来源：Improvement in organic solvent resistance of keratinase BLk by directed evolution（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
角蛋白酶是羽毛降解的关键酶，但在工业应用中常需面对有机溶剂存在的严苛反应环境。既往研究多聚焦于提高角蛋白酶的热稳定性，而本研究另辟蹊径——通过定向进化策略，从地衣芽孢杆菌来源的角蛋白酶BLk出发，筛选获得三个有机溶剂稳定性显著提升的突变体D41A、A24E和A24Q。在50%（v/v）乙腈存在下，三者的半衰期分别比野生型提高47倍、63倍和61倍，且蛋白水解活性未受损害。分子动力学模拟揭示，新形成的分子内氢键与疏水相互作用是耐受性增强的结构基础。
研究背景
角蛋白是哺乳动物角、羊毛、爪子、羽毛和喙中含量丰富的不溶性纤维蛋白，其稳定性源于紧密堆积、二硫键和疏水相互作用，使其能够抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶等蛋白酶的降解。虽然化学或物理化学水解法可用于角蛋白利用，但这些方法消耗大量能源并产生有害气体，对环境不利。近年来，角蛋白酶在生物修复中受到关注，因其在角蛋白资源管理和将角蛋白废弃物降解为氨基酸或可溶性肽方面发挥关键作用。已报道多种产角蛋白酶的微生物，包括曲霉属和小孢子菌属等真菌，以及芽孢杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属等细菌。这些角蛋白酶根据MEROPS数据库分为14个不同的蛋白酶家族。角蛋白酶区别于其他蛋白酶的独特性质是其能够结合不溶性蛋白质底物。然而，天然不溶性底物（如家禽羽毛）通常形成严苛环境，对角蛋白酶的应用构成挑战。
研究方法
2.1 化学品与菌株
采用枯草芽孢杆菌WB800作为基因克隆和表达的宿主，pHY300作为载体。限制性内切酶购自Takara（中国大连）。DNA聚合酶和ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit购自Vazyme（中国南京）。本研究中所有其他化学品购自Sigma Chemical Co.（中国上海）或Sangon Biotech（中国上海）。
【数据】菌株：B. subtilis WB800；载体：pHY300；试剂来源：Takara、Vazyme、Sigma、Sangon Biotech
2.2 随机突变文库构建
携带PHY300-BLk质粒的重组枯草芽孢杆菌WB800和大肠杆菌DH 5ɑ保存于本实验室。采用易错PCR构建突变文库。PCR反应体系为50 μL，包含0.3 mM dNTP、0.1 ng/µL模板DNA、0.01 mM MnCl₂、0.05 U/μL Taq DNA聚合酶、0.02 mM引物和1.5 mM MgCl₂。反应产物用Dpn I在37°C消化1小时，然后插入PHY300载体。重组质粒转化至大肠杆菌DH 5ɑ后进行测序。经验证的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌WB800进行表达。本研究所用引物列于表S1。将重组枯草芽孢杆菌WB800在含卡那霉素（50 μg/mL）的Terrific Broth（TB）培养基中的过夜培养物（1 mL）接种至100 mL含卡那霉素（50 μg/mL）的TB培养基中，于37°C、180 rpm条件下培养48小时。培养上清液通过离心收集，上样至HiTrap Phenyl-Sepharose Fast-Flow疏水相互作用层析柱。收集洗脱级分用于活性测定。
【数据】PCR体系：50 μL；dNTP：0.3 mM；模板DNA：0.1 ng/µL；MnCl₂：0.01 mM；Taq DNA聚合酶：0.05 U/μL；引物：0.02 mM；MgCl₂：1.5 mM；Dpn I消化：37°C、1h；卡那霉素：50 μg/mL；培养条件：37°C、180 rpm、48h
2.3 蛋白酶突变体的筛选与测定
