来源：Heterologous expression of phospholipase A1 gene in PichiaPink™ and optimization of catalytic conditions for phospholipid ω-3 fatty acid synthesis（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
ω-3多不饱和脂肪酸（PUFA）中的DHA/EPA以磷脂型存在时具有更优的代谢特性和吸收效率。本研究从米曲霉中克隆磷脂酶A1（PLA1）基因，经密码子优化后在PichiaPink™中异源表达，摇瓶酶活达26.42 U/mL，50 L发酵罐放大后酶活提升至114.30 U/mL，为目前Pichia表达系统报道的最高值。以固定化PLA1催化大豆磷脂酰胆碱与鱼油来源DHA/EPA乙酯进行酯交换，总嵌入率达22.77%，且固定化酶重复使用4次后仍保留50%以上活性。
研究背景
ω-3多不饱和脂肪酸（PUFA）因促进健康、降低疾病风险而受到广泛关注，其中DHA和EPA是生物活性最强的重要组分。研究表明，DHA/EPA的摄入可预防心血管疾病、增强记忆与视觉发育、发挥抗炎作用、调节骨代谢并抵抗衰老。DHA/EPA存在游离脂肪酸型、甘油酯型、乙酯型（EE）和磷脂型（PL）等多种形式。游离脂肪酸型易氧化，导致品质缺陷并缩短产品货架期；与游离脂肪酸型和乙酯型相比，甘油酯型具有优良的生物利用度和氧化稳定性。近年研究证实，DHA/EPA-PL比甘油酯型具有更好的代谢特性，更易被人体吸收。因此，DHA/EPA-PL的合成具有重要应用价值。磷脂酶A1（PLA1）可催化磷脂酰胆碱（PC）与DHA/EPA乙酯之间的酯交换反应，是实现磷脂型DHA/EPA合成的关键酶。本研究旨在通过PichiaPink™表达系统实现PLA1的高效异源表达，并优化固定化及酯交换催化条件。
研究方法
2.1 材料
菌株PichiaPink™和质粒pPinkαHC保存于实验室。大肠杆菌DH5α购自北京擎科生物科技有限公司。PLA1基因来源于米曲霉（GenBank登录号：E16314.1）。根据毕赤酵母密码子偏好性对PLA1基因进行优化，优化后的基因序列（PLA1）由上海生工生物工程股份有限公司合成。限制性内切酶（SpeI、StuI、KpnI）购自大连Takara公司。磷脂酰胆碱（纯度95%，来源于大豆）购自Sigma-Aldrich公司。富含DHA/EPA的乙酯（含37.80% DHA和46.30% EPA）购自西安Michel生物技术有限公司。37种脂肪酸甲酯（FAME）混合标准品、DHA-甲酯和EPA-甲酯购自上海安谱实验科技股份有限公司，用于FAME峰鉴定和定性验证。大孔树脂D001、AB-8、724、D380、D345和DA201购自郑州Ano化学技术有限公司。所有其他试剂均为分析纯，未经进一步纯化直接使用。
【数据】菌株：PichiaPink™、E. coli DH5α；基因来源：米曲霉（GenBank: E16314.1）；PC纯度：95%；DHA/EPA乙酯含量：37.80% DHA + 46.30% EPA；树脂种类：D001、AB-8、724、D380、D345、DA201
2.2 重组表达载体的构建
以合成的PLA1基因为模板，根据载体pPinkαHC和PLA1的序列设计特异性引物用于后续克隆。正向引物F pPink：CGAGAAAAGGCCTATGTTTTCTTTGGCTAGATT；反向引物R pPink：GTAGTAGTAGTGATTCCATGGCCGGCCGGTA。下划线序列分别代表StuI和KpnI酶切位点。PCR条件：95°C预变性3 min，95°C变性15 s，62°C退火15 s，72°C延伸60 s，循环30次，最后72°C延伸5 min。载体经StuI和KpnI双酶切，纯化的PCR产物通过无缝克隆连接至载体骨架，生成重组表达载体pPinkαHC-PLA1。将重组表达载体转化至DH5α感受态细胞中。
