来源：Simultaneous enhancement of thermostability and catalytic activity of κ-carrageenase from Pseudoalteromonas tetraodonis by rational design（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
κ-卡拉胶酶是制备κ-卡拉胶寡糖的绿色生物工具，但来自四联假交替单胞菌的该酶虽在碱性条件下有活性，热稳定性却较差。本研究利用PoPMuSiC算法理性设计筛选出Q42V和I51H两个突变体，酶活性分别提升20.9%和25.4%，50°C处理40分钟后残余活性较野生型提高31.1%和25.9%。分子动力学与对接分析揭示了活性提升的结构基础，为卡拉胶寡糖的工业化生产提供了优良候选酶。
研究背景
κ-卡拉胶是由3,6-脱水-α-D-半乳糖和β-D-半乳糖-4-硫酸通过交替的α-(1,3)和β-(1,4)糖苷键连接而成的线性多糖。κ-卡拉胶酶（EC 3.2.1.83）属于糖苷水解酶第16家族，能特异性水解κ-卡拉胶中β-D-半乳糖-4-硫酸与3,6-脱水-α-D-半乳糖之间的(1→4)-β-D键，产生偶数聚合度的κ-卡拉胶寡糖。该酶主要来源于海洋微生物和海洋动物，其催化机制依赖于谷氨酸和/或天冬氨酸残基构成的酸/碱和亲核催化剂，通过双替换反应以保留机制完成糖基化和去糖基化步骤。除制备κ-卡拉胶寡糖外，κ-卡拉胶酶还在海藻原生质体分离、卡拉胶精细结构解析及海藻废弃物处理等领域有广泛应用前景。然而，天然κ-卡拉胶酶的热稳定性不足严重限制了其工业应用，如何在不损失催化活性的前提下提升酶的热稳定性，是该领域的关键挑战。
研究方法
2.1 κ-卡拉胶酶基因的构建
野生型四联假交替单胞菌κ-卡拉胶酶（WT）基因由深圳华大基因股份有限公司合成，并插入pET-28a(+)载体（Novagen，美国麦迪逊）。重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)用于野生型酶的表达。
【数据】载体：pET-28a(+)；表达宿主：E. coli BL21(DE3)；基因合成：BGI Genomics
2.2 定点突变
对于四联假交替单胞菌κ-卡拉胶酶，D165被预测参与加速去糖基化步骤的酶促反应，E163和E168分别被预测为亲核试剂和酸/碱残基。使用PoPMuSiC 2.1算法工具分析四联假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的折叠自由能，根据预测结果和突变位点位置（远离活性位点），筛选出10个突变体：K34P、Q42V、E48D、I51H、Q60H、N63V、K70H、R151P、N206F和D217V。以含有野生型κ-卡拉胶酶基因的重组质粒为模板，使用Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2（Vazyme，中国南京）按照产品说明书进行定点突变。将突变引物和模板质粒加入各反应体系中进行PCR扩增，随后加入Dpn I消化模板。将环化试剂加入消化产物中，混合物在37°C孵育30分钟。环化产物转化至大肠杆菌DH5α细胞后，提取含有突变κ-卡拉胶酶基因的重组质粒进行测序确认。将这些突变体的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行突变酶的表达。
【数据】突变体：K34P、Q42V、E48D、I51H、Q60H、N63V、K70H、R151P、N206F、D217V；预测工具：PoPMuSiC 2.1；环化温度：37°C；时间：30min；宿主菌：E. coli DH5α、BL21(DE3)
2.3 κ-卡拉胶酶的序列与结构分析
