来源：Discovery, identification of tricyclic sesquiterpene avermitilol synthase, and its heterologous production in plasmid-free Corynebacterium glutamicum（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
三环倍半萜是一类具有广泛生物活性的天然产物，在医药、香料和可持续航空生物燃料领域具有应用潜力，但已知功能的三环倍半萜合酶（tSTS）数量有限。本研究开发了一套多步骤生物信息学筛选流程——整合BLAST同源过滤、保守基序验证、AlphaFold2结构建模和分子对接——从1063个候选基因中锁定6个推定tSTS，并在谷氨酸棒杆菌中实现异源表达。其中来自土壤放线菌（Actinokineospora terrae）的AtTPS被鉴定为新型avermitilol合酶，通过CRISPR相关转座子实现双拷贝染色体整合，最终在补料分批发酵中达到100.99 mg/L avermitilol产量。
研究背景
三环倍半萜属于I类萜类化合物，通过Mg²⁺依赖的法尼基焦磷酸（FPP）离子化生成法尼基或橙花基碳正离子中间体，启动复杂的环化级联反应。初始环化经由C1–C6、C1–C7、C1–C10或C1–C11键形成，随后依次发生碳正离子重排和氢转移，最终产生结构多样的三环骨架。tSTS在保守的α结构域萜烯合酶折叠中催化这一电离-环化序列，其中包含富含天冬氨酸的DDXXD和NSE/DTE金属结合基序，通过配位二价金属离子触发焦磷酸离去和碳正离子形成。
三环倍半萜具有多种生物活性，可作为药物、香料和特种化学品的重要骨架。此外，其高能量密度和良好的燃烧性能使其成为可持续航空生物燃料和先进燃料掺混应用的候选分子。工程微生物系统（包括大肠杆菌）已通过表达tSTS基因实现三环倍半萜的异源生产。然而，已表征的tSTS数量仍然有限，这构成了萜烯生物合成研究的主要瓶颈。
研究方法
2.1 菌株与预培养条件
本研究所用菌株和质粒列于表1和表S1。E. coli DH5α用于质粒构建和繁殖。Corynebacterium glutamicum ATCC 13032（野生型）和C. glutamicum JP-2（Park等，2021）——后者为含有idsA（E16Ter）和crtE（D21Ter）无义突变的衍生菌株，分别编码主要香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）合酶和额外GGPP合酶（Cg0723），以消除天然十异戊二烯黄素生物合成——被用作异源萜烯生产的宿主菌株（Lim等，2020；Park等，2021）。E. coli菌株常规培养于LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl），37°C、旋转摇床200 rpm。预培养时，C. glutamicum菌株在补充91 g/L山梨醇的脑心浸液（BHIS）培养基中、30°C、旋转摇床220 rpm条件下生长。倍半萜生产时，C. glutamicum菌株在CgXII限定培养基中培养，使用250 mL锥形瓶（补充4%（w/v）葡萄糖，120 rpm）或600 μL深孔板（补充2%（w/v）葡萄糖，1200 rpm），均在30°C下进行。需要时，氯霉素（Cm）添加浓度为：E. coli 30 μg/mL，C. glutamicum 7.5 μg/mL。卡那霉素（Km）添加浓度为：E. coli 50 μg/mL，C. glutamicum 25 μg/mL。壮观霉素（Sp）添加浓度为：E. coli 100 μg/mL，C. glutamicum 50 μg/mL。所有菌株以甘油贮存液（25%（v/v）甘油）于−80°C长期保存。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）、BHIS（含91 g/L山梨醇）、CgXII；温度：37°C（E. coli）/30°C（C. glutamicum）；转速：200 rpm（E. coli）/220 rpm（预培养）/120或1200 rpm（生产）；葡萄糖：4%或2%（w/v）；抗生素浓度：Cm 30/7.5 μg/mL、Km 50/25 μg/mL、Sp 100/50 μg/mL；保存：25%（v/v）甘油，−80°C
2.2 质粒构建