【数据】引物：F pPink / R pPink（含StuI/KpnI位点）；PCR条件：95°C 3 min预变性；95°C 15 s、62°C 15 s、72°C 60 s，30循环；72°C 5 min终延伸；酶切：StuI + KpnI双酶切
2.3 pPinkαHC的提取与线性化
使用质粒小提试剂盒从DH5α中提取重组质粒，然后用SpeI（ACTAGT）限制性内切酶将其线性化。为提高转化效率，线性化质粒至少需要5 μg。
【数据】线性化酶：SpeI；线性化质粒用量：≥5 μg
2.4 酵母转化
随后，通过电穿孔将线性化质粒转染至PichiaPink™感受态细胞中。PichiaPink™感受态细胞用1 M山梨醇制备。电穿孔使用Gene Pulser Xcell™电穿孔系统，配0.20 cm电穿孔杯。电穿孔后加入酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基，30°C孵育2 h。然后将细胞涂布于Pichia腺嘌呤缺陷培养基上，30°C培养48 h。
【数据】感受态制备：1 M山梨醇；电穿孔：Gene Pulser Xcell™，0.20 cm电转杯；复苏：YPD培养基，30°C，2 h；筛选培养：腺嘌呤缺陷培养基，30°C，48 h
2.5 PLA1的表达
将pPinkαHC-PLA1阳性酵母转化子在30°C、50 mL BMGY培养基中培养24 h。然后离心（25°C，5000×g，5 min），将沉淀重悬于100 mL BMMY培养基中诱导表达。每24 h收集1 mL表达上清液，然后加入1%甲醇。继续培养7 d。收集无细胞上清液用于酶活性测定和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。
【数据】培养：BMGY 50 mL，30°C，24 h；诱导：BMMY 100 mL；甲醇添加：1%，每24 h；总培养时间：7 d；离心：25°C，5000×g，5 min
2.6 重组PLA1的放大生产
本研究在50 L发酵罐（Minifors，百仑生物科技，中国）中进行，工作体积为30 L BSM培养基，其中甘油和甲醇在不同阶段用作碳源，氨水用作氮源。PichiaPink™种子培养物在YPD培养基中制备，按10%（v/v）接种。采用级联模式维持搅拌速度、通气速率和温度分别为200 rpm、1.50 vvm（每分钟每升反应器体积的气体体积）和30°C，培养168 h。在相似生长条件下维持pH 5.50进行分批运行。每24 h通过取样口取50 mL样品。离心样品（4°C，10,000×g，10 min），然后测定澄清上清液中的PLA1活性。
【数据】发酵罐：50 L（工作体积30 L BSM）；碳源：甘油+甲醇（分阶段）；氮源：氨水；接种量：10%（v/v）；转速：200 rpm；通气：1.50 vvm；温度：30°C；pH：5.50；时间：168 h；取样：每24 h取50 mL；离心：4°C，10,000×g，10 min
2.7 酶活性测定与SDS-PAGE分析
PLA1活性测定使用脱油大豆卵磷脂乳液。一个PLA1单位（U）定义为在所述条件下每分钟释放1 μmol可滴定游离脂肪酸（FFA）所需的酶量。底物溶液：将4%脱油大豆磷脂和2%聚乙烯醇在0.02 M PBS（pH 6.00）中用高速匀浆器（IKA T25 digital）以20000 rpm乳化10 min。反应条件：将9 mL磷脂乳液与1 mL酶溶液混合，在40°C摇动15 min，然后加入15 mL 95%乙醇终止反应，用0.05 M NaOH滴定释放的FFA。空白样品用热灭活PLA1测定。所有实验重复三次以计算平均值。酶活性可按以下公式计算：
（2-1）E = (V - V₀) × c × 50 / (0.05 × t × m)
