来源：Improving the thermostability of a novel PL-6 family alginate lyase by rational design engineering for industrial preparation of alginate oligosaccharides（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
褐藻胶裂解酶可降解褐藻胶生成具有多种生物活性的褐藻胶寡糖，但酶的热稳定性不足限制了其工业应用。本研究从海洋细菌Rhodothermus marinus 4252中鉴定了一个新型PL-6家族褐藻胶裂解酶AlyRm6A，通过整合FireProt自动设计、多工具计算机辅助ΔΔGfold值计算及突变位点保守性分析的综合策略，获得两个不影响酶活但显著提升热稳定性的单点突变体T43I和Q216I。突变体半衰期从3.68 h分别延长至4.29 h和4.54 h，熔点温度从61.5 °C分别提升至62.9 °C和63.5 °C，为目前已表征PL-6褐藻胶裂解酶中热稳定性最高的变体。
研究背景
褐藻胶是一种天然存在于某些海藻（如Ascophyllum nodosum、Macrocystis pyrifera、Laminaria hyperborea）及细菌菌株（如Azotobacter和Pseudomonas）细胞壁中的负电荷多糖。商业褐藻胶主要从褐藻生物质中提取。该生物聚合物由α-1,4-L-古洛糖醛酸（G）和1,4-连接的β-D-甘露糖醛酸（M）残基的线性链组成，可形成均匀（poly-G、poly-M）或混合（MG）嵌段模式。褐藻胶裂解酶催化β-消除反应断裂褐藻胶的1,4-糖苷键，生成不饱和褐藻胶寡糖（AOSs）。AOSs具有多种生物学活性，在益生元、营养补充剂和植物生长发育调控方面有重要应用。不同聚合度的寡糖已被证明具有多种功效。褐藻胶和AOSs在食品工业中用作稳定剂、配方助剂、乳化剂和增稠剂等，制药工业也常用褐藻胶及其衍生物作为崩解剂改性剂。然而，酶的热稳定性限制了其工业应用，开发热稳定性更高的褐藻胶裂解酶变体是推动工业化应用的关键路径。
研究方法
2.1 材料
来源于Macrosystis pyrifera的褐藻酸钠（M/G比为77/23）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。分子量超过5 kDa的聚甘露糖醛酸（poly M）由Carbosynth US LLC（加利福尼亚州圣地亚哥）提供。分子量超过5 kDa的聚古洛糖醛酸（poly G）以及β-D-甘露糖醛酸寡糖（聚合度2–5，纯度约98%）和α-L-古洛糖醛酸寡糖（聚合度2–5，纯度约98%）由青岛BZ Oligo Biotech有限公司（中国青岛）提供。T4 DNA连接酶缓冲液（10×）和T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher Scientific（美国）。所有突变体均通过基因合成获得（南京擎科生物技术有限公司，中国）。
【数据】褐藻酸钠M/G比：77/23；poly M分子量：>5 kDa；poly G分子量：>5 kDa；寡糖聚合度：2–5；寡糖纯度：约98%
2.2 AlyRm6A的序列分析
首先，使用NCBI BLAST预测AlyRm6A基因序列（Genebank ID WP_012843667.1）的功能。利用NCBI上的保守域研究工具进行保守域分析（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。使用Clustal X软件进行多序列比对，并使用ESPript 3.0进行在线分析（http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）。使用MEGA 7.0软件构建系统发育树。使用ExPASy ProtParam在线分析工具检查AlyRm6A氨基酸序列的各项参数，如分子量、等电点、氨基酸组成、脂肪族指数和GRAVY值（https://web.expasy.org/protparam/）。此外，使用SignalP 5.0服务器预测蛋白序列的信号肽（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）。