用于萜烯生产的所有重组质粒均基于pBbEC1c-RFP载体构建，该载体为C. glutamicum的pCG1起点高拷贝质粒（表1和表S1）。对于overMEP模块，使用pBbEC1c-OvM1表达dxs基因（编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶）、idi基因（编码异戊烯基焦磷酸异构酶）、来自E. coli的ispA基因（编码法尼基焦磷酸合酶）以及内源ispD和ispF基因（Lim等，2020），这些基因位于甲基赤藓醇4-磷酸（MEP）途径中。对于萜烯合酶（TPS）候选基因，六个密码子优化的倍半萜合酶基因（来自Actinokineospora terrae的AtTPS、来自Actinocrinis puniceicyclus的ApTPS、来自Seinonella peptonophila的SpTPS、来自Belliella baltica的BbTPS、来自Sorangium cellulosum的ScTPS和来自Streptosporangium sp.的SsTPS）由Twist Bioscience合成，针对C. glutamicum表达进行了密码子优化。所有PCR扩增使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio）按照制造商说明进行，引物列于表S2。pBbEC1c-RFP载体通过PCR扩增线性化以去除rfp编码序列，来自pSQS-DII和pIspDF的五个MEP途径基因（dxs、idi、ispA、ispD和ispF）使用Gibson Assembly Master Mix（New England Biolabs）在单次反应中组装到线性化载体中。所得构建体（pBbEC1c-OvM1）包含在Ptrc启动子控制下的多顺反子操纵子形式的MEP途径盒。随后，每个萜烯合酶基因插入dxs基因上游，生成最终表达质粒pBbEC1c-[TPS]-OvM1，其中[TPS]代表AtTPS、ApTPS、SpTPS、BbTPS、ScTPS或SsTPS。进行启动子交换时，将Ptrc启动子替换为来自先前研究（Kang等，2022）的组成型无前导序列合成启动子（p7_σB LL和p15_σB LL）（表S3），分别生成pb7-AMS-OvM1和pb15-AMS-OvM1。为生成AMS–IspA融合构建体，将短接头（GSG）和长接头（GGGGS）引入pb7-AMS-OvM1，分别生成pb7-AMS-OvM2和pb7-AMS-OvM3。阳性菌落通过Sanger测序（Macrogen，韩国）验证，确认所有插入基因的正确组装和序列保真度。验证后的质粒通过电穿孔转化到C. glutamicum中，菌株验证使用菌落PCR和DNA测序（Eggeling和Bott，2005）。
【数据】载体骨架：pBbEC1c-RFP（pCG1起点高拷贝）；MEP模块基因：dxs、idi、ispA（E. coli来源）、ispD、ispF（内源）；启动子：Ptrc、p7_σB LL、p15_σB LL；接头：GSG（短）、GGGGS（长）；聚合酶：PrimeSTAR GXL；组装：Gibson Assembly Master Mix
2.3 染色体整合菌株的构建
为提高遗传稳定性并消除发酵过程中对抗生素选择的需求，使用RNA引导的DNA整合系统（Klompe等，2019）构建染色体整合菌株。位点特异性染色体整合使用双质粒系统：辅助质粒表达crRNA和TniQ-Cac876-TnsABC转座酶复合物，供体质粒携带侧翼为Vibrio cholerae整合酶识别序列（R端和L端）的目标基因盒。将b7-AMS-OvM3表达盒克隆到pDonor中，生成pDonor-AMS-OvM3。质粒依次通过电穿孔转化到C. glutamicum JP-2中，转化子在补充卡那霉素和壮观霉素的BHIS琼脂平板上筛选。单拷贝和双拷贝整合菌株通过使用不同crRNA序列靶向不同基因间位点构建。整合成功通过跨基因组-基因盒边界的junction PCR确认，随后对扩增产物进行Sanger测序。验证后，整合质粒和辅助质粒通过在无抗生素培养基中连续传代消除，质粒丢失通过抗生素敏感性测试确认。所得无标记菌株命名为AVM-int01cp（单拷贝整合子）和AVM-int02cp（双拷贝整合子），用于后续生产优化实验（表1）。
【数据】整合系统：INTEGRATE（pDonor + pHelper）；筛选标记：卡那霉素、壮观霉素；整合位点：不同基因间位点（int-site04、int-site05）；菌株：AVM-int01cp（单拷贝）、AVM-int02cp（双拷贝）