其中E：酶活性（U/mL）；V：实验组NaOH消耗量（mL）；V₀：对照组NaOH消耗量（mL）；c：NaOH标准溶液浓度（mol/L）；50：1.00 mL 0.05 mol/L NaOH标准溶液相当于50 μmol脂肪酸；t：酶活性测定反应时间（min）；m：酶添加体积（mL）。将发酵液与样品缓冲液的混合溶液（15 μL）煮沸15 min，用12.5%凝胶进行SDS-PAGE分析。分离的蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色，然后用脱色液脱色至条带清晰可见。
【数据】底物：4%脱油大豆磷脂+2%聚乙烯醇，0.02 M PBS（pH 6.00）；乳化：20000 rpm，10 min；反应：9 mL乳液+1 mL酶液，40°C，15 min；终止：95%乙醇15 mL；滴定：0.05 M NaOH；SDS-PAGE：12.5%凝胶，煮沸15 min
2.8 PLA1的固定化
对于PLA1的固定化，将不同载体与酶溶液按1:3的比例混合。酶悬浮液在水浴摇床中于200 rpm、30°C下固定。摇动8 h后，过滤回收所得固定化酶制剂，用0.02 M磷酸钠缓冲液洗涤，冷冻干燥24 h，4°C保存，一周内使用。固定化PLA1的酶活性参照2.6节测定。固定化酶中的结合蛋白量（mg/g）通过从初始蛋白含量中减去固定化后酶悬浮液中剩余蛋白来估算。选择结合蛋白量和酶活性最高的载体用于PLA1固定化。将1 g载体与不同比例（w/v）的PLA1溶液混合，置于轨道摇床中，200 rpm、28°C。摇动一定时间后，测定固定化酶的酶活性和结合蛋白量（mg/g）。
（2-2）固定化酶中蛋白量（mg/g）= (A - B) / C × 100
其中A：酶悬浮液中初始蛋白量（mg）；B：固定化后酶悬浮液中未结合蛋白量（mg）；C：固定化所用载体量（g）。
【数据】载体与酶液比：1:3（w/v）；固定化条件：200 rpm，30°C，8 h；洗涤：0.02 M磷酸钠缓冲液；冻干：24 h；保存：4°C，一周内；优化条件：1 g载体，200 rpm，28°C
2.9 富含DHA/EPA的PC的生物催化合成
对于酯交换反应，在无溶剂体系中从大豆磷脂合成富含DHA/EPA的PC。反应混合物由1 g PC、不同量的DHA/EPA富集乙酯和固定化PLA1组成。混合物在培养箱中于不同温度、200 rpm搅拌下反应16–48 h。定期取样监测DHA/EPA嵌入磷脂的程度。
【数据】反应体系：无溶剂；PC用量：1 g；转速：200 rpm；时间：16–48 h；温度：不同温度（详见结果部分）
2.10 酶的重复使用性
反应完成后，过滤回收固定化酶，用于后续反应以评估其催化效率。
【数据】回收方式：过滤；重复使用次数：详见结果部分
研究结果
3.1 pPinkαHC-PLA1构建体的合成
为获得更适合毕赤酵母表达系统的PLA1基因，首先基于密码子使用数据库对PLA1编码序列进行修饰，在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下提高PLA1表达水平（图1）。密码子使用偏好调整为与目标宿主最高表达谱匹配，密码子适应指数（CAI）从0.63提升至0.95（CAI为0.80–1.00被认为是高表达的最佳范围）。平均GC含量从53.00%调整至40.30%，并去除了不利峰。消除了原始序列中的重复区域，以避免mRNA中的茎环结构并促进合成过程。不想要的基序，包括用于亚克隆的限制性酶切位点和负性顺式作用位点，均被修饰。整个序列经过微调以增强翻译效率并延长mRNA半衰期。生工生物在pUC57载体中合成了888碱基对的靶DNA片段，并与6x-His标签串联融合。该片段经KpnI和StuI消化释放，插入毕赤酵母表达载体pPinkαHC（图2A），并通过限制性酶切和测序确认连接。pPinkαHC-PLA1构建体用SpeI线性化，用于转化PichiaPink™菌株。电穿孔后，转化细胞涂布于腺嘌呤缺陷选择平板上。3–4 d后形成明显的白色和粉色菌落。选择具有更完整重组载体拷贝的白色菌落检测蛋白表达水平。
