来源：Engineering of serine protease for improved thermostability and catalytic activity using rational design（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蛋白酶是工业酶制剂的重要组成，但野生型酶在高温等苛刻条件下的不稳定性限制了其应用。本研究从工业皮革废料土壤中分离出一株铜绿假单胞菌，获得一种名为SP的丝氨酸蛋白酶，并采用理性设计策略，通过FireProt服务器预测的八点突变中筛选出两个非催化残基突变体A29G和V336I。实验表明，两突变体的Tm值分别提升5°C以上，催化活性提高1.4倍，分子动力学模拟进一步证实了其热稳定性的改善。该研究为蛋白酶的结构-稳定性-活性关系提供了新见解。
研究背景
蛋白酶是工业酶制剂的主要类别之一。微生物来源的丝氨酸蛋白酶因生化多样性和广泛应用而备受关注——涉及丝绸、制革、食品工业、医药制剂、银回收、洗涤剂及废物处理等领域。丝氨酸蛋白酶通过经典的Ser/His/Asp催化三联体断裂肽键，其中丝氨酸作为亲核试剂，组氨酸充当广义碱和酸，天冬氨酸则负责定位组氨酸并中和过渡态电荷。
高温稳定性和高催化效率是蛋白酶的核心需求。许多野生型酶在恶劣工业条件下——尤其是温度方面——存在局限性。蛋白质工程为改善酶稳定性、满足工业应用需求提供了有效途径。
研究方法
2.1 SP的分离与克隆
从工业皮革废料土壤样品中分离出一株铜绿假单胞菌，并在最低盐培养基（MSM）中培养。使用酪蛋白作为底物检查上清液中的蛋白水解活性，以确认蛋白酶的胞外表达。扩增并测序全长16S rRNA基因，用于菌株的系统发育鉴定。使用phylogeny.fr在线服务器构建系统发育树。以铜绿假单胞菌参考菌株PA14丝氨酸蛋白酶基因为模板，使用CEMA套件从高度保守区域设计全长基因测序引物。通过聚合酶链反应（PCR）扩增SP基因，使用引物（TTTTTTGGATCCATGCATACCCTAAAACGCTG和AAAAAAGCGGCCGCTTATTCGGCCAGCTTGAA）。
【数据】菌株：铜绿假单胞菌；培养基：最低盐培养基（MSM）；底物：酪蛋白；引物序列：TTTTTTGGATCCATGCATACCCTAAAACGCTG / AAAAAAGCGGCCGCTTATTCGGCCAGCTTGAA
采用计算机模拟表征以深入了解蛋白酶结构。使用ProtParam服务器计算蛋白质的物理化学参数，使用SignalP4.0预测N端信号肽的存在。使用InterPro服务器鉴定蛋白酶中的结构域，最后使用I-TASSER进行3D结构建模，以1KY9、3STJ、3PV2、2ZLE和3MH6 PDB结构为模板。表达全长（474个氨基酸）蛋白、融合N端6×His标签的SP基因被克隆到修饰的pET-32a载体中，位于BamH1和Not1限制性酶切位点之间。修饰的pET-M载体是不含Trx•Tag、S•Tag的pET-32a(+)载体。His标签用于Ni²⁺-NTA亲和纯化，该质粒赋予转化的BL21细胞氨苄青霉素抗性。WT SP被克隆到pET-32a载体中，含或不含信号肽，并带有6×His标签。
【数据】蛋白长度：474 aa；载体：修饰的pET-32a；限制性位点：BamH1和Not1；标签：N端6×His；抗性：氨苄青霉素；模板结构：1KY9, 3STJ, 3PV2, 2ZLE, 3MH6
2.2 蛋白表达与纯化