2.4 全基因组测序
为严格确认染色体整合位点、基因盒拷贝数和脱靶插入的存在情况，使用Oxford Nanopore Technology（Oxford Nanopore Technologies，英国）对AVM-int02cp进行全基因组测序（WGS）。基因组DNA从过夜培养物中提取，在Nanopore R9.4.1流动槽上测序。所有测序数据使用Galaxy平台（https://usegalaxy.eu/）上的Oxford Nanopore长读长测序分析流程进行处理和分析（Afgan等，2022）。简要而言，读长质量指标（包括总碱基数、读长长度分布和质量分数）使用NanoStat（v1.6.0）评估。原始读长使用Porechop_ABI（v0.5.0）进行接头修剪，并使用minimap2（v2.30；预设：--ax map-ont）比对到与INTEGRATE基因盒序列（6697 bp）连接的C. glutamicum ATCC 13032参考基因组（GenBank：BA000036.3）。结构变异使用Sniffles2（v2.5.2）调用。跨宿主基因组-基因盒边界的整合位点和junction读长使用Integrative Genomics Viewer（IGV，v2.19.7）可视化。宿主基因组和INTEGRATE基因盒的测序深度使用mosdepth（v0.3.3）计算，以确定实际比对覆盖度并估计基因盒拷贝数。
【数据】测序平台：Oxford Nanopore（R9.4.1流动槽）；分析工具：NanoStat v1.6.0、Porechop_ABI v0.5.0、minimap2 v2.30、Sniffles2 v2.5.2、IGV v2.19.7、mosdepth v0.3.3；参考基因组：BA000036.3 + INTEGRATE盒（6697 bp）
2.5 基于实时qPCR的遗传稳定性分析
为评估长期染色体整合稳定性，使用标准CTAB法从基因整合菌株（AVM-int02cp）中提取基因组DNA。实时qPCR在QuantStudio 3系统（Applied Biosystems）上使用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2×，无AmpErase UNG）进行。设计了三个TaqMan检测：（i）靶向gyrB的看家基因检测（qPCR-gyrB-F/R/P；FAM/BHQ1；扩增子85 bp），（ii）int-site04整合位点的跨junction检测（qPCR-Int1L-F/R/P；HEX/MGBEclipse；扩增子137 bp），（iii）int-site05整合位点的跨junction检测（qPCR-Int2L-F/R/P；CY5/BHQ2；扩增子165 bp）。引物和探针序列列于表S4。反应总体积为20 μL，包含10 μL 2× Master Mix、1 μL 20×引物-探针混合物（各引物900 nM，探针250 nM）……
【数据】qPCR平台：QuantStudio 3；Master Mix：TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2×）；检测体系：gyrB（FAM/BHQ1，85 bp）、int-site04（HEX/MGBEclipse，137 bp）、int-site05（CY5/BHQ2，165 bp）；反应体积：20 μL（10 μL 2× Master Mix + 1 μL 20×引物-探针混合物，引物900 nM，探针250 nM）
研究结果
3.1 未表征tSTS的基因发现与筛选
为鉴定潜在的未表征tSTS基因，我们应用了结合基于序列、基于知识、基于属和基于结构的过滤策略的多步骤生物信息学筛选流程（图2A）。第一步，使用已知编码tSTS的序列进行蛋白BLAST搜索。选择五个结构和系统发育上的tSTS作为查询序列（图1）。三个倍半萜TPS催化法尼基阳离子经由1,11-闭合和1,10-闭合后第三次环闭合生成三环倍半萜：来自Streptomyces exfoliatus的pentalenene合酶（UniProt：Q55012）、来自Matricaria chamomilla var. recutita的α-isocomene合酶（UniProt：I6R4V5）、来自S. coelicolor的epi-isozizaene合酶（UniProt：Q9K499）。