来源：Combinatorial PPTase screening and systematic metabolic engineering for high-level indigoidine production in Corynebacterium glutamicum（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
靛蓝素是一种微生物来源的环保蓝色色素，有望成为合成染料的可持续替代品。本研究在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中构建了高效的靛蓝素异源生物合成体系：通过筛选21个候选PPTase激活靛蓝素合成酶，组合敲除底盘基因组关键基因以缓解前体供应瓶颈，系统优化生物合成途径，并在摇瓶和补料分批发酵中分别达到5.59 g/L和34.45 g/L的靛蓝素产量。这项工作为依赖翻译后修饰的微生物合成途径优化提供了方法学参考。
研究背景
公众对工业有毒化合物生态和健康影响的担忧，正在推动对天然、环境可持续替代品的需求增长。纺织和印染行业因合成染料色彩范围广且成本效益高而广泛采用，但其制造过程常使用苯、喹啉、甲醛和二噁英等有毒化学前体。一个典型例子是靛蓝的工业化学合成至今仍依赖苯胺作为必需试剂。这种依赖凸显了开发从源头防止污染物产生的环境友好型染料替代品的必要性。
微生物生物合成已成为可持续色素生产的前沿策略。靛蓝素作为一种微生物来源的非核糖体肽色素，凭借其深蓝色泽以及抗氧化和抗菌等多功能特性，在替代合成蓝色染料方面展现出特别前景。靛蓝素由单模块非核糖体肽合成酶（NRPS）催化两分子L-谷氨酰胺缩合而成。
研究方法
2.1 菌株与质粒构建
所有构建的菌株和质粒列于补充材料中。菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032作为靛蓝素生产的起始宿主。大肠杆菌JM109用于质粒构建和基因克隆。密码子优化的靛蓝素合成酶基因bpsA由Azenta GENEWIZ有限公司（中国苏州）合成，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（PPTase）基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。这些基因以RBS连接子组装到pXMJ19载体的tac启动子下游，生成一组携带不同bpsA和PPTase组合的重组质粒。参与靛蓝素生物合成途径的基因从谷氨酸棒状杆菌基因组扩增，并依次插入pEC-XK99E载体。基因敲除突变体使用自杀质粒pK18mobsacB构建。各靶位点上下游同源臂融合并克隆到pK18mobsacB中进行扩增。使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司）进行两片段组装以构建所有质粒。最后，所有质粒通过Sanger测序（Azenta GENEWIZ有限公司，中国苏州）验证。
【数据】宿主菌株：C. glutamicum ATCC 13032；克隆宿主：E. coli JM109；载体：pXMJ19、pEC-XK99E、pK18mobsacB；基因合成公司：Azenta GENEWIZ（苏州）、南京金斯瑞；组装试剂盒：ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（诺唯赞）
2.2 培养基与培养条件
大肠杆菌在LB培养基中培养，含5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L NaCl。必要时加入15 g/L琼脂制备固体平板。谷氨酸棒状杆菌在脑心浸液山梨醇（BHIS）培养基中生长，该培养基含37.5 g/L脑心浸液和91 g/L D-山梨醇。摇瓶发酵在CGXII培养基中进行，含80 g/L葡萄糖、0.25 g/L MgSO4·7H2O、20 g/L (NH4)2SO4、1 g/L K2HPO4、1 g/L KH2PO4、5 g/L尿素、42 g/L MOPS、20 μg/L生物素、100 μg/L硫胺素及微量元素（10 mg/L MnSO4·5H2O、10 mg/L FeSO4·7H2O、10 mg/L ZnSO4·7H2O、2 mg/L CuSO4·5H2O、20 mg/L NiSO4·6H2O、10 mg/L CaCl2、0.31 mg/L CoCl2·6H2O）。初始pH用NaOH调至7.0。为维持含质粒菌株，相应抗生素按适当终浓度加入。摇瓶生产靛蓝素时，工程菌首先接种到4 mL BHIS肉汤中，30°C振荡培养14 h制备种子培养物。然后以4%（v/v）接种量转移到含50 mL CGXII培养基的500 mL挡板摇瓶中，30°C、200 rpm培养96 h。当培养物OD600达到0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1 mM以启动靛蓝素合成。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；BHIS培养基：37.5 g/L脑心浸液、91 g/L D-山梨醇；CGXII培养基：80 g/L葡萄糖、0.25 g/L MgSO4·7H2O、20 g/L (NH4)2SO4、1 g/L K2HPO4、1 g/L KH2PO4、5 g/L尿素、42 g/L MOPS、20 μg/L生物素、100 μg/L硫胺素；pH：7.0；种子培养：4 mL BHIS、30°C、14 h；接种量：4%（v/v）；摇瓶培养：500 mL挡板瓶、50 mL CGXII、30°C、200 rpm、96 h；IPTG诱导：OD600=0.8时加至0.1 mM