蛋白酶活性测定按照先前描述的方法进行（Zhu et al., 2016a）。将2 mL样品加入含2%（w/v）酪蛋白和50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）的溶液（2 mL）中。混合物在40°C孵育10分钟，然后加入4.0 mL TCA混合物（含0.11 M三氯乙酸、0.22 M乙酸钠和0.33 M乙酸）终止反应。该混合物进一步在15,000 ×g离心15分钟，在280 nm处测定上清液吸光度，以空白对照为参比。一个蛋白酶活性单位（U）定义为在测定条件下每分钟水解酪蛋白产生1 µg酪氨酸的酶量。本研究使用50%（v/v）N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液评估突变体的溶剂稳定性。混合物在带螺旋盖的通用瓶中于37°C孵育2小时。在标准测定条件下测定初始活性和残留活性。计算相对残留活性以表示稳定性。选择与WT蛋白酶相比相对残留活性有显著差异的突变体进行进一步分析，随后测定这些选定突变体的序列。
【数据】酪蛋白浓度：2%（w/v）；Tris-HCl缓冲液：50 mM，pH 8.0；反应温度：40°C；反应时间：10min；TCA混合物：0.11 M三氯乙酸/0.22 M乙酸钠/0.33 M乙酸；离心：15,000 ×g、15min；检测波长：280nm；DMF浓度：50%（v/v）；孵育条件：37°C、2h
2.4 突变体的性质表征
突变体在有机溶剂中的稳定性评估如下：蛋白酶变体在pH 10.0、温度37°C、200 rpm振荡条件下，于50%（v/v）各种有机溶剂存在下孵育。在不同时间间隔测定蛋白酶的残留活性。半衰期（T1/2）通过指数回归曲线计算。每个实验重复三次。酶活最适温度通过在pH 10.0条件下将温度从20°C升高至65°C测定。纯化酶的热稳定性通过将其在30至60°C温度范围内预孵育30分钟测定，然后使用活性测定方法分析残留活性。动力学常数按照先前描述的方法测定（Fang et al., 2016）。反应在40°C下、含0.1–1.0 mM N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA的100 mM Tris-HCl缓冲液中进行。在405 nm处测定吸光度。使用Origin 2016通过非线性拟合计算Km和kcat值。所有测定均重复三次。
【数据】溶剂稳定性测定：pH 10.0、37°C、200 rpm；最适温度范围：20-65°C；热稳定性预孵育：30-60°C、30min；底物浓度：0.1–1.0 mM；缓冲液：100 mM Tris-HCl；反应温度：40°C；检测波长：405nm
2.5 圆二色光谱测定
圆二色（CD）光谱使用Chirascan™ CD光谱仪（Leatherhead，UK）按照先前描述的方法生成（Zhu et al., 2018）。将4–6 μM酶样品注入1 mm比色皿中。使用1-nm带宽在190至260 nm范围内测量样品光谱。
【数据】酶浓度：4–6 μM；比色皿光程：1mm；扫描范围：190-260nm；带宽：1nm
2.6 突变体的结构特征
使用SWISS-MODEL（http://swissmodel_expasy.org）基于地衣芽孢杆菌蛋白酶X射线晶体结构（Protein Data Bank ID：1A1Y，晶体分辨率：1.05 Å）对角蛋白酶及其突变体进行结构建模，该结构与角蛋白酶BLk具有99.6%的一致性。使用Discovery Studio 2019和PyMOL 2.6软件进行结构可视化和分析。
【数据】模板结构：PDB ID 1A1Y；分辨率：1.05 Å；序列一致性：99.6%
2.7 分子动力学模拟
使用Gromacs 2018版本进行分子动力学（MD）模拟，以分析促进溶剂稳定性改善的因素，如前所述（Zhu et al., 2020）。MD模拟采用GROMOS 53A6力场。角蛋白酶BLk模型用50%（v/v）乙腈/水混合物溶剂化，使用显式水分子并采用简单点电荷模型建模（Hermans et al., 1984）。通过添加钠离子中和MD模拟系统。电中性系统随后使用最速下降法进行能量最小化，随后进行500-ps MD模拟，期间重原子和酶保持固定。随后，在300 K温度下对整个系统进行20-ns MD模拟。使用LINCS算法约束键长（Hess et al., 1997）。范德华相互作用的截断值设为1.0 nm，静电相互作用使用particle mesh Ewald算法计算。应用周期性边界条件，每1-ps间隔保存坐标用于分析。使用Gromacs工具分析各种表征参数，如均方根偏差（RMSD）值、均方根波动（RMSF）值、回旋半径（Rg）值、径向分布g(r)和氢键。使用PyMOL 2.6开源版和Discovery Studio 2019程序分析酶的结构。