【数据】Genebank ID：WP_012843667.1；分析工具：NCBI BLAST、Conserved Domain Research、Clustal X、ESPript 3.0、MEGA 7.0、ExPASy ProtParam、SignalP 5.0
2.3 结构建模与突变体文库构建
我们使用SWISS-MODEL在线工作区生成AlyRm6A的三维（3D）结构，以来源于G. chathamensis S18K6T的AlyGC（PDB ID: 5GKQ）为模板，因其序列相似性为42.05%。使用SWISS-MODEL的全局模型质量评估（GMQE）和定性模型能量分析（QMEAN）工具评估所构建模型的质量[19]。我们还利用AlphaFold2 Colab程序以及其他方法预测该酶的3D结构。使用SAVES v6.0评分程序（https://saves.mbi.ucla.edu）评估所获得的模型。随后，我们将WT AlyRm6A的模型提交至FireProt web服务器，使用默认参数预测和设计热稳定突变体。为确定最优突变位点，我们将FireProt计算结果与PremPS（https://lilab.jysw.suda.edu.cn/research/PremPS/）[20]、DynaMut（https://biosig.lab.uq.edu.au/dynamut/）[21]、MAESTROweb（https://pbwww.services.came.sbg.ac.at/maestro/web）[22]和SDM2（http://marid.bioc.cam.ac.uk/sdm2）[23]的分析相结合，综合各计算方法的优势进行筛选。
【数据】建模模板：AlyGC（PDB ID: 5GKQ）；序列相似性：42.05%；工具：SWISS-MODEL、AlphaFold2、SAVES v6.0、FireProt、PremPS、DynaMut、MAESTROweb、SDM2
2.4 WT AlyRm6A及其突变体的蛋白表达与纯化
AlyRm6A的突变体通过基因合成产生并克隆至pET21a载体。使用E. coli BL21（DE3）细胞表达重组WT AlyRm6A及其突变体。首先，将细胞接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中，37 °C过夜培养。然后将过夜培养物转移至含100 μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37 °C、200 rpm振荡培养。当OD600值达到0.8–1.0时，加入1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，16 °C孵育12 h。孵育后，4000 ×g离心15 min收集细胞，超声破碎裂解。随后，裂解液11000 ×g离心1 h，将上清液上样至HisTrap亲和柱。通过咪唑梯度洗脱纯化重组蛋白，SDS-PAGE展示各组分。使用Bradford法测定纯化蛋白的浓度。
【数据】载体：pET21a；宿主菌：E. coli BL21（DE3）；氨苄青霉素浓度：100 μg/mL；培养温度：37 °C；振荡转速：200 rpm；诱导OD600：0.8–1.0；IPTG浓度：1 mM；诱导温度：16 °C；诱导时间：12 h；离心：4000 ×g 15 min；裂解后离心：11000 ×g 1 h；纯化方法：HisTrap亲和柱+咪唑梯度洗脱；蛋白定量：Bradford法
2.5 WT AlyRm6A及其突变体的酶活测定
为测试AlyRm6A的活性，将4 μM酶与1.5%（w/v）褐藻酸钠在200 μL 20 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中、50 °C孵育10 min。用沸水浴5 min终止反应，使用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法评估酶活性。酶活性定义为一个单位（U），对应每分钟释放1 μmol还原糖所需的酶量[24]。酶活性值以三次重复的平均值±标准差表示。