【数据】CAI：0.63→0.95；GC含量：53.00%→40.30%；基因片段：888 bp；载体：pUC57（含6x-His标签）；酶切：KpnI + StuI；线性化：SpeI；菌落形成时间：3–4 d
3.2 重组PLA1在诱导培养基中的表达
毕赤酵母表达系统在PLA1异源表达方面也取得了显著进展。一株来自冰川土壤细菌的Serratia冷适应PLA1菌株被筛选出来，在毕赤酵母中重组表达后，摇瓶水平最高酶活性为17.30 U/mL，在3.70 L发酵罐培养中胞外酶活性高达41.80 U/mL。当研究人员将Seria mucilaginosus外膜PLA1基因在P. pastoris GS115中重组表达时，酶活性最高达到21.20 U/mL。来源于米曲霉的PLA1基因使用酿酒酵母表达系统表达，发酵液中最大PLA1酶活性为38.70 U/mL。
单菌落接种至YPD培养基中活化。活化后，将培养物转移至含甘油的培养基中，然后转移至含甲醇的培养基中诱导表达。细胞离心（4°C，8000×g，10 min），收集上清液进行SDS-PAGE分析。35 kDa处的蛋白条带（图2B：泳道1–5）表明PLA1以分泌形式表达。值得注意的是，该条带在转化空载体pPinkαHC的对照PichiaPink™菌株的培养上清液中不存在（图2B：泳道6）。在阳性克隆中，3号转化子在摇瓶培养中表现出最高酶活性（23.20 ± 1.02 U/mL），命名为P1pink。
以甘油为碳源，研究其浓度对菌体增殖的影响。如图3A所示，随着甘油浓度的增加，毕赤酵母细胞浓度也随之增加。甘油浓度为1%或2%时OD600值无显著差异，但当甘油浓度超过2%时，OD600值大幅下降。综合考虑成本和培养效果，最终选择1%甘油用于后续实验。如图3B–E所示，对诱导时间的分析表明，在28°C、pH 5.50、最终甲醇浓度为1%（v/v）的条件下发酵96 h达到最佳表达水平（26.42 ± 0.38 U/mL）。
将转化子在50 L发酵罐中培养，诱导后每12 h取样分析细胞生物量（细胞湿重）和磷脂酶活性（图3F）。诱导24 h后，PLA1酶活性呈持续上升趋势，而细胞生物量下降。培养体系稳定后，生物量较初始诱导阶段下降8.90%。这可能是因为PLA1对磷脂具有水解作用，而细胞膜富含这些脂质。因此，PLA1可损伤宿主细胞的细胞膜并引起细胞毒性，从而影响宿主细胞的正常生长。酶活性在诱导108 h时达到最大值（114.30 ± 1.41 U/mL），这是毕赤酵母表达系统中酶活性最高的PLA1，比摇瓶培养提高了332.63%，随后有所下降。
【数据】摇瓶最高酶活：26.42 ± 0.38 U/mL（96 h，28°C，pH 5.50，1%甲醇）；50 L发酵罐最高酶活：114.30 ± 1.41 U/mL（108 h）；生物量下降：8.90%；提高幅度：332.63%；对照菌株：无35 kDa条带；阳性克隆3号：23.20 ± 1.02 U/mL；文献对比：Serratia PLA1 17.30 U/mL（摇瓶）/41.80 U/mL（3.7 L罐）；S. mucilaginosus PLA1 21.20 U/mL；A. oryzae PLA1在酿酒酵母中38.70 U/mL
3.3 固定化效率分析
与游离酶相比，固定化酶具有增强酶稳定性、改善反应选择性和催化效率、便于分离回收以及可重复使用等优势。更重要的是，固定化酶含水量低。在催化磷脂与DHA/EPA-EE之间的酯交换反应时，可减少水解副反应的发生，提高目标产物的产率。酶的固定化吸附法具有操作工艺简单、成本低、对酶活性影响小等优点，是工业应用中使用最广泛的固定化技术。