2.3 基因组编辑
谷氨酸棒状杆菌中的基因缺失采用已建立的两步同源重组方法，使用自杀质粒pK18mobsacB完成。以alaT基因缺失为代表例，构建的pK18-alaT质粒电穿孔转入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞。使用引物alaT-UH-F和alaT-DH-R通过菌落PCR验证单交换质粒整合事件，阳性克隆中出现双扩增子确认重组成功。这些阳性分离株随后接种到4 mL无选择压力BHIS肉汤中，30°C、200 rpm振荡培养14 h。随后，培养物划线到含25 g/L蔗糖的BHIS平板上筛选双交换事件。所得克隆通过菌落PCR筛选鉴定目标基因缺失。相同程序用于删除rosR、yggB和glnE基因。所有引物列于补充材料中。
【数据】电转化：pK18-alaT质粒；单交换验证：菌落PCR（引物alaT-UH-F/alaT-DH-R）；双交换筛选：含25 g/L蔗糖BHIS平板、30°C、200 rpm、14 h；敲除基因：alaT、rosR、yggB、glnE
2.4 靛蓝素补料分批发酵
首先，将质粒pXM-bpsA-RBS-Wlpl和pEC-glnA(Y405F)-odhI(T15A)-gdh-pyk转入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 alaT rosR yggB，生成最终发酵菌株CG35。然后，将构建菌株CG35的五个单菌落接种到含氯霉素（CmR，10 μg/mL）和卡那霉素（KanR，10 μg/mL）的5 mL BHIS培养基中进行种子制备。随后，将5%（v/v）种子液从试管接种到含100 mL BHIS培养基的500 mL摇瓶中，30°C、200 rpm培养。最后，将种子以5%（v/v）转移到装有2 L CGXII-YE培养基（基于CGXII，补充10 g/L酵母提取物）的5 L生物反应器（平行生物反应器，中国上海）中。当OD800达到约10时，向生物反应器加入终浓度0.05 mM的IPTG。通过自动补加50%（v/v）NH3·H2O维持pH为7.3。补料溶液由600 g/L葡萄糖、80 g/L (NH4)2SO4和20 g/L MgSO4·7H2O组成。当基础发酵培养基中的葡萄糖耗尽后，启动间歇补料以维持葡萄糖浓度在1-5 g/L。
【数据】菌株：CG35（ATCC13032 alaT rosR yggB + pXM-bpsA-RBS-Wlpl + pEC-glnA(Y405F)-odhI(T15A)-gdh-pyk）；抗生素：氯霉素10 μg/mL、卡那霉素10 μg/mL；种子培养：5 mL BHIS→100 mL BHIS（500 mL摇瓶）、30°C、200 rpm；接种量：5%（v/v）；生物反应器：5 L、2 L CGXII-YE培养基（含10 g/L酵母提取物）；IPTG：OD800≈10时加至0.05 mM；pH：7.3（50% v/v NH3·H2O自动补加）；补料液：600 g/L葡萄糖、80 g/L (NH4)2SO4、20 g/L MgSO4·7H2O；葡萄糖维持浓度：1-5 g/L
2.5 检测方法
细胞生长使用UV-5200分光光度计（METASH，上海）在800 nm处监测。靛蓝素在615 nm处的强吸光度干扰常规OD600读数，因此改用800 nm监测细胞生长。OD800与OD600之间的关系已在先前研究中建立。SDS-PAGE按照先前描述的方法进行。靛蓝素标准品购自江苏华诚生物科技有限公司。该商业标准品的身份和纯度及其与发酵产物的匹配通过超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）确认。靛蓝素标准曲线见补充图S1A。用DMSO稀释至特定浓度范围后，溶液加入96孔透明平底板进行测量，发酵样品中的浓度使用该标准曲线计算。葡萄糖浓度使用先前报道的HPLC方法测定。
【数据】细胞生长监测波长：800 nm（UV-5200分光光度计）；靛蓝素检测波长：615 nm；标准品来源：江苏华诚生物科技有限公司；分析方法：UPLC-MS、HPLC；标准曲线：补充图S1A
2.6 统计分析
为确保可重复性，所有数据以三次生物学独立重复（n = 3）的平均值±标准差（SD）表示。多组间统计比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及事后检验（Duncan法），P值低于0.05视为统计学显著。分析在IBM SPSS Statistics 27中实施，数据使用Origin 2021可视化。