【数据】酶浓度：4 μM；底物：1.5%（w/v）褐藻酸钠；缓冲液：20 mM磷酸钠（pH 7.0）；温度：50 °C；时间：10 min；终止方式：沸水浴5 min；检测方法：DNS法
2.6 WT AlyRm6A及其突变体的热稳定性测定
我们测量了30 °C至90 °C不同温度下的酶活性以确定最适反应温度。pH测试范围为4.0至10.0，使用20 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.0–6.0）、20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0–8.0）和20 mM甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 8.0–10.0）[25]。为评估酶的热稳定性，将酶在30 °C至90 °C温度范围内暴露1 h，然后在最适反应条件下测试其酶活性。热失活半衰期（t1/2）的测定程序如下：酶在50 °C孵育，在不同时间间隔测量残留活性。残留活性降至酶原始活性50%的时间点被确定为其半衰期。使用Origin软件分析所得数据以计算t1/2值。未经处理的酶活性视为100%，不同时间间隔的活性以相对于未处理酶活性的相对值（%）表示[26]。使用差示扫描量热仪（DSC，Perkin Elmer Corp.，美国）分析WT AlyRm6A及其突变体的熔点温度（Tm）。简言之，将纯化的酶装入样品池，磷酸钠缓冲液（pH 7.0）装入参比池。新鲜纯化的酶溶液稀释至1 mg/mL浓度。仪器设定温度扫描范围为4–70 °C，压力3 atm，升温速率1 °C/min。实验数据使用Origin软件处理。
【数据】温度范围：30–90 °C；pH范围：4.0–10.0；缓冲液：20 mM醋酸钠（pH 4.0–6.0）、20 mM磷酸钠（pH 6.0–8.0）、20 mM甘氨酸-NaOH（pH 8.0–10.0）；热稳定性处理：30–90 °C、1 h；半衰期测定温度：50 °C；DSC蛋白浓度：1 mg/mL；DSC扫描范围：4–70 °C；压力：3 atm；升温速率：1 °C/min
2.7 WT AlyRm6A及其突变体的降解产物分析
不同底物包括褐藻酸钠、poly M和poly G分别与4 μM纯化酶在最适条件下孵育48 h。为终止反应，将混合物煮沸5 min，10000 ×g离心5 min收集上清液。使用高效液相色谱（HPLC）分析酶降解产物的组成，AOSs通过PL aquagel-OH 20尺寸排阻柱（7.5 × 300 mm）和示差折光检测器（RID）分离。柱温维持30 °C，以0.02 M NaH2PO4为流动相，流速0.2 mL/min。
【数据】酶浓度：4 μM；孵育时间：48 h；终止方式：煮沸5 min；离心：10000 ×g 5 min；色谱柱：PL aquagel-OH 20（7.5 × 300 mm）；检测器：RID；柱温：30 °C；流动相：0.02 M NaH2PO4；流速：0.2 mL/min
2.8 WT AlyRm6A及其突变体的圆二色谱和疏水性分析
为确定蛋白的二级结构，使用Chirascan CD光谱仪（Spectrophotometer Co.，Ltd.，日本）采集CD光谱。酶溶液经纯化和脱盐至0.4 mg/mL浓度。CD测量在25 °C下进行，使用光程1 nm的石英比色皿，波长范围190–260 nm，间隔1 nm。数据经校正以消除20 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）的缓冲液贡献。使用在线软件工具ProtScale（http://www.expasy.org/tools/protscale.html）进行疏水性分析，同时分析WT和突变体序列。
【数据】蛋白浓度：0.4 mg/mL；测量温度：25 °C；光程：1 nm；波长范围：190–260 nm；间隔：1 nm；缓冲液：20 mM磷酸钠（pH 7.0）；分析工具：ProtScale