使用DNAMAN 5.1程序（Lynnon BioSoft，加拿大魁北克）分析基因和蛋白质序列。以来自Pseudoalteromonas carrageenovora的κ-卡拉胶酶晶体结构（PDB ID: 5ocq.1.A）为模板，通过Swiss-Model同源建模构建四联假交替单胞菌κ-卡拉胶酶（WT）及其突变体的三维结构。基于Ramachandran图评估模型质量。使用AutoDock Vina 1.1.2进行κ-卡拉胶酶与κ-新卡拉四糖的分子对接。使用Ring-3.0在线服务器分析分子内相互作用，使用Ligplot在线服务器分析κ-卡拉胶酶与κ-新卡拉四糖之间的氢键和疏水相互作用。使用Discovery Studio 2019（BIOVIA，美国圣地亚哥）和PyMol分子图形系统（DeLano Scientific，美国圣卡洛斯）可视化和分析蛋白质结构。
【数据】模板：PDB ID 5ocq.1.A；建模工具：Swiss-Model；对接工具：AutoDock Vina 1.1.2；分析工具：Ring-3.0、Ligplot、Discovery Studio 2019、PyMol
2.4 分子动力学（MD）模拟
使用GROMACS 5.1.4程序对κ-卡拉胶酶及其突变体进行分子动力学模拟。模拟前添加氢键和GROMOS96 53A6力场，并将蛋白质调整为生理pH下的适当电离状态。模拟采用NVT（恒定粒子数、体积和温度）和NPT（恒定粒子数、压力和温度）系综。平衡后的系统在313 K、323 K和333 K下进行20 ns的分子动力学模拟。为研究MD模拟中结构的构象稳定性，使用GROMACS软件包的模块计算均方根偏差（RMSD）和均方根波动（RMSF）值。
【数据】软件：GROMACS 5.1.4；力场：GROMOS96 53A6；模拟温度：313K、323K、333K；模拟时间：20ns；分析指标：RMSD、RMSF
2.5 蛋白质表达与纯化
将大肠杆菌BL21(DE3)转化子接种于250 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C培养至OD600达到0.8，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.05 mM。16°C孵育18小时后，4°C下6000 × g离心15分钟收集细胞。重组蛋白在天然条件下使用Ni琼脂糖6 Fast Flow（GE Healthcare Life Sciences，瑞典乌普萨拉）亲和层析纯化，方法参照先前报道。洗脱液用50 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）透析。蛋白质浓度通过BCA法（Pierce，美国罗克福德）测定。蛋白质表达和纯化通过SDS-PAGE评估。
【数据】培养基：250mL LB；卡那霉素：50μg/mL；诱导剂：IPTG 0.05mM；诱导温度：16°C；诱导时间：18h；离心：6000×g，15min，4°C；纯化：Ni亲和层析；透析：50mM磷酸钠缓冲液pH 8.0；浓度测定：BCA法
2.6 酶活性测定
κ-卡拉胶酶活性采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定。反应体系包含10 µL酶溶液（0.04 mg/mL）和490 µL 5 mg/mL κ-卡拉胶（TEXOMES，西班牙加泰罗尼亚），溶剂为50 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）。50°C孵育15分钟后，加入500 µL DNS试剂终止反应，混合物煮沸10分钟。冷却至室温后，在520 nm处测定吸光度并计算酶活性。测量来自三个生物学重复。使用SPSS统计软件（版本26.0）通过单因素方差分析（ANOVA）评估三组数据之间的统计差异，P值<0.05被认为具有统计学意义。一个κ-卡拉胶酶活性单位定义为在测定条件下每分钟产生1 μmol半乳糖所需的酶量。
【数据】底物：5mg/mL κ-卡拉胶；酶浓度：0.04mg/mL；缓冲液：50mM磷酸钠pH 8.0；反应温度：50°C；时间：15min；检测波长：520nm；统计学：单因素ANOVA，P<0.05
2.7 酶学性质测定