将确认的质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，在含100 μg/ml氨苄青霉素（Gold Biotechnology）的Luria-Bertani（LB）培养基中于37°C培养至OD600约0.8，随后使用500 μM IPTG（Gold Biotechnology）在37°C诱导蛋白表达16小时。细胞在5000 g离心30分钟沉淀，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，储存于−20°C备用。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，300 mM NaCl，5%甘油）中，含5 mM咪唑（Sigma-Aldrich）和2 mM DTT（Gold Biotechnology），超声处理，裂解液高速离心分离可溶性上清液和不溶性细胞碎片。使用镍-NTA珠（Merck）和尺寸排阻色谱（HiLoad Superdex 200）纯化重组蛋白。使用SDS-PAGE分析洗脱组分的分子量和纯度。此外，使用基质辅助激光解吸电离-两级飞行时间（MALDI-TOF/TOF）系统（5800 MALDI-TOF/TOF质谱仪，ABSciex）和内部Mascot软件进行数据库搜索和蛋白质鉴定，确认纯化蛋白的分子质量。
【数据】菌株：大肠杆菌BL21(DE3)；培养基：LB；氨苄青霉素浓度：100 μg/ml；诱导温度：37°C；IPTG浓度：500 μM；诱导时间：16h；离心：5000 g，30min；裂解缓冲液：50 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl, 5%甘油；咪唑：5 mM；DTT：2 mM；纯化方法：镍-NTA亲和+尺寸排阻色谱（HiLoad Superdex 200）
2.3 稳定突变体的制备与表征
采用理性设计方法，鉴定SP中能提高其热稳定性的稳定化突变。第一步，将蛋白序列提交至I-TASSER服务器预测蛋白3D结构。基于C-score选择最可靠的模型，并使用在线ModRef服务器对预测模型进行精修，以减少不必要的侧链冲突。将精修后的模型提交至FireProt服务器，通过进化和能量基础方法预测稳定化突变。将选定的点突变引入WT构建体中，并过表达相应蛋白。使用远紫外圆二色（CD）光谱验证突变体二级结构的可能变化。
【数据】建模工具：I-TASSER；模型精修：ModRef；突变预测：FireProt（进化+能量方法）；结构验证：远紫外CD光谱
2.4 圆二色（CD）光谱与热变性分析
将10–15 μM重组WT或突变体SP制备于20 mM Tris（pH 7.5）、5%甘油和150 mM NaCl缓冲液中。使用配备Jasco MCB-100温度控制器的Jasco J-1100分光光度计（1 mM石英比色皿，扫描速率20 nm/min，带宽1 nm，数据间距1 nm）获取190至260 nm的远紫外光谱。CD光谱使用在线CD数据分析工具CAPITO绘制，并使用Savitzky-Golay滤波器平滑曲线。热解折叠在222 nm（代表α-螺旋信号）处监测，温度扫描模式从20至95°C，扫描速率为1°C min⁻¹。记录的野生型和突变体酶变性数据使用Boltzmann方程拟合成S形曲线。蛋白的Tm值被指定为归一化热变性数据的中点。使用CDpal软件将数据集拟合至计算的ΔHm值。
【数据】蛋白浓度：10–15 μM；缓冲液：20 mM Tris pH 7.5, 5%甘油, 150 mM NaCl；光谱范围：190–260 nm；扫描速率：20 nm/min；带宽：1 nm；热变性监测波长：222 nm；温度范围：20–95°C；升温速率：1°C/min；拟合模型：Boltzmann方程；数据分析：CDpal软件
2.5 酶活测定
使用酪蛋白作为底物，参照文献[30]的方法并稍作修改，测定纯化的重组WT酶的催化活性。通过在30–80°C的100 mM Tris-HCl中测定酪蛋白水解活性来确定最适温度。类似地，在最适温度下于pH 5–10范围内确定最适pH。通过将5 μM酶在不同温度下孵育120分钟，测定野生型和突变体的残余活性。WT和突变体酶在最适pH和温度下，以不同浓度底物（0.1至2 mg/ml）反应10分钟，测定其动力学参数。使用Michaelis-Menten方程计算动力学参数（Km、Vmax和Kcat）。
