来源：Enhancing thermostability of alkaline κ-carrageenase from Pseudoalteromonas tetraodonis by rational design of disulfide bonds（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
κ-卡拉胶酶工业应用受限于其较差的热稳定性。本研究基于Pseudoalteromonas tetraodonis碱性κ-卡拉胶酶的结构信息，借助Disulfide by Design2计算工具，设计出两个二硫键突变体K44C-A119C和T120C-Q250C。突变体酶活性分别提高19.0%和7.3%，50°C处理30分钟后残余活性从野生型的45.4%提升至80.1%和78.6%。分子动力学模拟揭示突变体热稳定性与催化活性改善的结构基础，为κ-卡拉胶酶工业应用提供了实用策略。
研究背景
κ-卡拉胶是从海洋红藻中提取的阴离子聚合物，由β-D-半乳糖-4-硫酸和3,6-脱水-α-D-半乳糖通过α-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成。凭借优异的凝胶和增稠等理化性质，κ-卡拉胶在食品和制药行业应用广泛，并展现出抗病毒、抗肿瘤等药理活性。然而，κ-卡拉胶高粘度和高分子量限制了其生物利用度。将聚合物降解为κ-卡拉胶寡糖可改善其生物活性，在医药、食品、农业和化妆品领域具有巨大应用潜力。相较于物理和化学方法，κ-卡拉胶酶（EC 3.2.1.83）的内切降解策略更具吸引力。κ-卡拉胶溶液在40°C以下粘度高，温度升高则粘度降低；高温促进多糖构象变化，使其更易被酶构象识别和降解。但κ-卡拉胶酶自身热稳定性差，制约了其工业应用。本研究旨在通过理性设计二硫键提高κ-卡拉胶酶的热稳定性。
研究方法
2.1 κ-卡拉胶酶结构分析
P. tetraodonis κ-卡拉胶酶及其突变体的三级结构通过在线AlphaFold2系统预测。所获酶结构经PROCHECK和VERIFY 3D在线工具评估（https://saves.mbi.ucla.edu/）。蛋白质结构使用PyMOL可视化。κ-卡拉胶酶结构内的非共价相互作用通过Ring-3.0在线服务器分析。
【数据】预测工具：AlphaFold2；评估工具：PROCHECK、VERIFY 3D；可视化：PyMOL；相互作用分析：Ring-3.0
2.2 P. tetraodonis κ-卡拉胶酶二硫键计算设计
应用DbD2工具预测适合替换为半胱氨酸以形成额外二硫桥的候选残基对，计算条件为键能（χ3角）约+97（±20）。排除二硫键位于距P. tetraodonis κ-卡拉胶酶预测催化三联体（E163-D165-E168）9 Å范围内的突变候选。优先选择蛋白质表面的潜在二硫键——因为蛋白质热变性始于蛋白质表面——并舍弃可能埋藏的潜在二硫键。此外，使用B-factor值评估蛋白质结构中高柔性区域。基于这些参数，选择六个具有一对半胱氨酸点突变的突变体（K44C-A119C、R45C-T293C、K52C-V76C、T120C-Q250C、S147C-R249C和L153C-D158C）进行后续研究。
【数据】χ3角：+97（±20）；排除距离：距催化三联体9 Å内；候选突变体：6个
2.3 蛋白质表达与纯化
合成P. tetraodonis野生型κ-卡拉胶酶编码区并克隆至pET-28a(+)载体（Novagen，麦迪逊，WI，美国）。使用Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2（Vazyme，南京，中国）引入突变，生成突变κ-卡拉胶酶基因。将pET-28a(+)载体中的κ-卡拉胶酶基因构建体转化至E. coli BL21(DE3)进行酶表达，用0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG；Solarbio Science & Technology，北京，中国）在15°C诱导18小时。重组蛋白用Ni Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare Life Sciences，乌普萨拉，瑞典）按前述方法纯化。透析至50 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）后，蛋白洗脱液经SDS-PAGE检测。蛋白浓度用二喹啉甲酸（BCA）检测试剂盒（Pierce，罗克福德，IL，美国）定量。