温度对κ-卡拉胶酶活性的影响通过在30–60°C温度范围内测定酶活性来确定。热稳定性通过在不同温度（40–60°C）下处理40分钟后测定残余活性来评估。酶活性的半衰期（t₁/₂）通过在50°C孵育不同时间监测残余活性来确定。未经处理的酶活性定义为100%。pH对酶活性的影响使用不同pH值的50 mM缓冲液进行研究，包括醋酸缓冲液（pH 3.0–6.0）、磷酸钠缓冲液（pH 6.0–8.0）、Tris-HCl缓冲液（pH 8.0–9.0）和甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0–11.0）。突变对κ-卡拉胶酶在50°C催化活性的影响通过监测κ-卡拉胶酶反应在50°C不同时间（15–120分钟）产生的还原糖浓度来确定。酶动力学参数测定中，使用不同κ-卡拉胶浓度与纯化的κ-卡拉胶酶在50°C、pH 8.0下孵育15分钟。米氏常数（Kₘ）和最大反应速率（Vₘₐₓ）通过酶活性对不同κ-卡拉胶浓度的双倒数作图计算。
【数据】温度范围：30–60°C；热稳定性处理：40–60°C，40min；半衰期测定：50°C；pH范围：3.0–11.0；反应时间：15–120min
2.8 差示扫描量热（DSC）分析
使用DSC 3+（Mettler Toledo，瑞士苏黎世）测定κ-卡拉胶酶的熔融温度（Tₘ）值。仪器温度和焓使用纯铟金属（99.99%）校准。将样品（3.0 ± 0.1 mg）置于铝坩埚中，用盖子密封，以空坩埚为参比，从20°C升温至100°C，升温速率为1°C/min。整个过程在干燥N₂气氛下进行，吹扫气流量20 mL/min，保护气流量60 mL/min。
【数据】仪器：DSC 3+；样品量：3.0±0.1mg；升温范围：20–100°C；升温速率：1°C/min；气氛：干燥N₂，吹扫气20mL/min，保护气60mL/min
2.9 圆二色（CD）光谱分析
将纯化的κ-卡拉胶酶在水中透析后，控制κ-卡拉胶酶浓度为0.5 mg/mL。然后使用圆二色光谱仪（Applied Photophysics Ltd，英国莱瑟黑德）在25°C下分析酶样品。扫描范围180–260 nm，比色皿直径0.5 mm，步长1.0 nm。
【数据】酶浓度：0.5mg/mL；温度：25°C；扫描范围：180–260nm；比色皿：0.5mm；步长：1.0nm
2.10 荧光光谱分析
荧光光谱分析在原文中有描述，具体参数原文未详述。
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 Q42V和I51H在酶活性和热稳定性方面表现优异
蛋白质折叠自由能是蛋白质热稳定性的通用指标。本研究基于κ-卡拉胶酶的折叠自由能，使用PoPMuSiC算法工具筛选出十个突变体。蛋白质表达和纯化后，纯化的WT和突变κ-卡拉胶酶在SDS-PAGE上显示单一条带和相同的迁移率，分子量均为48.8 kDa（图1a）。κ-卡拉胶酶的蛋白质纯度满足后续实验条件的要求。
酶活性测定显示，与WT相比，K34P、E48D、Q60H、N63V、K70H、R151P、N206F和D217V突变对酶活性产生负面影响（图1b）。相比之下，Q42V和I51H突变使酶活性分别提高20.9%和25.4%（图1b）。与WT相比，Q42V和I51H突变体在40至60°C温度范围内有助于提高热稳定性。在50°C处理40分钟后，Q42V、I51H和WT的残余活性分别为40.6%、35.4%和9.5%（图1c）。Q42V、I51H和WT在40分钟热处理后失去50%酶活性的温度（T₅₀⁴⁰）分别为51.8°C、48.7°C和42.8°C。
为进一步提高κ-卡拉胶酶的热稳定性，将Q42V和I51H两个突变位点组合突变。然而，组合突变体Q42V-I51H并未显示出对酶稳定性的协同刺激效应（图1c）。类似的现象在(R)-转氨酶中也有报道。(R)-转氨酶大催化口袋周围的残基进行了组合突变，但单突变体F113T在活性和热稳定性方面表现出显著提升。因此，后续研究仅针对Q42V和I51H单突变体进行。
Q42V和I51H在50°C的半衰期（t₁/₂）值分别为20.6分钟和13.6分钟（图1d）。Tₘ是蛋白质在热变性过程中折叠态与去折叠态数量相等时的熔融温度，Tₘ值越高，蛋白质越稳定。为进一步评估野生型和突变κ-卡拉胶酶的热稳定性，使用DSC测定Tₘ值。结果显示，WT的Tₘ值为51.2°C，而Q42V和I51H分别提高到58.2°C和54.8°C（图1e）。