【数据】底物：酪蛋白；温度范围：30–80°C；pH范围：5–10；酶浓度：5 μM；孵育时间：120 min；底物浓度范围：0.1–2 mg/ml；反应时间：10 min；动力学模型：Michaelis-Menten方程
2.6 分子动力学（MD）模拟
将蛋白质包裹在水盒中，用0.15 mol/L盐浓度中和。系统随后进行能量最小化，随后通过QwikMD界面使用NAMD软件进行1 ns平衡运行。平衡和生产阶段均在315或345 K下运行。为评估突变体相对于WT的热稳定性，使用NAMD v2.12模拟器、CHARMM36力场和TIP3P水模型进行MD模拟。每次生产模拟运行30 ns，以充分采样能量景观。非键相互作用截断值为12 Å。长程静电相互作用使用粒子网格Ewald（PME）方法，运动方程使用r-RESPA多时间步方法以2 fs时间步长积分。使用VMD软件对生产运行进行MD模拟分析。生产轨迹的帧相对于质心坐标对齐，并以初始平衡结构为参考计算均方根偏差（RMSD）。基于RMSF的柔性使用VMD插件vmdICE计算。
【数据】盐浓度：0.15 mol/L；平衡时间：1 ns；模拟温度：315 K或345 K；软件：NAMD v2.12；力场：CHARMM36；水模型：TIP3P；生产模拟时间：30 ns/次；非键截断：12 Å；时间步长：2 fs；静电方法：PME；分析软件：VMD + vmdICE
2.7 基于几何形状的分子对接
为预测配体与野生型及两个突变体的结合亲和力，采用Schneidman-Duhovny等人开发的对接算法Patchdock。实验测定中使用的酪蛋白作为对接分析中的配体。为构建配体的3D结构，从PubChem数据库获取SMILES字符串，并提交至CORINA以生成用于对接的3D结构。野生型、突变体和配体的3D结构作为Patchdock服务器的输入。服务器预测酶与配体的潜在结合构象，并根据其原子接触能（ACE）进行排序，以预测最佳结合构象。
【数据】对接软件：Patchdock；配体：酪蛋白；3D结构生成：CORINA；配体来源：PubChem（SMILES）；评分标准：原子接触能（ACE）
研究结果
3.1 细菌菌株中SP的分离
从工业皮革废料土壤样品中分离出一株铜绿假单胞菌。该菌株基于高酪蛋白水解活性被选中。系统发育树（图1A）显示，所选菌株与铜绿假单胞菌NBRC密切相关，16S rRNA序列已提交至NCBI数据库，登录号为KY285994。NCBI Blast-p结果显示与其他假单胞菌HtrA样蛋白酶具有最高同一性。ProtParam服务器推导出SP的分子量为50 kDa，PI为7.04。此外，在N端鉴定到一个25个氨基酸长的信号肽（MHTLKRCMAAMVALLALSLAMTARA），表明该酶可能胞外表达。在酶中观察到三个不同结构域，即N端胰蛋白酶样催化结构域和两个C端PDZ结构域（PDZ1和PDZ2）。基于特征结构域架构，根据MEROPS将SP归类为PA蛋白酶家族S1C亚家族。此外，还构建了丝氨酸蛋白酶的3D结构，其折叠被推导出来，预测的3D模型显示出特征性的β-桶胰蛋白酶结构域。从3D结构可以明显看出，螺旋百分比低（5.2%），β-折叠含量高（35.1%）。这一观察结果与先前报道的类似类别蛋白酶的二级结构一致。此外，His89、Asp119和Ser192在酶中形成中继中心并参与催化活性。已知DegP、DegS和DegQ是细菌中研究最充分的HtrA丝氨酸蛋白酶。值得注意的是，本研究的蛋白酶在蛋白水解结构域（β-桶胰蛋白酶结构域）方面与上述蛋白酶表现出高度的结构相似性。此外，就存在两个C端PDZ结构域而言，SP似乎更接近DegP。基于这些结构相似性，可以推测该蛋白酶可能形成功能性寡聚体，因为它与DegP相似。