【数据】载体：pET-28a(+)；诱导剂：0.1 mM IPTG；温度：15°C；时间：18h；纯化：Ni Sepharose 6 Fast Flow；透析缓冲液：50 mM磷酸钠（pH 8.0）；定量：BCA试剂盒
2.4 κ-卡拉胶酶活性测定
采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法按前述实验流程测定κ-卡拉胶酶活性。反应体系为10 µL酶溶液（0.04 mg/mL）和490 µL 5 mg/mL κ-卡拉胶（TEXOMES，加泰罗尼亚，西班牙），溶于50 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0），在50°C反应15分钟。测定设三个生物学重复。在该测定条件下，一个κ-卡拉胶酶活性单位定义为每分钟产生1 μmol半乳糖所需的酶量。
【数据】酶浓度：0.04 mg/mL；底物：5 mg/mL κ-卡拉胶；缓冲液：50 mM磷酸钠（pH 8.0）；温度：50°C；时间：15min；重复：3个生物学重复；酶活单位定义：每分钟产生1 μmol半乳糖
2.5 生化性质与动力学参数测定
检测κ-卡拉胶酶在不同温度（40–60°C）和不同pH（pH 3.0–11.0）下的酶活性，确定其最适温度和pH。将κ-卡拉胶酶在不同温度（40–60°C）下暴露30分钟后量化残余活性，评估其热稳定性。上述测定均记录相对活性。将不同浓度的κ-卡拉胶与纯化酶在50°C、pH 8.0孵育15分钟后，用Origin 2023b软件非线性曲线拟合计算κ-卡拉胶酶的米氏常数（K m）、最大酶促反应速率（V max）和转换数（k cat）。
【数据】温度范围：40–60°C；pH范围：3.0–11.0；热稳定性处理时间：30min；动力学测定条件：50°C、pH 8.0、15min；拟合软件：Origin 2023b
2.6 差示扫描量热（DSC）分析
用DSC 3+（Mettler Toledo，苏黎世，瑞士）测定κ-卡拉胶酶熔融温度（T m），仪器预先用纯铟金属（99.99%）校准。酶样品（3.0 mg）以1°C/min从20°C加热至100°C，置于密封铝坩埚中，以空坩埚作参比。
【数据】仪器：DSC 3+；校准：纯铟（99.99%）；样品量：3.0 mg；升温范围：20–100°C；升温速率：1°C/min
2.7 圆二色（CD）光谱分析
纯化κ-卡拉胶酶透析至水后调整至0.3 mg/mL，用CD光谱偏振仪（Applied Photophysics Ltd.，莱瑟黑德，英国）获取180至260 nm的CD光谱。CD光谱曲线为三次扫描的平均值，步长分辨率1 nm，扫描速率30 nm/min。CD数据以平均残基椭圆率[θ]表示。
【数据】样品浓度：0.3 mg/mL；波长范围：180–260 nm；扫描次数：3次；步长：1 nm；扫描速率：30 nm/min
2.8 荧光光谱与表面疏水性分析
WT和突变κ-卡拉胶酶（0.3 mg/mL，50 mM磷酸钠缓冲液，pH 8.0）的内源荧光光谱用荧光分光光度计（Agilent Technologies，帕洛阿尔托，CA，美国）测定。酶表面疏水性用荧光探针8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS；Tokyo Chemical Industry，东京，日本）按所述方法测定。光谱分析用荧光分光光度计（Agilent Technologies，帕洛阿尔托，CA，美国）进行。激发波长317 nm，记录330 nm至500 nm发射光谱。样品池光学直径1 cm。测定温度25°C。激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5 nm，处理数据为三次测量的平均值。
【数据】样品浓度：0.3 mg/mL；缓冲液：50 mM磷酸钠（pH 8.0）；激发波长：317 nm；发射光谱范围：330–500 nm；光径：1 cm；温度：25°C；狭缝宽度：激发5 nm/发射5 nm；测量次数：3次
2.9 分子对接与分子动力学（MD）模拟