突变对κ-卡拉胶酶在50°C催化活性的影响通过监测κ-卡拉胶底物的持续降解来确定。在60–120分钟的反应时间内，突变体释放的还原糖高于WT，表明突变酶在50°C下具有更高的κ-卡拉胶水解效率（图1f）。反应2小时后，WT释放的还原糖达到0.20 mg/mL，而Q42V和I51H突变体分别达到更高的0.24 mg/mL和0.23 mg/mL（图1f）。
总之，Q42V和I51H突变增强了κ-卡拉胶酶的热稳定性和酶活性。由于酶的功能特性，κ-卡拉胶酶在工业中有着广泛的应用，包括生产具有生物活性的κ-卡拉胶寡糖、海藻原生质体的分离制备、卡拉胶精细结构解析以及海藻废弃物处理等。参照PoPMuSiC对折叠自由能变化的预测，向酶中引入点突变已被证明是提高酶热稳定性和活性的有效方法，该方法已成功用于修饰来自Pseudoalteromonas carrageenovora的芳基硫酸酯酶和来自枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶BsCsn46A。
【数据】WT分子量：48.8kDa；Q42V酶活性提升：+20.9%；I51H酶活性提升：+25.4%；50°C处理40min残余活性：Q42V 40.6%、I51H 35.4%、WT 9.5%；T₅₀⁴⁰：Q42V 51.8°C、I51H 48.7°C、WT 42.8°C；t₁/₂（50°C）：Q42V 20.6min、I51H 13.6min；Tₘ：WT 51.2°C、Q42V 58.2°C、I51H 54.8°C；2h还原糖产量：WT 0.20mg/mL、Q42V 0.24mg/mL、I51H 0.23mg/mL
3.2 Q42V和I51H的其他酶学性质
酶学表征显示，Q42V和I51H突变体对四联假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的最适温度和pH没有影响，分别为50°C和8.0。WT、Q42V和I51H的米氏底物亲和常数（Kₘ）分别为1.30、1.34和1.70 mg/mL。I51H的底物结合亲和力略低。此外，WT、Q42V和I51H的Vₘₐₓ值分别为64.52 U/mg、73.53 U/mg和84.03 U/mg。WT与突变κ-卡拉胶酶部分酶学性质的比较列于表2。这些结果揭示Q42V和I51H突变同时增强了κ-卡拉胶酶的热稳定性和酶活性，有利于其工业应用。
【数据】最适温度：50°C；最适pH：8.0；Kₘ：WT 1.30mg/mL、Q42V 1.34mg/mL、I51H 1.70mg/mL；Vₘₐₓ：WT 64.52U/mg、Q42V 73.53U/mg、I51H 84.03U/mg
3.3 κ-卡拉胶水解产物的LC-MS分析
负离子模式的质谱已被用于确定κ-卡拉胶降解产物的组成。本研究使用LC-MS分析κ-卡拉胶酶和HCl处理κ-卡拉胶的降解产物。LC分离水解产物显示，Q42V消化在0.87和1.10分钟出现两个主峰（图2a），I51H消化在0.83和1.17分钟出现两个主峰（图2b），HCl处理在0.62和0.75分钟出现两个主峰（图2c）。寡糖组分的结构通过ESI-MS分析确定，聚合度（DP）以质荷比表示。
403 m/z的峰归属于DP2（二糖）。394、709和811 m/z的峰对应DP4（四糖）。391、547和598 m/z的峰归属于DP6（六糖）。Q42V和I51H处理κ-卡拉胶产生了DP2、4和6的寡糖（图2a和b）。Q42V处理和I51H处理的κ-卡拉胶硫酸盐含量分别为19.1%和18.9%。HCl水解获得的κ-卡拉胶寡糖含有一系列奇数聚合度寡糖，包括单糖（m/z 259）和三糖（m/z 322和667）（图2c）。
一般来说，来自不同生物的κ-卡拉胶酶降解κ-卡拉胶产生不同的寡糖。来自南极Polaribacter sp. NJDZ03菌株的Car3206降解κ-卡拉胶仅产生二糖。来自Pedobacter hainanensis NJ-02的CgkA可以内切方式将κ-卡拉胶解聚为四糖和六糖。此外，不同方法制备的寡糖具有不同的化学结构，这是降解过程机制不同所致。具有高度有序二糖重复单元的半乳聚糖多糖的酸水解导致α-1,3键内部断裂，然后新生成的还原末端3,6-脱水-α-D-半乳糖不稳定，被立即移除，从而获得奇数聚合度寡糖。
