用操纵子转录的阻遏蛋白。为在谷氨酸棒杆菌中表达T7 RNA聚合酶和阻遏蛋白AraR，将T7 gene 1引入pAU28，生成质粒pAU29；随后将`araR`基因引入pAU29，生成质粒pAU30。RT-PCR结果显示T7 gene 1在pAU29中、`araR`基因在pAU30中均于C. glutamicum Δalr∷araE中良好表达（图2，泳道3和4）。克隆/表达盒S-box和T-box被组装到质粒pAU30中，分别生成最终载体pAU30S和pAU30T（图3）。pAU30S和pAU30T中克隆/表达盒的DNA测序进一步确认了组装的正确性。
在载体中，目标基因被引入多克隆位点（MCS，EcoRI、NotI、BglII、NheI和HindIII）。T7启动子可被T7 RNA聚合酶高效识别。AraR阻遏蛋白与OR\\(A1\\)/OR\\(A2\\)操纵子结合，阻断T7启动子与T7 RNA聚合酶之间的相互作用并抑制基因转录。阿拉伯糖可通过位于膜上的转运蛋白AraE介导进入工程宿主C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI细胞。AraR阻遏蛋白可被胞内诱导剂L-阿拉伯糖失活。Sec型cgR_2070和Tat型cgR_0904信号肽分别以未折叠和折叠形式介导目标蛋白的分泌。His-tag用于重组蛋白的纯化。因此，在pAU30S和pAU30T中，T7启动子-OR\\(A1\\)/OR\\(A2\\)操纵子杂合区域在谷氨酸棒杆菌中执行L-阿拉伯糖诱导表达功能。T7启动子-OR\\(A1\\)/OR\\(A2\\)操纵子杂合区域、谷氨酸棒杆菌共有核糖体结合位点（RBS）序列以及原文所述终止子的应用共同构成了完整的表达调控元件。
【数据】pAU28筛选标记：alr；MCS酶切位点：EcoRI/NotI/BglII/NheI/HindIII；信号肽：Sec型cgR_2070/Tat型cgR_0904；诱导剂：L-阿拉伯糖
讨论与解读
本研究成功开发了新型高效基因表达系统C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI/pAU30S和C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI/pAU30T。宿主菌C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI在复合培养基上表现出对D-丙氨酸的严格生长依赖，并被赋予将L-阿拉伯糖转运进入细胞的能力。表达载体pAU30T和pAU30S以丙氨酸消旋酶编码基因`alr`作为唯一功能互补筛选标记，采用T7启动子-T7 RNA聚合酶转录系统转录目标基因，利用枯草芽孢杆菌AraR-OR\\(A1\\)/OR\\(A2\\)负调控系统控制基因转录，使用谷氨酸棒杆菌RBS序列确保蛋白质翻译，并以His-tag简化重组蛋白纯化流程。pAU30S与pAU30T的唯一区别在于前者采用Sec型cgR_2070信号序列、后者采用Tat型cgR_0904信号序列介导谷氨酸棒杆菌中的蛋白质分泌。基于pAU30S和pAU30T的重组载体构建的常规分子克隆操作在特定宿主菌E. coli Δalr Δdadx中进行。重组α-淀粉酶AmyF的分泌实验表明，C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI/pAU30S和C. glutamicum Δalr∷araE ΔmurI/pAU30T是适合工业酶分泌生产的高效L-阿拉伯糖诱导型基因表达系统。
编译者解读：该研究的技术路线体现了工业酶表达系统设计的三个关键考量——营养缺陷型筛选替代抗生素标记、阿拉伯糖替代IPTG作为廉价诱导剂、Sec/Tat双分泌途径平行验证。CRISPR-Cpf1介导的`alr`→`araE`原位置换策略一举两得：既创造D-丙氨酸营养缺陷型筛选压力，又赋予宿主阿拉伯糖摄取能力。选择AmyF作为报告蛋白验证系统实用性，为后续工业酶谱系的扩展提供了可参考的验证范式。值得注意的是，该系统目前仅在摇瓶水平验证，发酵罐中的诱导动力学与分泌效率仍有待考察。
参考来源
Wang M. Development of novel and efficient Corynebacterium glutamicum gene expression systems for industrial enzyme production. Journal of Microbiological Methods, 2025. DOI: 10.1016/j.mimet.2025.107130
DOI: 10.1016/j.mimet.2025.107130