【数据】重复次数：n = 3；统计方法：one-way ANOVA + Duncan事后检验；显著性阈值：P < 0.05；软件：IBM SPSS Statistics 27、Origin 2021
研究结果
3.1 微生物PPTase筛选实现靛蓝素高效生产
为实现通过完整生物合成途径高效生产蓝色色素靛蓝素，我们在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中建立了靛蓝素合成酶与PPTase共表达的异源表达系统。谷氨酸棒状杆菌拥有完整的三羧酸（TCA）循环，能够内源合成α-酮戊二酸，进而转化为L-谷氨酸和L-谷氨酰胺——靛蓝素的直接前体。因此，仅引入单一异源反应步骤就足以建立从中心代谢物到靛蓝素的完整生物合成路线。
系统构建中，我们选择来自Streptomyces lavendulae subsp. lavendulae的靛蓝素合成酶基因bpsA，与Sfp型PPTase基因sfp2共克隆到表达质粒pXMJ19中，创建共表达载体。该特定组合此前已被报道可获得最高靛蓝素产量。将此质粒导入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032后，观察到成功的蓝色色素积累。如补充图S1B和C所示，UPLC-MS分析显示样品与靛蓝素标准品在保留时间2.87 min处共享一个主要峰。该峰的质谱显示质子化分子离子[M + H]+位于m/z 249，与靛蓝素的理论分子式C10H9N4O4精确匹配。这证实了产物的成功鉴定，并证明了异源途径在宿主中的功能活性。
为激活bpsA最大表达并提高靛蓝素生产效率，我们以Sfp2为查询序列，基于BLAST比对数据选择新型PPTase，重点关注与Sfp2序列同一性低于30%的候选酶。该阈值设定用于识别关键功能域可能保守但整体序列足够分化的酶，从而创建探索新型功能兼容性的候选库。从各种细菌物种中选择了21个推定PPTase，包括：来自Nonomuraea sp. NPDC049400的NspN（WP397134153.1）、来自Saccharopolyspora endophytica的SepE（WP210973159.1）、来自Tetrasphaera sp.的Tpsp（MEI2774827.1）、来自Klebsiella pneumoniae的Kspn（WP136662294.1）、来自Nonomuraea insulae的Nmis（WP379525319.1）、来自Streptomyces sp. NPDC093546的SspN（WP403547162.1）、来自Rugosimonospora acidiphila的Rsap（WP345633098.1）、来自Candidatus Protofrankia californiensis的Cdpc（SBW24471.1）、来自Streptomyces sp. NBC00445的SsNB（WP328352320.1）、来自Streptomyces sp. H27-D2的SspH（WP326442049.1）、来自Lentzea sp. NPDC059081的LspN（WP382411948.1）、来自Gordonia sp. PP30的GspP（WP247863832.1）、来自Mycolicibacter terrae的Mltr（WP085261024.1）、来自Microbispora sp. KK1-11的MspK（WP142560498.1）、来自Lentzea sp. NBRC 105346的LsNB（WP285742760.1）、来自Actinoplanes sp. NPDC051411的AspN（WP364093167.1）、来自Pseudonocardiales bacterium的Pdbt（MDT7782542.1）、来自Lentzea jiangxiensis的Lzjx（SDP08176.1）、来自Actinocrispum wychmicini的Acwy（TCO60467.1）、来自Williamsia phyllosphaerae的Wlpl（WP188492210.1）以及来自Saccharothrix variisporea的Scvs（RKT73764.1）。这些候选酶的多序列比对和系统发育分析（补充图S3和S4）确认了它们在关键功能域的高度保守性，同时保持足够的序列多样性，适合功能筛选。
我们通过将靛蓝素合成酶基因bpsA与22个不同PPTase基因在野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中共表达，系统评估了PPTase对生产效率的影响。所有重组菌株在CGXII培养基中摇瓶条件下培养96 h。结果揭示了不同PPTase驱动的靛蓝素产量存在显著差异（图1），表明PPTase与bpsA之间的兼容性是影响途径通量的关键因素。
在所有工程菌株中，携带来自W. phyllosphaerae的PPTase基因Wlpl（质粒PXM-bpsA-RBS-Wlpl）的菌株CG07表现出最高的生产性能，靛蓝素产量达到1.45 g/L，比表达Sfp2的对照菌株CG22（1.23 g/L）提高了约17.9%。这一结果不仅成功从候选库中鉴定出高效PPTase，也证明了合理筛选兼容性激活酶可以有效提高异源NRPS在谷氨酸棒状杆菌中的催化效率。