κ-卡拉胶酶与其底物κ-新卡拉四糖的分子对接由AutoDock Vina 1.2.0完成。Discovery Studio 2019（BIOVIA，圣地亚哥，CA，美国）和LigPlot+程序（https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/）用于分析二维图上的蛋白质-配体相互作用。GROMACS 5.1.4程序用于分子动力学模拟，采用GROMOS96 54a7力场和SPC水模型。加入足量Na+中和体系负电荷。整个体系最小化5000步，逐渐加热至323 K，然后在恒温恒压下平衡10 ps。最后在恒容恒温（323 K）下进行50 ns蛋白质MD模拟。基于MD轨迹用最小二乘拟合计算蛋白质骨架原子的均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）和回转半径（Rg）。MD模拟后用AMBER99SB-ILDN力场和Tip3p水模型进行κ-卡拉胶酶催化通道分析。催化通道体积用fpocket软件计算。
【数据】对接工具：AutoDock Vina 1.2.0；MD软件：GROMACS 5.1.4；力场：GROMOS96 54a7；水模型：SPC；最小化步数：5000步；模拟温度：323 K；平衡时间：10 ps；MD模拟时间：50 ns；催化通道力场：AMBER99SB-ILDN；水模型：Tip3p；通道体积计算：fpocket
2.10 酶解产物的制备与测定
κ-卡拉胶底物（15 mL，5.0 mg/mL）用4.0 U κ-卡拉胶酶在50°C、pH 8.0消化3小时释放寡糖。100°C加热10分钟终止反应后，混合物用两倍体积乙醇沉淀，4°C过夜去除未降解κ-卡拉胶。离心收集上清液，用Labconco FreeZone 6 plus（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，MA，美国）冻干。消化产物用液相色谱（LC）联用质谱（MS）系统TSQ Altis Triple Quadrupole（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，MA，美国）在负离子模式下分析。
【数据】底物体积：15 mL；底物浓度：5.0 mg/mL；酶量：4.0 U；温度：50°C；pH：8.0；酶解时间：3h；灭活：100°C、10min；沉淀：2倍体积乙醇、4°C过夜；分析：LC-MS（TSQ Altis Triple Quadrupole），负离子模式
2.11 水解产物对酪氨酸酶活性的抑制作用
酪氨酸酶抑制活性按所述方法评估。具体为：40 µL 0–10 mg/mL样品（K44C-A119C处理的κ-卡拉胶和未消化κ-卡拉胶）和40 µL酪氨酸酶（Yuanye Bio-Technology，上海，中国）溶液……
【数据】样品浓度范围：0–10 mg/mL；样品体积：40 µL；酪氨酸酶体积：40 µL；来源：Yuanye Bio-Technology
研究结果
3.1 二硫键的计算设计
PROCHECK工具呈现的Ramachandran图分析表明，P. tetraodonis κ-卡拉胶酶预测结构质量良好，91.8%的残基位于允许区域，8.2%位于可接受区域。VERIFY 3D分析显示91.7%的残基平均3D–1D得分≥0.1，表明原子模型（3D）与目标氨基酸序列（1D）之间具有良好的相容性。基于P. tetraodonis κ-卡拉胶酶三维结构，选择六个具有一对半胱氨酸点突变的突变体（K44C-A119C、R45C-T293C、K52C-V76C、T120C-Q250C、S147C-R249C和L153C-D158C）。蛋白质表达和纯化后，SDS-PAGE检测到每个变体均呈现估计分子量为48.8 kDa的单一条带（图1a）。纯化重组酶的活性测定显示，R45C-T293C、K52C-V76C、S147C-R249C和L153C-D158C突变与WT相比降低了酶活性（图1b）。相比之下，突变体K44C-A119C和T120C-Q250C的活性较WT分别提高19.0%和7.3%（图1b）。因此，选择K44C-A119C和T120C-Q250C两个突变体进行进一步的酶学表征。
【数据】WT有利区域残基：91.8%；可接受区域：8.2%；VERIFY 3D得分≥0.1：91.7%；分子量：48.8 kDa；K44C-A119C活性提高：19.0%；T120C-Q250C活性提高：7.3%
3.2 K44C-A119C和T120C-Q250C的热稳定性
热稳定性分析显示，50°C处理30分钟后，WT保留45.4%残余活性，而突变体K44C-A119C和T120C-Q250C分别维持80.1%和78.6%的残余活性（图1c）。暴露于更高温度60°C后，WT仅保留初始活性的4.9%，变体K44C-A119C和T120C-Q250C分别显示20.3%和23.7%的残余活性（图1c）。此外，κ-卡拉胶酶的DSC分析显示WT的T m值为51.2°C，而K44C-A119C和T120C-Q250C分别提高至56.0°C和54.8°C（表1）。这些结果表明引入的K44C-A119C和T120C-Q250C突变改善了酶的热稳定性。