2.9 分子内相互作用分析
（原文节选未完整提供2.9节内容，以下按原文可用信息翻译）
突变残基的分子内相互作用通过PyMOL软件进行分析。WT和突变体中突变残基以棍状模式表示并着色为青色。相互作用类型按以下颜色编码：红色表示氢键，橙色表示弱氢键，绿色表示疏水接触。分子动力学（MD）模拟在310 K下进行，分析RMSD、RMSF、SASA、Rg值及内部氢键数量等参数。
【数据】MD模拟温度：310 K；分析参数：RMSD、RMSF、SASA、Rg值、内部氢键数量；可视化工具：PyMOL
研究结果
3.1 基因与蛋白序列分析
AlyRm6A的基因编码一个由581个氨基酸组成的蛋白，长度为1746 bp。该蛋白等电点为6.23，分子量约为63.88 kDa，稳定性指数为37.96。使用SignalP 5.0分析在AlyRm6A的N端鉴定出一个20个氨基酸的信号肽（图1A）。NCBI上的保守域分析显示AlyRm6A具有一个PL-6家族结构域（Val25-Lys397）和一个C端FlgD Ig样结构域（Phe505-Thr566）。基于包含PL6不同亚家族褐藻胶裂解酶的系统发育树，AlyRm6A被分类为亚家族1（图1B）。保守域研究和多序列比对鉴定出Lys240和Arg261为潜在的关键催化残基，而Asn201、Glu233和Glu235被鉴定为钙结合位点。这些残基在所有已表征的PL-6褐藻胶裂解酶中高度保守（图1C）。AlyRm6A是一种新型褐藻胶裂解酶，与已表征的PL-6褐藻胶裂解酶中来自G. chathamensis S18K6T的poly G特异性褐藻胶裂解酶AlyGC具有最高的序列一致性（42.05%）[26]。
【数据】蛋白长度：581个氨基酸；基因长度：1746 bp；等电点：6.23；分子量：约63.88 kDa；稳定性指数：37.96；信号肽长度：20个氨基酸；PL-6家族结构域：Val25-Lys397；FlgD Ig样结构域：Phe505-Thr566；催化残基：Lys240、Arg261；钙结合位点：Asn201、Glu233、Glu235；与AlyGC序列一致性：42.05%
3.2 AlyRm6A的结构建模
蛋白的构象与其在高温下的稳定性相关。为确定AlyRm6A的3D结构，我们利用SWISS-MODEL在线工作区进行结构比对，获得了AlyRm6A的同源模型（图2A）。为评估该模型的可靠性，我们使用了GMQE和QMEAN评分作为模型质量的度量。我们模型的GMQE和QMEAN值分别为0.58和−1.17，处于可靠模型范围内。此外，为更好地基于氨基酸序列预测AlyRm6A的结构，我们采用了AlphaFold2——一种由DeepMind创建的机器学习技术。基于AlphaFold2预测，在AlyRm6A中鉴定出两个结构域：PL-6超家族和FlgD_Ig样结构域（图2B）。使用SAVES v6.0（https://saves.mbi.ucla.edu）进行Ramachandran分析以评估预测结构的准确性（图2C、D）。超过90%残基位于最favored区域的模型被认为是高质量的，而可靠模型应超过80%。本研究中的预测结构满足这些标准，表明其准确性。图2C和D表明，同源模型有87.00%的残基位于最favored区域，而AlphaFold2预测模型有86.71%的残基位于同一区域。尽管最favored区域残基百分比存在微小差异，AlphaFold2产生了比另一种模型更全面的分子模型。例如，AlphaFold2具有SWISS-MODEL中未呈现的结构组分，如信号肽和FlgD_Iglike结构域，且AlphaFold2预测的模型具有更高的准确性。两种模型均可信赖用于进一步分析，但由于AlphaFold2预测结构具有更优的质量和全面性，我们选择其作为AlyRm6A的结构。
【数据】GMQE值：0.58；QMEAN值：−1.17；同源模型最favored区域残基：87.00%；AlphaFold2模型最favored区域残基：86.71%
3.3 潜在热稳定突变体的理性设计