【数据】力场：GROMOS 53A6；溶剂：50%（v/v）乙腈/水；能量最小化：最速下降法；预平衡：500-ps；生产模拟：20-ns、300K；范德华截断：1.0nm；坐标保存间隔：1-ps
研究结果
3.1 突变文库构建与筛选
来自地衣芽孢杆菌的角蛋白酶BLk对50%（v/v）DMF敏感，该溶剂对大多数酶具有毒性。因此，选择50%（v/v）DMF作为典型突变体筛选的有机溶剂。本研究通过增加脱脂牛奶平板中的透明圈，并评估蛋白酶在50%（v/v）DMF存在下孵育后蛋白水解活性的保留率，进行随机突变文库筛选。从包含2000多个克隆的突变文库中获得了13个溶剂稳定性显著变化但蛋白水解活性无显著差异的突变体。如表1所示，突变体D41A、A24E和A24Q在50% DMF中孵育90分钟后活性显著增加，而其他突变体与WT蛋白酶相比活性显著降低。结构分析显示，所有突变均位于蛋白质表面，主要位于酶二级结构的环区（如图S1所示）。这表明环区的表面残基在酶的溶剂耐受性中发挥重要作用，这与先前报道一致（Ogino et al., 2007）。为进一步探索突变体的性质并理解有机溶剂稳定性变化的可能原因，对突变体的性质进行了进一步研究。
【数据】突变文库规模：>2000个克隆；筛选溶剂：50%（v/v）DMF；孵育时间：90min；阳性突变体：13个
3.2 角蛋白酶BLk变体的性质表征
为进一步研究溶剂稳定性，我们测定了突变体和WT酶的半衰期。如表2所示，三个突变体（A24E、A24Q和D41A）在所有测试溶剂中均表现出改善的稳定性，正庚烷除外。值得注意的是，在50%（v/v）乙腈存在下，D41A、A24E和A24Q的半衰期分别比WT增加47倍、63倍和61倍。类似地，在50%（v/v）丙酮存在下，D41A、A24E和A24Q的半衰期分别增加22倍、27倍和27倍。这些突变体表现出对极性溶剂的显著耐受性。其余突变体在有机溶剂中表现出较低的稳定性。图1展示了BLk及其突变体在50%（v/v）乙腈存在下随时间变化的残留活性。这些结果表明，第24位和第41位的氨基酸残基在BLk的溶剂耐受性中发挥重要作用。先前研究曾报道特定残基的突变可以改善酶的有机溶剂稳定性，但通过单点突变实现溶剂稳定性的显著改善鲜有报道（Yamada et al., 2015）。本研究所获突变体有望在挑战性环境中有效管理角蛋白。
酶的热稳定性是角蛋白处理工业应用中需要考虑的重要因素。本研究还考察了突变体和WT酶的热稳定性和最适温度。如图2A所示，A24E和A24Q突变体相比WT酶表现出增加的热稳定性。值得注意的是，A24E和A24Q的最适温度也高于WT蛋白酶，达到60°C（图2B）。然而，突变体D41A表现出与WT BLk相似的热稳定性和最适温度。虽然多项研究报道有机溶剂稳定性与热稳定性之间存在显著关联，但本研究未获得类似结果。突变体D41A表现出增强的有机溶剂耐受性，但其热稳定性与WT蛋白酶相似。这些结果表明，溶剂耐受性增强的机制不同于热稳定性的机制。
测定了BLk及其突变体的比蛋白水解活性，并分析了包括Km和kcat值在内的动力学常数。突变体与WT酶之间未观察到显著差异（如表S2所示）。此前多项研究表明，稳定性增强通常以牺牲催化活性为代价（Miller, 2017）。然而，本研究证实突变体的活性在稳定性增加的同时保持不受影响。这可能归因于位于酶表面的突变对活性的贡献有限，如我们先前报告所述（Zhu et al., 2016b）。为研究突变对酶二级结构的影响，测定了WT和突变体的CD光谱，如图S2所示。所有酶呈现相似的趋势线，表明突变对BLk的二级结构没有显著影响。
【数据】乙腈中半衰期提升倍数：D41A 47倍、A24E 63倍、A24Q 61倍；丙酮中半衰期提升倍数：D41A 22倍、A24E 27倍、A24Q 27倍；A24E/A24Q最适温度：60°C