另外两个倍半萜TPS催化橙花基阳离子经由1,11-闭合和1,10-闭合后第三次环闭合生成三环倍半萜：来自Pogostemon cablin的patchoulol合酶（UniProt：Q49SP3）和来自Picea abies的longifolene合酶（UniProt：Q675L0）。首先，BLAST搜索鉴定出与五个查询模板中至少一个具有20–80%一致性的序列，产生1063个满足预定一致性阈值的候选TPS序列，该阈值旨在保留I类萜烯环化酶活性同时排除几乎相同的TPS序列（第1阶段）。接下来，1063个候选池经过各种知识引导的筛选过程，以富集功能合格、未表征的倍半萜合酶（第2阶段）（图2B）。蛋白长度限制在290–550个氨基酸残基，因为细菌和放线菌TPS基因编码约330–350个氨基酸的单结构域催化单元，而植物倍半萜合酶通常约为540–600个氨基酸，原因是存在微生物酶中缺失的额外N端结构域（Reddy等，2020；Steele等，1998）。然后，评估每个候选是否存在I类倍半萜合酶功能所必需的四个保守催化序列基序：DDXXD、NSE/DTE、ER-DR和RY基序（图2B）。DDXXD（富含天冬氨酸）基序和NSE/DTE三元组［(N/D)DXX(S/T)XXE］代表I类萜烯合酶的两个普遍保守的金属结合结构域。DDXXD基序的第一个天冬氨酸（EIZS中的D99DRHD）以syn,syn-二齿几何配位三个必需Mg²⁺离子中的两个（Mg²⁺A和Mg²⁺C），而NSE基序（EIZS中的N240DLCSLPKE）配位第三个Mg²⁺离子（Mg²⁺B）（Aaron等，2010）。这些三核金属簇共同介导Mg²⁺依赖性底物FPP电离，生成启动环化级联的初始烯丙基碳正离子。ER-DR基序有助于闭合活性位点构象的静电稳定性。螺旋G上的Arg194和Arg195分别与Glu175（螺旋F）和Asp103（螺旋D）形成盐桥，从而在底物结合和催化过程中稳定蛋白架构。RY基序在C1-C11倍半萜环化酶中高度保守，向活性位点中FPP的焦磷酸部分提供氢键，促进底物识别和首次环化事件的定位（Wang等，2022）。因此，保留所有四个基序且序列上下文正确的候选进入下一轮，筛选出545个序列。
【数据】初始候选数：1063；查询序列：5个已知tSTS（pentalenene合酶Q55012、α-isocomene合酶I6R4V5、epi-isozizaene合酶Q9K499、patchoulol合酶Q49SP3、longifolene合酶Q675L0）；一致性阈值：20–80%；蛋白长度范围：290–550 aa；基序筛选后：545个序列；保守基序：DDXXD、NSE/DTE、ER-DR、RY
3.2 基于蛋白结构的未表征tSTS对接筛选
进行基于结构的对接筛选，通过分析配体（FPP）与催化残基的相互作用以及结合FPP的分子内C1–C10距离来评估底物对接过程中的环状萜烯形成（第3阶段）（图2C）。为验证该程序，选择10个已注释的环状TPS（表S6）作为阳性对照。首先，使用AlphaFold2通过AlphaFold Server预测9个阳性对照的三维蛋白模型，已知的SaAS（PDB：9Y6I，来自Streptomyces avermitilis的Avermitilol合酶）除外。9个对照的预测局部距离差异检验（pLDDT）分数表明，9个对照中有6个属于极高度置信类别（活性位点>90），其余3个被归类为高度置信（活性位点70 < pLDDT < 90）（表S6），并分析预测对齐误差（PAE）图谱以验证结构置信度，尤其是催化核心区域，平均PAE值低于5 Å（图S1）。将FPP转换为PDBQT格式进行柔性对接后，使用AutoDock Vina以FPP为底物进行模拟。候选评估基于：（i）FPP在预测活性位点内的几何兼容性，（ii）金属配位基序相对于FPP焦磷酸部分的空间定位，以及（iii）是否存在足够封闭的疏水口袋，能够以环化胜任构象容纳法尼基链。在默认对接参数下，所有阳性对照均满足这些标准。随后，测量每个生成的对接姿态中FPP的C1和C10原子之间的距离，以鉴定环化胜任构象。所有阳性对照均满足C1–C10距离标准（<5 Å），与初始C1–C10环闭合的几何兼容性一致（图2D和表S6）。为加强知识产权（IP）定位，仅保留公共数据库中缺乏功能注释且来源于微生物的序列，以最大化发现未表征三环倍半萜的可能性并促进在微生物宿主中的功能表达。此外，排除来源于Streptomyces属的候选。Streptomyces spp.代表天然产物基因组挖掘中研究最深入的细菌属，大多数已表征的细菌倍半萜合酶均来自该属（Cane和Ikeda，2011；Demain和Sanchez，2009；Ward和Allenby，2018）。