为在保持AlyRm6A催化活性的同时增强其热稳定性，采用了理性蛋白设计方法。将蛋白的3D模型提交至FireProt服务器，该服务器利用基于能量和进化的技术预测稳定化突变。服务器分别通过基于能量和基于进化的方法产生了10个和24个潜在稳定化突变，这些突变记录在表S1和S2中。通过计算折叠自由能（ΔG）评估这些突变对蛋白热力学稳定性的影响。为评估突变对蛋白的影响，使用四个web服务器预测WT及其突变体折叠自由能的变化。FireProt是一个自动化设计热稳定蛋白开发过程的在线平台。通过使用PremPS、DynaMut、MAESTROweb和SDM2分析FireProt获得的结果，确定了最有前景的突变位点（表1）。为确保所选突变位点的保守性，将WT蛋白的PDB文件提交至Consurf服务器（https://consurf.tau.ac.il/），使用多序列比对评估蛋白保守性。生成了PyMOL图像，本研究中鉴定的所有八个突变位点均具有平均保守水平，表明其适合后续实验（图3A）。大多数氨基酸残基位于蛋白结构表面，可能通过新机制影响热稳定性。突变位点的空间方向如图3B所示。我们使用FireProt自动设计AlyRm6A的耐热突变体，获得34个突变体，数量庞大且验证非常困难。因此，我们使用四种方法评估突变体热力学稳定性的折叠自由能，获得八个突变点。我们移除了26个突变点，这进一步减少了工作量，但存在移除有益突变点的风险，这是由不同筛选服务器造成的。因此，未来如何加强计算机辅助验证的准确性需要更多研究。
【数据】FireProt能量法预测突变数：10个；FireProt进化法预测突变数：24个；筛选工具：PremPS、DynaMut、MAESTROweb、SDM2；最终选择突变位点数：8个；保守性评估工具：Consurf服务器
3.4 WT及其突变体的生化表征
根据FireProt web服务器的反馈，我们采用基因合成方式生成AlyRm6A的突变体，随后在E. coli BL21（DE3）中表达。WT AlyRm6A及其单点突变体的分子量相当，如图4A所示。为评估单点突变体相对于WT的热稳定性，我们将所有纯化蛋白在不同温度（30 °C–90 °C）下孵育1 h。结果表明，八个单点突变体中有两个——T43I和Q216I——表现出优于WT的热稳定性（图4B）。随后我们合成了T43I和Q216I的组合突变体并成功表达（图4A）。然而，T43I和Q216I之间没有协同效应，组合突变体未表现出优于WT的热稳定性。尽管T43I和Q216I单突变提高了热稳定性，但双突变未显示协同效应，其热稳定性与野生型相似，这可能是由长程非加性引起的。非加性通常与两个空间位阻残基的接触或短程空间相互作用相关，表现为协同效应或加性效应[29]。研究人员证明了葡萄球菌核酸酶稳定突变对之间的非加性模式，提供了三个在序列上相距较远但在天然结构中相对接近的位点表现出显著程度非加性的证据[30]。大量研究案例观察到非加性。例如，单突变体Asp12Ala的相互作用能为0.43 kcal/mol，单突变体Thr16Arg为−0.48 kcal/mol，但双突变体Asp12Ala/Thr16Arg为0.28 kcal/mol[31]。所得结果通过直接静电相互作用解释。随后，同一研究小组通过研究barnase及其胞内抑制剂barstar的双突变体循环来研究蛋白-蛋白相互作用[32]。发现两个残基之间的耦合能随它们之间距离的增加而降低，在小于7 Å的距离处观察到最大协同性[33]。在本研究中，两个单点突变相隔172个氨基酸，根据PyMOL建模分析，T43的α碳原子与Q216的α碳原子之间的距离为37.3 Å，远高于7 Å。两个氨基酸残基之间的距离过大，导致两个残基之间几乎没有或没有能量耦合。
【数据】热稳定性筛选温度范围：30–90 °C；孵育时间：1 h；有利突变体：T43I、Q216I；T43与Q216相隔氨基酸数：172个；T43α碳与Q216α碳距离：37.3 Å
3.5 最适温度和pH及半衰期测定
（原文节选未完整提供3.5节内容，按原文可用信息翻译）
测定了AlyRm6A、T43I和Q216I的最适温度和最适pH。同时测定了三者的半衰期t1/2值。
【数据】最适温度、最适pH、t1/2值详见原文图5
3.6 降解产物分析
使用HPLC分析了WT、T43I和Q216I对褐藻酸钠、poly M和poly G的最终降解产物。橙色线代表无酶的底物，黑色、蓝色和红色线分别代表WT、T43I和Q216I的最终产物。