【数据】50°C/30min残余活性：WT 45.4%、K44C-A119C 80.1%、T120C-Q250C 78.6%；60°C残余活性：WT 4.9%、K44C-A119C 20.3%、T120C-Q250C 23.7%；T m值：WT 51.2°C、K44C-A119C 56.0°C、T120C-Q250C 54.8°C
3.3 K44C-A119C和T120C-Q250C的生化性质与动力学参数
除κ-卡拉胶酶热稳定性外，还表征了其他生化性质和动力学参数。与WT相比，突变体K44C-A119C和T120C-Q250C显示出相同的最适温度50°C和最适pH 8.0（表1）。WT、K44C-A119C和T120C-Q250C的K m值分别为1.46 mg/mL、1.99 mg/mL和2.04 mg/mL（表1）。这表明突变后底物结合亲和力降低。此外，WT、K44C-A119C和T120C-Q250C的V max值分别为67.09 U/mg、108.35 U/mg和90.33 U/mg（表1）。WT、K44C-A119C和T120C-Q250C的k cat值分别为4.09 s⁻¹、6.61 s⁻¹和5.51 s⁻¹（表1）。这表明突变κ-卡拉胶酶的转换数增加。WT、K44C-A119C和T120C-Q250C的k cat/K m值分别为2.80 mL·mg⁻¹·s⁻¹、3.32 mL·mg⁻¹·s⁻¹和2.70 mL·mg⁻¹·s⁻¹（表1）。这表明K44C-A119C突变后酶催化效率提高。WT与突变体酶性质比较汇总于表1。这些结果表明K44C-A119C和T120C-Q250C突变改善了κ-卡拉胶酶的热稳定性和转换数，有利于其应用。据报道，κ-卡拉胶酶具有广泛的工业应用，包括生产卡拉胶寡糖、分离制备藻类原生质体和处理藻类废弃物。
【数据】最适温度：50°C（WT与突变体相同）；最适pH：8.0（WT与突变体相同）；K m：WT 1.46 mg/mL、K44C-A119C 1.99 mg/mL、T120C-Q250C 2.04 mg/mL；V max：WT 67.09 U/mg、K44C-A119C 108.35 U/mg、T120C-Q250C 90.33 U/mg；k cat：WT 4.09 s⁻¹、K44C-A119C 6.61 s⁻¹、T120C-Q250C 5.51 s⁻¹；k cat/K m：WT 2.80 mL·mg⁻¹·s⁻¹、K44C-A119C 3.32 mL·mg⁻¹·s⁻¹、T120C-Q250C 2.70 mL·mg⁻¹·s⁻¹
3.4 K44C-A119C和T120C-Q250C的CD和荧光光谱、表面疏水性
CD光谱可用于显示酶的构象变化。本研究中，CD分析结果显示WT的二级结构含11.3% α-螺旋、41.0% β-折叠、19.3% β-转角、28.4%无规卷曲。突变体K44C-A119C含13.3% α-螺旋、42.2% β-折叠、19.1% β-转角、25.4%无规卷曲，突变体T120C-Q250C含13.0% α-螺旋、41.3% β-折叠、18.5% β-转角、27.2%无规卷曲。两个突变体比WT保留更多α-螺旋和更少无规卷曲（图1d）。热稳定性改善的1,4-α-葡聚糖分支酶（GBE）在半胱氨酸替换后也比野生型酶保留更多α-螺旋。这些结果表明K44C-A119C和T120C-Q250C两个突变体热稳定性的提高可能与α-螺旋结构增加有关。
荧光光谱可反映蛋白质中色氨酸残基因突变导致的微环境变化。WT和突变体的荧光光谱在392 nm处显示相同的最大荧光发射峰（图1e），表明突变对κ-卡拉胶酶三级结构无显著影响。在1,4-α-葡聚糖分支酶中也观察到类似结果——半胱氨酸替换对酶三级结构无显著影响，同时保留更多α-螺旋和β-折叠二级结构。
ANS等荧光探针可检测蛋白质暴露的疏水斑块——与蛋白质暴露表面结合时显示差异稳态荧光，区别于埋藏疏水位点。本研究中，WT和突变体的表面疏水性分析显示，与WT相比，突变体K44C-A119C和T120C-Q250C与ANS孵育后显示较弱荧光强度（图1f），表明表面残基疏水性降低。疏水相互作用是影响蛋白质结构稳定性的重要因素，可通过增加蛋白质内部残基疏水性或降低表面残基疏水性来增强。K44C-A119C和T120C-Q250C表面疏水性降低可能解释其热稳定性的提高。
【数据】WT二级结构：α-螺旋11.3%、β-折叠41.0%、β-转角19.3%、无规卷曲28.4%；K44C-A119C：α-螺旋13.3%、β-折叠42.2%、β-转角19.1%、无规卷曲25.4%；T120C-Q250C：α-螺旋13.0%、β-折叠41.3%、β-转角18.5%、无规卷曲27.2%；最大荧光发射峰：392 nm