【数据】菌株鉴定：铜绿假单胞菌（与NBRC近缘）；NCBI登录号：KY285994；分子量：50 kDa；PI：7.04；信号肽：25 aa（MHTLKRCMAAMVALLALSLAMTARA）；结构域：N端胰蛋白酶样催化域 + 2个C端PDZ域；分类：MEROPS S1C家族，PA clan；螺旋含量：5.2%；β-折叠含量：35.1%；催化三联体：His89, Asp119, Ser192
3.2 SP的实验表征
含信号肽的构建体产生聚集体，而不含信号肽的构建体则产生可溶性酶表达。实验分子量、western blot和质谱数据也确认了纯化组分中SP的存在。以酪蛋白为底物，该酶在约60°C和pH约7.5时表现出最大活性（图2）。研究还进行了远紫外（190至260 nm）圆二色光谱分析，以验证各二级结构元素的相关系数。正如预测的那样，结果显示β-折叠比例相对较高，这是远紫外CD光谱的特征输出，与所有先前报道的类似类型丝氨酸蛋白酶一致。同时监测了酶的残余活性。将5 μM SP在60和75°C下预孵育，并在最适条件下监测酪蛋白水解活性。在60°C孵育10和30分钟后，酶分别丧失54%和85%的活性。此外，在75°C孵育10分钟后，酶丧失91%的活性（图4），表明野生型丝氨酸蛋白酶的热稳定性和残余活性较低。
【数据】最适温度：60°C；最适pH：7.5；酶浓度：5 μM；60°C孵育10 min残余活性丧失：54%；60°C孵育30 min残余活性丧失：85%；75°C孵育10 min残余活性丧失：91%
3.3 构建更耐热、活性更高的SP突变体
采用理性蛋白设计来鉴定SP中能赋予更高热稳定性和催化活性的稳定化突变。将预测的3D模型提交至FireProt服务器，通过进化和能量基础方法预测稳定化突变。共选择八个突变（能量基础方法：A29G、A114M、V394Y、V430M；进化基础方法：L51F、F211Y、L230M、V336I）。
【数据】突变总数：8个；能量基础：A29G, A114M, V394Y, V430M；进化基础：L51F, F211Y, L230M, V336I
3.4 A29G和V336I显示出更高的热稳定性
所有八个突变体均被生成并在实验上检查其对蛋白质结构的影响。使用酪蛋白作为底物表征突变体的最适温度和pH。除A29G和V336I两个突变体外，所有其他突变体在不同温度和pH下均表现出可忽略的蛋白水解活性。测量远紫外（190至260 nm）CD光谱以观察WT与突变体二级结构之间的差异。WT与六个突变体L51F、A114M、F211Y、L230M、V394Y和V430M的二级结构之间存在显著差异，表明突变对蛋白质结构有去稳定化影响。该数据与突变体的生化表征一致。八个突变中只有两个非催化残基突变体A29G和V336I显示出与WT相当的二级结构（图3A），并被选择用于进一步的下游热稳定性分析。此外，使用远紫外CD测量评估WT和突变体A29G及V336I的热稳定性（图3B）。两个突变体A29G和V336I均表现出相当的热力学稳定性，优于WT。WT、A29G和V336I的Tm分别为71.9、77.5和76.6°C。此外，转变过程中的焓变（ΔHm）值也提供了对突变体热稳定性的见解。与突变体相比，野生型显示出平缓的CD热转变曲线。平缓的转变曲线与小ΔHm值相关，表明野生型酶的热稳定性较低，而两个突变体均显示出较大的ΔHm值，表明其热抗性增强（表1）。
【数据】WT Tm：71.9°C；A29G Tm：77.5°C；V336I Tm：76.6°C；ΔHm：WT为小值，突变体为大值（表1）；活性可忽略的突变体：L51F, A114M, F211Y, L230M, V394Y, V430M
3.5 A29G和V336I显示出更高的活性