【数据】底物：褐藻酸钠、poly M、poly G；分析时间：48 h；检测方法：HPLC-RID
3.7 圆二色谱和疏水性分析
WT和突变体的CD光谱如图7A所示。β-折叠特征峰（196和216 nm）的位置用虚线标出。两种突变体和野生型均在195 nm和216 nm处具有β-折叠的特征峰，表明突变对蛋白的二级结构没有显著影响。使用在线软件ProtScale对WT和突变体进行疏水性分析。黑线代表WT，蓝线代表T43I，红线代表Q216I。
【数据】CD特征峰：195 nm和216 nm（β-折叠）；分析工具：ProtScale
3.8 分子内相互作用分析
WT AlyRm6A（A、B）和突变体（C、D）中突变残基的分子内相互作用如图8所示。突变残基以棍状模式表示并着色为青色。相互作用类型按以下颜色编码：红色表示氢键，橙色表示弱氢键，绿色表示疏水接触。
【数据】相互作用类型：氢键（红色）、弱氢键（橙色）、疏水接触（绿色）
3.9 分子动力学模拟分析
在310 K下对WT及其突变体进行了MD模拟分析：（A）RMSD，（B）RMSF，（C）SASA，（D）Rg值，（E）内部氢键数量。黑线代表WT，蓝线代表T43I，红线代表Q216I。MD模拟分析表明，疏水相互作用网络的增强、分子刚性的提高和更致密的结构可能提高了AlyRm6A的稳定性。
【数据】MD模拟温度：310 K；分析参数：RMSD、RMSF、SASA、Rg值、内部氢键数量
3.10 热稳定性参数汇总
与WT相比，T43I和Q216I保持了原有的酶活性，其半衰期从3.68 h分别延长至4.29 h和4.54 h，熔点温度从61.5 °C分别提升至62.9 °C和63.5 °C。据我们所知，AlyRm6A突变体在已表征的PL-6褐藻胶裂解酶中表现出最高的热稳定性，使其成为褐藻胶寡糖工业化生产的潜在候选者。
【数据】WT半衰期：3.68 h；T43I半衰期：4.29 h；Q216I半衰期：4.54 h；WT熔点温度：61.5 °C；T43I熔点温度：62.9 °C；Q216I熔点温度：63.5 °C
讨论与解读
本研究鉴定了一个属于PL-6家族的新型褐藻胶裂解酶AlyRm6A，其最适反应条件为50 °C和pH 7.0，并研究了其工业应用潜力。研究提出了一种高效的综合策略，鉴定出两个有益的单点突变T43I和Q216I。然而，计算机辅助筛选突变体文库的准确性仍需进一步研究。结构基础和MD分析表明，通过加强疏水相互作用网络、提高分子刚性和更致密的结构可以提高AlyRm6A的稳定性。据我们所知，AlyRm6A突变体在已表征的PL6褐藻胶裂解酶中获得了最高的热稳定性。这些发现为未来AlyRm6A的工业规模改造及其在褐藻胶寡糖生产中的应用奠定了基础。
编译者解读：本研究在酶工程策略上具有示范意义——将FireProt自动设计与多工具交叉验证相结合，在34个候选突变中筛选出8个位点，最终锁定两个既保持活性又显著提升热稳定性的单点突变。这种"计算机预筛+实验验证"的路径有效降低了湿实验筛选成本。值得注意的是，T43I与Q216I组合后未产生协同效应，提示长程非加性效应是理性设计中不可忽视的变量。从合成生物学应用角度看，AlyRm6A突变体在已表征PL-6褐藻胶裂解酶中热稳定性最高，但半衰期4.54 h（50 °C）对大规模工业催化而言仍有提升空间，未来可结合固定化技术或定向进化策略进一步优化。
参考来源
Guo Q. Improving the thermostability of a novel PL-6 family alginate lyase by rational design engineering for industrial preparation of alginate oligosaccharides. International Journal of Biological Macromolecules, 2023. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2023.125998
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2023.125998