我们观察到的现象与先前在大肠杆菌中的发现一致——不同PPTase与同一NRPS配对也导致产物合成能力的显著差异。这种变异反映了NRPS与其专用激活酶之间高度特异的相互作用。近期结构生物学研究表明，PPTase对载体蛋白结构域的识别和修饰效率受多种因素调控，包括载体蛋白的构象状态、结构域界面的互补性以及整体模块构象影响的结合位点可及性。因此，尽管Sfp型PPTase通常具有广泛的底物谱，但与特定NRPS的分子相互作用强度可能存在显著差异，从而直接影响整体途径通量。
为进一步评估PPTase表达，对Wlpl与参考酶Sfp2进行了SDS-PAGE分析（补充图S5）。Sfp2观察到与预期分子量（24-26 kDa）对应的明显条带，而Wlpl显示出明显较弱的条带，表明其在异源宿主中表达水平较低。这种有限的表达阻碍了足够可溶性蛋白的纯化以进行全面的体外动力学表征。值得注意的是，虽然未对所有候选酶进行系统的生化分析，但它们属于已充分鉴定的Sfp型PPTase家族，其催化机制和底物谱已被明确建立。因此，Wlpl在该系统中的优越激活能力更可能归因于与BpsA优化的蛋白质-蛋白质相互作用，而非催化活性的固有差异。未来的工作可以集中于改善Wlpl的表达和纯化，以实现更深入的生化和结构研究。
【数据】UPLC-MS：保留时间2.87 min、[M+H]+ m/z 249、分子式C10H9N4O4；候选PPTase数量：21个（序列同一性<30%）；共表达组合：22个；培养条件：CGXII、摇瓶、96 h；最高产量菌株：CG07（Wlpl）1.45 g/L；对照菌株CG22（Sfp2）1.23 g/L；提高幅度：约17.9%；SDS-PAGE：Wlpl条带弱于Sfp2（24-26 kDa）
3.2 组合敲除glnE、alaT、rosR和yggB系统评估与协同增强靛蓝素生产
成功构建基础产靛蓝素菌株后，我们系统评估了中心代谢中的关键基因，以进一步缓解代谢瓶颈并增强前体供应。glnE基因编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶，通过可逆腺苷酰化负调控谷氨酰胺合成酶（GS）活性。理论上，删除glnE基因应阻止GS失活，从而增强L-谷氨酸向L-谷氨酰胺的转化，为靛蓝素合成提供更丰富的前体。因此，我们在菌株CG07中敲除了染色体glnE基因，生成工程菌株CG23（图2）。
与预期相反，CG23的靛蓝素产量（1.36 g/L）比CG07（1.46 g/L）低6.5%。由于谷氨酰胺在多种转氨反应中充当氨基供体，其异常的胞内积累可能通过分支途径加剧竞争性消耗，如谷氨酰胺降解或用于核苷酸和其他氨基酸生物合成，最终降低了靛蓝素合成的碳通量。
【数据】菌株CG23（ΔglnE）产量：1.36 g/L；菌株CG07产量：1.46 g/L；产量变化：降低6.5%
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程成功构建了高产靛蓝素的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032工程菌株。关键策略包括筛选高效PPTase、重编程底盘代谢网络、优化关键途径基因表达以及系统改善发酵参数。最终工程菌株CG35在500 mL摇瓶中实现靛蓝素产量5.59 g/L；在5 L生物反应器中使用CGXII-YE培养基并补充谷氨酸钠的补料分批发酵中，产量达到34.45 g/L。这些成果通过独特的代谢工程方法实现，确立了谷氨酸棒状杆菌作为竞争性宿主的地位。该工作以PPTase系统筛选和底盘优化为核心，与大肠杆菌中采用的膜工程策略形成差异。与已报道的所有产靛蓝素谷氨酸棒状杆菌菌株的比较分析表明，本研究的工程菌株在工业相关发酵条件下实现了高产量，成为具有竞争力的生产者。这项工作为其他依赖翻译后修饰的微生物生物合成途径的合理优化提供了通用方法学参考。
编译者解读
本研究展示了"酶筛选+底盘工程+发酵优化"三位一体的系统代谢工程策略在谷氨酸棒状杆菌中的成功应用。从合成生物学角度看，其亮点在于以序列同一性<30%为阈值构建多样化PPTase候选库，从21个候选酶中筛出比基准酶Sfp2提高17.9%产量的Wlpl——这提示蛋白质-蛋白质相互作用界面优化是提升NRPS途径通量的有效杠杆。值得注意的是，摇瓶产量5.59 g/L与补料分批发酵34.45 g/L之间的近6倍差距，既体现了发酵条件优化的巨大潜力，也暗示当前菌株在规模化生产中仍有提升空间。局限在于Wlpl表达量低限制了体外生化表征，其激活机制尚待解析。
参考来源
Zhang, J. (2026). Combinatorial PPTase screening and systematic metabolic engineering for high-level indigoidine production in Corynebacterium glutamicum. Food Bioscience, 2026.
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108591
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108591