【数据】LC主峰：Q42V 0.87/1.10min；I51H 0.83/1.17min；HCl 0.62/0.75min；DP2：m/z 403；DP4：m/z 394、709、811；DP6：m/z 391、547、598；硫酸盐含量：Q42V处理19.1%、I51H处理18.9%；奇数寡糖：单糖m/z 259、三糖m/z 322和667
3.4 Q42V处理和HCl处理的κ-卡拉胶的胰脂肪酶抑制活性
抑制胰脂肪酶活性是预防肥胖的重要策略之一。本研究评估并比较了Q42V处理和HCl处理的κ-卡拉胶的胰脂肪酶抑制活性。与未处理的κ-卡拉胶相比，酶解和酸解产物表现出显著增强的胰脂肪酶抑制活性（图2d）。此外，在产物浓度范围6.0–10.0 mg/mL内，Q42V酶解产物对胰脂肪酶的抑制活性高于酸解产物（图2d）。Q42V和HCl降解产物对胰脂肪酶的半数抑制浓度（IC₅₀）值分别为6.5 mg/mL和9.4 mg/mL（图2d）。奥利司他对胰脂肪酶的IC₅₀值为0.3 mg/mL（图2e）。总之，κ-卡拉胶的酶法处理赋予了水解产物更好的胰脂肪酶抑制活性。
【数据】IC₅₀：Q42V降解产物6.5mg/mL、HCl降解产物9.4mg/mL、奥利司他0.3mg/mL；有效浓度范围：6.0–10.0mg/mL
3.5 突变体的结构分析
为阐明Q42V和I51H突变增强酶活性和热稳定性的分子机制，进行了圆二色光谱、荧光光谱、分子对接和分子动力学分析。CD光谱分析显示WT和突变体之间二级结构无明显变化。荧光光谱分析用于检测突变对蛋白质三级结构的影响。分子对接分析表明，Q42V突变在酶-底物复合物中引入了额外的pi-sigma作用力，而I51H突变引入了额外的疏水相互作用，这些新增的相互作用力分别解释了Q42V和I51H催化活性的提高。分子动力学分析表明，突变体Q42V和I51H热稳定性的提高可归因于高温下较小的结构偏差和酶构象的柔性变化。
【数据】CD光谱：WT与突变体无明显差异；分子对接：Q42V新增pi-sigma作用力、I51H新增疏水相互作用
讨论与解读
本研究通过PoPMuSiC算法获得了两个酶催化活性和热稳定性均提高的κ-卡拉胶酶突变体Q42V和I51H。结构偏差减小、高温下残基构象转换的灵活性以及酶-底物复合物中相互作用的增强，共同解释了突变体热稳定性和酶活性的提高。据作者所知，这是首次报道Q42V和I51H替换能显著提升四联假交替单胞菌κ-卡拉胶酶酶学性能的研究。该工作为其他κ-卡拉胶酶的分子工程改造以同时提高热稳定性和酶活性提供了重要线索。突变体Q42V和I51H改善的酶活性和热稳定性使其成为制备生物功能性κ-卡拉胶寡糖的工业应用中有前景的工具酶。
编译者解读：该研究展示了计算驱动酶工程在海洋多糖降解酶改造中的实用价值——仅两个单点突变就同时改善了两个往往此消彼长的性状（活性和稳定性），且突变位点远离活性中心，体现了PoPMuSiC算法在预测远程调控效应方面的优势。Q42V酶解产物对胰脂肪酶抑制活性优于酸解产物且IC₅₀达6.5 mg/mL，对肥胖干预型功能性食品开发具有潜在意义。局限在于组合突变未产生协同效应，且分子动力学模拟仅20 ns，对长期构象演化的捕捉有限。未来若能在中试规模验证该突变体的实际产酶效率与底物转化率，将更有说服力。
参考来源
Hong T. Simultaneous enhancement of thermostability and catalytic activity of κ-carrageenase from Pseudoalteromonas tetraodonis by rational design. Enzyme and Microbial Technology, 2023. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2023.110241
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2023.110241