确定了突变体A29G和V336I的最适酶活条件和残余活性（图2）。突变体也在相同的WT最适条件（60°C和pH 7.5）下显示出最大催化活性。在最适温度和pH之上和之下，活性均有所下降。同时监测突变体的残余活性以确定其热抗性。在60、70和75°C预孵育2小时后，突变体的酪蛋白水解活性降低（图4）。与WT相比，两个突变体均表现出更高的热稳定性，该残余活性数据与热变性CD数据一致——两个突变体均表现出比WT更好的热抗性。
【数据】最适条件：60°C，pH 7.5；预孵育温度：60/70/75°C；预孵育时间：2h；残余活性：突变体均高于WT
3.6 WT和突变体SP蛋白的动力学参数
使用Michaelis-Menten方程表征WT和突变体的动力学。在5 μM浓度下，WT和突变体在最适温度和pH下与不同浓度的酪蛋白孵育。使用Microsoft Excel Solver计算不同动力学参数（表2）。两个突变体的Km值表明其与底物的亲和力高于WT。显然，A29G和V336I对转换数（Kcat）影响不大，但两个突变体的Kcat/Km值均显示约1.4倍的增加。
【数据】酶浓度：5 μM；底物：酪蛋白（不同浓度）；Kcat/Km增加倍数：约1.4倍；Km：突变体低于WT（表2）
3.7 基于几何形状的分子对接显示突变体与底物亲和力更好
还使用分子对接模拟预测了配体与酶之间的亲和力。Patchdock服务器计算了野生型和突变体所有可能构象的ACE分数。两个突变体均显示出比野生型更低的ACE分数（−652.99 kJ/mol对比−559.37 kJ/mol）。这些结果表明配体与两个突变体的结合更好，优于野生型（图S7）。分子对接模拟结果与实验计算的Km值一致。
【数据】WT ACE分数：−559.37 kJ/mol；突变体ACE分数：−652.99 kJ/mol
3.8 分子动力学模拟确认A29G和V336I具有更高的热稳定性
使用分子动力学（MD）模拟来确认实验观察到的热稳定性结果以及突变体A29G和V336I相对于WT的构象行为。
【数据】模拟温度：315 K和345 K；模拟时间：30 ns；温度345 K下突变体热稳定性优于WT
讨论与解读
尽管已有多种来源的有效蛋白酶被表征，但对更稳定、更高效的蛋白酶仍有很高需求。本研究从铜绿假单胞菌菌株中分离并表征了一种丝氨酸蛋白酶，其结构类似DegP样HtrA细菌丝氨酸蛋白酶，具有特征性的N端催化结构域和C端底物结合PDZ结构域。PDZ1负责结合底物并将其呈递至N端催化结构域进行蛋白水解。催化结构域与PDZ1结构域界面的稳定化对整体稳定性和催化活性起重要作用。
为提高蛋白酶的热稳定性，研究采用了理性蛋白设计方法。FireProt预测的八个点突变中，仅A29G和V336I两个突变对酶的热稳定性产生积极影响，其余突变要么破坏了二级结构，要么使酶失活。这两个突变均位于非催化残基，却同时提升了热稳定性（Tm分别增加5.6°C和4.7°C）和催化效率（Kcat/Km增加1.4倍），提示非催化残基的微妙修饰可通过影响整体构象动态来优化催化行为。
编译者解读：该研究采用"计算预测-实验筛选-多维度验证"的闭环策略，FireProt预测的八突变中仅两个有效（25%命中率），这既说明计算设计的效率仍有提升空间，也凸显了实验筛选的必要性。值得关注的是，突变位点位于非催化残基却能同时改善热稳定性和催化活性，这对酶工程中"催化位点以外区域"的改造策略具有参考价值。MD模拟与实验数据的高度一致也表明，计算手段在预测蛋白质工程改造效果方面正变得越来越可靠。局限在于，研究未深入解析A29G和V336I提升热稳定性的分子机制细节，后续可结合更长时间尺度的模拟和结构解析进一步阐明。
参考来源
期刊：International Journal of Biological Macromolecules, 2019
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2018.12.218
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2018.12.218