3.5 K44C-A119C和T120C-Q250C的微观结构变化
Ramachandran图分析表明，K44C-A119C和T120C-Q250C的预测结构有90.5%的残基位于允许区域，9.5%位于可接受区域。VERIFY 3D分析显示K44C-A119C和T120C-Q250C分别有93.9%和91.7%的残基平均3D–1D得分≥0.1。突变体催化中心周围的指状结构如图2所示。在K44C-A119C和T120C-Q250C中，第44、119、120和250位氨基酸残基位于κ-卡拉胶酶表面远离催化中心的环区（图2），从而降低了损害酶活性的风险。
二硫键作为共价相互作用，可通过降低构象熵来稳定蛋白质结构，维持正确的蛋白质折叠和功能。该策略已成功应用于修饰多种酶，包括来自Pseudomonas saccharophila STB07的淀粉酶、来自Geobacillus thermoglucosidans STB02的1,4-α-葡聚糖分支酶、来自Rhizopus chinensis的脂肪酶、来自Clostridium bolteae的D-阿洛酮糖3-差向异构酶以及来自Bacillus licheniformis的植酸酶。有趣的是，二硫键突变位点周围的相互作用分析显示，Ala43可与Cys44和Ser46周围的氨基酸残基形成两个额外氢键，Trp57可与Leu253和Ser117形成两个额外范德华力（VDW）——均在K44C-A119C中（图2a）。对于突变体T120C-Q250C，Asn252可与Ala119、Ser117和Arg118周围的氨基酸残基形成三个额外VDW相互作用（图2b）。氢键和VDW的分子内相互作用是……
【数据】K44C-A119C有利区域残基：90.5%；可接受区域：9.5%；VERIFY 3D得分≥0.1：K44C-A119C 93.9%、T120C-Q250C 91.7%；K44C-A119C额外氢键：2个；额外VDW：2个；T120C-Q250C额外VDW：3个
3.6 分子对接与分子动力学模拟分析
（此处对应图3、图4、图5的正文内容——原文节选在3.5处中断，后续内容原文未提供完整节选，但根据图表清单可推断存在分子对接、MD模拟和催化通道分析。）
【数据】原文未详述
3.7 酶解产物分析与酪氨酸酶抑制活性
（此处对应图6的正文内容——LC-MS分析κ-卡拉胶水解产物及其酪氨酸酶抑制活性。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过理性设计引入额外二硫键，获得两个热稳定性改善的突变κ-卡拉胶酶K44C-A119C和T120C-Q250C。二硫键及其相邻非共价键的增加、催化通道的加宽、指状结构F6柔性的增加以及部分环区和β-折叠刚性的增强，共同解释了这两个突变体热稳定性和酶活性的改善。额外二硫键的引入不仅影响蛋白质整体波动，还选择性增加了蛋白质的局部稳定性。通过定向突变增强κ-卡拉胶酶热稳定性的尝试，为二硫键工程提供了实用策略，有助于κ-卡拉胶酶在κ-卡拉胶寡糖工业生产中的应用。该二硫键工程策略可用于改善其他酶的热稳定性。此外，突变体K44C-A119C产生的κ-卡拉胶寡糖对酪氨酸酶的抑制活性高于未处理κ-卡拉胶，使该突变κ-卡拉胶酶在化妆品行业具有巨大应用潜力。
编译者解读
本研究展示了计算设计与实验验证相结合的二硫键工程范例。方法学上，DbD2工具预测结合B-factor筛选和催化位点距离排除，体现了理性设计的系统性。K44C-A119C突变体在热稳定性（T m提高4.8°C）和催化效率（k cat/K m提高18.6%）上的同步提升颇具价值——通常稳定性与活性存在权衡。CD光谱揭示α-螺旋比例增加与热稳定性改善的关联，为后续设计提供了光谱学筛选指标。局限在于仅测试了两个突变体组合，未探索协同多二硫键策略。从合成生物学应用看，该策略可迁移至其他工业酶的热稳定性改造，具有较广的适用潜力。
参考来源
Zheng Y. Enhancing thermostability of alkaline κ-carrageenase from Pseudoalteromonas tetraodonis by rational design of disulfide bonds. Process Biochemistry, 2023. DOI: 10.1016/j.procbio.2023.10.016
DOI: 10.1016/j.procbio.2023.10.016