3.3 溶剂耐受性的机理解释
在50%（v/v）乙腈存在下观察到溶剂稳定性的显著差异。因此，选择50%（v/v）乙腈混合物作为MD模拟的溶剂。为阐明突变酶溶剂稳定性增强的原因，进行了20-ns MD模拟。RMSD代表MD模拟过程中构象改变的程度，反映蛋白质的刚性，因此是评估蛋白质稳定性的关键指标。本研究测定了变体的RMSD值（图3A）。突变体A24E、A24Q和D41A在50%（v/v）乙腈存在下表现出低于WT酶的RMSD值，表明突变体的结构比WT酶更稳定。RMSF值是衡量目标蛋白中每个残基柔性的指标。如图3B所示，WT酶的RMSF值高于其他三个突变体，特别是在N端、C端和155–165氨基酸环区。WT、A24E、A24Q和D41A的平均RMSF值分别为0.096、0.068、0.075和0.076 nm。BLk变体的溶剂稳定性趋势为A24E > A24Q > D41A > WT，这与先前的实验结果一致。
氢键代表至关重要的非共价相互作用。大量研究报道稳定性增强总是伴随新氢键的形成，这有利于蛋白质稳定（Pace et al., 2014）。在本研究中，突变体中形成了新的氢键。具体而言，在A24E中，Glu24的γ-COOH与Lys22的α-NH₂和Ser86的β-OH之间形成了两个新氢键。此外，在A24Q中，Gln24侧链羰基氧与Ser86的β-OH之间仅形成一个新氢键，如图4所示。为评估这些新形成氢键的稳定性，计算了占用率并呈现于表3中。值得注意的是，所有形成的氢键占用率均>70%，表明它们在突变酶结构中稳定存在。我们推测这些稳定氢键促进了突变体中分子内相互作用网络的形成，从而赋予结构刚性并保持其天然构象。因此，筛选出的突变体A24E和A24Q相比WT BLk表现出增强的溶剂稳定性。
与WT酶相比，突变酶中第41位残基（Ala41）的氢键较少。在WT酶中，氢键主要形成于Asp41与蛋白质骨架的α-氨基或α-羧基之间。结构上，Asp41残基部分埋藏，被众多疏水氨基酸包围，如图5A所示。相比之下，Ala残基的侧链是甲基，允许与环区或Ca离子有更灵活的相互作用，从而促进局部稳定。因此，我们推测Asp41 → Ala41突变减少了Asp41引起的排斥效应。此外，Asp41的β-COOH在生理条件下可能因pKa而去质子化并带电荷……
【数据】平均RMSF值：WT 0.096 nm、A24E 0.068 nm、A24Q 0.075 nm、D41A 0.076 nm；氢键占用率：>70%
讨论与解读
近年来，角蛋白酶因其作为角蛋白水解关键酶的应用而受到关注。本研究采用定向进化提高角蛋白酶在有机溶剂中的稳定性。鉴定了三个突变体A24E、A24Q和D41A，在50%（v/v）乙腈存在下，其半衰期相比WT分别显著提高47倍、63倍和61倍。然而，根据性质分析，仅突变体A24E和A24Q表现出显著改善的热稳定性。这一结果表明，蛋白质的有机溶剂耐受性受不同于其热稳定性的机制支配。此外，合理化了溶剂稳定性增强的可能机制——酶结构内增加的氢键和亲水相互作用导致更紧凑的构象，限制了有机溶剂的渗透。因此，本研究所获突变体适用于工业应用。
编译者解读：本研究巧妙地将定向进化策略应用于角蛋白酶的有机溶剂耐受性改良，而非传统的热稳定性方向，拓展了工业酶改造的维度。值得关注的是，三个有益突变均位于酶表面环区，且不损害催化活性，打破了"稳定性-活性权衡"的常规认知。分子动力学模拟为表面突变如何通过局部氢键网络增强整体构象刚性提供了原子级解释。不过，研究仍停留在实验室规模表征阶段，突变体在真实羽毛降解工业体系（含还原剂、表面活性剂等复杂组分）中的表现尚待验证。未来若能将此类表面工程策略推广至其他工业酶，将具有广泛的应用前景。
参考来源
Zhu, F. (2024). Improvement in organic solvent resistance of keratinase BLk by directed evolution. Journal of Biotechnology. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.01.007
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.01.007