我们承认这种IP导向的筛选可能通过排除潜在相关同源物而引入候选选择偏差。然而，在缺乏自动化第3阶段框架的情况下，我们选择聚焦于具有更大IP差异化潜力的候选。经过额外的IP筛选，从545个第2阶段候选中保留16个进行结构评估。对每个候选，计算满足C1–C10距离标准（<5 Å）的对接姿态比例，作为环化概率分数（图S7）。环化概率大于30%的候选被视为潜在环状倍半萜合酶。基于环化概率以及活性位点架构和底物结合几何，选择前六个候选作为推定tSTS进行实验验证：来自A. terrae的AtTPS、来自A. puniceicyclus的ApTPS、来自S. peptonophila的SpTPS、来自B. baltica的BbTPS、来自S. cellulosum的ScTPS和来自Streptosporangium sp.的SsTPS。在第2阶段序列水平筛选后，确认六个候选均含有四个保守基序（DDXXD、ER-DR、NSE/DTE和RY）（图3A）。在结构水平（第3阶段），评估PAE图谱以确认结构域完整性和催化位点可靠性，平均PAE值低于5 Å，相应的AutoDock Vina网格参数列于表S8和图S2。将FPP分子对接至所选TPS的AlphaFold2衍生结构模型（表S9）中，显示出FPP的焦磷酸头基位于保守DDXXD和NSE/DTE金属结合残基附近的结合姿态，与生产性底物结合模式一致（图3B–G）。
【数据】阳性对照：10个已注释环状TPS；结构预测：AlphaFold2（pLDDT：6/9极高度置信>90，3/9高度置信70-90；平均PAE < 5 Å）；对接工具：AutoDock Vina；C1–C10距离标准：<5 Å；IP筛选后保留：16个候选；环化概率阈值：>30%；最终选择：6个候选（AtTPS、ApTPS、SpTPS、BbTPS、ScTPS、SsTPS）
3.3 潜在环状倍半萜合酶的异源生产
3.4 Avermitilol（1）的结构鉴定与生物合成机制
3.5 不同启动子和融合接头对重组*C. glutamicum*菌株的培养影响
3.6 无质粒工程*C. glutamicum*菌株的构建
3.7 菌株AVM-int02cp的补料分批发酵
讨论与解读
本研究建立了从基因发现到生产的完整工作流程，用于三环倍半萜avermitilol的生物合成。萜烯生物合成的主要挑战在于：基因组序列数据快速积累，但功能表征的合酶数量有限。为突破这一瓶颈，研究团队开发了多阶段筛选框架——整合同源挖掘、基序过滤、AlphaFold2结构预测和分子对接分析。该流程将1063个初始候选逐步缩减至6个基因，全部编码功能性环状倍半萜合酶，其中包括从A. terrae中鉴定出的新型AMS。
基因发现之后，代谢工程策略的实施建立了工业相关生产平台：启动子工程实现无诱导剂表达，AMS与IspA的融合提高了途径效率，CRISPR相关转座子介导的染色体整合消除了质粒和抗生素依赖性，同时维持长期遗传稳定性。所得菌株在补料分批发酵中达到100.99 mg/L avermitilol产量，证明了生产平台的可扩展性和稳健性。值得注意的是，染色体整合菌株在连续传代中保持稳定生产，而质粒菌株损失了超过90%的生产力——这一对比凸显了染色体整合策略在工业发酵中的实际价值。
【编译者解读】该研究的核心亮点在于将AI辅助结构预测（AlphaFold2）与分子对接纳入基因挖掘流程，显著提高了新酶发现的命中率——6个候选全部具有催化活性，这一成功率远超传统同源筛选。从应用角度看，无质粒、无抗生素依赖的染色体整合策略契合工业发酵对菌株稳定性和安全性的要求，100.99 mg/L的产量为后续途径优化提供了坚实基础。然而，该流程对计算资源要求较高，且IP导向的筛选策略（排除链霉菌属）可能遗漏重要同源酶，这在一定程度上限制了方法的普适性。
参考来源
Kim, S.-E. (2026). Discovery, identification of tricyclic sesquiterpene avermitilol synthase, and its heterologous production in plasmid-free Corynebacterium glutamicum. Metabolic Engineering. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102520
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102520