对于PLA1的固定化，选择六种不同性质的大孔树脂作为载体。酶负载量为3 mL/g树脂，30°C振荡吸附8 h。树脂的理化性质是影响其固定化能力和催化效率的重要因素。如表1所示，在六种树脂中，弱酸性阳离子交换树脂724对PLA1固定化实现了最大蛋白吸附量（32.24 ± 3.27 mg/g）和磷脂酶活性（209.55 ± 3.10 U/g）。这是因为PLA1的等电点为4.49，固定化反应在pH 5.50下进行。在该pH下，D001树脂的强酸性-SO3H基团完全解离（高度带负电），与带负电的PLA1产生强烈静电排斥，从而阻碍蛋白吸附。相比之下，724树脂的弱酸性-COOH基团在这些吸附条件下未完全解离。它能与PLA1蛋白表面的氨基（-NH2）、羟基（-OH）和羰基（-C=O）基团形成广泛的氢键网络，同时其多孔结构提供了高比表面积。这种多点、定向的次级相互作用在最大程度保留酶活性三维构象的同时牢固固定酶分子，这是固定化后酶活性高回收率的关键。D380树脂的伯氨基（-NH2）在实验pH下质子化为-NH3+，带有强正电荷，与带负电的PLA1产生强烈静电吸引。这是其高蛋白吸附量（25.98 mg/g）的主要原因。然而，这种强静电相互作用可能使部分酶分子以多点、紧密堆积的方式结合，可能诱导局部构象变化或降低活性位点的可及性。因此，选择树脂724作为固定化PLA1的载体，用于后续固定化条件和酶催化过程的优化。
如图4所示，当固定化树脂与酶的比例（w/v）为1:1时，固定化酶的活性最高，达到412.35 ± 4.25 U/g。随着树脂与酶比例从1:1增加到1:5，固定化酶的活性逐渐下降。这可能是由于过多的酶分子在树脂表面堆积，阻碍了底物与活性位点的接触。当吸附时间为6 h时，固定化酶的活性达到最大值。继续延长吸附时间，固定化酶活性略有下降，这可能是由于长时间振荡导致已固定的酶分子部分脱落。
【数据】固定化条件：3 mL/g树脂，30°C，8 h；724树脂：蛋白吸附量32.24 ± 3.27 mg/g，酶活209.55 ± 3.10 U/g；D380树脂蛋白吸附量：25.98 mg/g；最佳树脂与酶比例：1:1（酶活412.35 ± 4.25 U/g）；最佳吸附时间：6 h；PLA1等电点：4.49；固定化pH：5.50
3.4 酯交换合成DHA/EPA-PC的条件优化
以大豆PC和DHA/EPA-EE为底物，固定化PLA1为催化剂，在无溶剂体系中催化酯交换反应合成DHA/EPA-PC。反应方程式如图6所示。
考察了底物质量比、酶添加量、反应温度、水添加量和反应时间对DHA/EPA嵌入率的影响（图5、图7）。
如图7A所示，当PC与DHA/EPA-EE的质量比为1:5时，DHA/EPA的总嵌入率达到最高。继续增加DHA/EPA-EE的比例，嵌入率不再显著提高，这可能是由于过量的乙酯稀释了反应体系中的PC浓度，降低了碰撞概率。
如图7B所示，酶添加量对嵌入率有显著影响。当酶添加量为25%时，DHA/EPA嵌入率最高。酶添加量过低时，催化位点不足；酶添加量过高时，过多的酶颗粒可能阻碍底物传质。
如图7C所示，反应温度对嵌入率影响显著。在60°C时嵌入率最高。温度低于60°C时，反应速率较慢；温度高于60°C时，酶可能部分失活，导致嵌入率下降。
如图7D所示，水添加量对酯交换反应有重要影响。当水添加量为0.75%时，嵌入率最高。适量的水有助于维持酶的活性构象，但过多的水会促进水解副反应，降低酯交换效率。
如图7E所示，反应时间对嵌入率的影响表明，随着反应时间的延长，嵌入率逐渐增加，在32 h时达到最大值。继续延长反应时间，嵌入率略有下降，可能是由于已嵌入的DHA/EPA在长时间反应中被水解重新释放。
在最优条件下（PC与DHA/EPA-EE质量比1:5，酶添加量25%，反应温度60°C，水添加量0.75%，反应时间32 h），DHA/EPA的总嵌入率达到22.77 ± 0.62%。
图5显示了不同条件下的气相色谱图。图5A为未添加PLA1酶的产物色谱图，图5B为游离酶催化产物的色谱图，图5C为固定化酶催化产物的色谱图。对比可见，固定化酶催化产物中DHA/EPA对应峰的峰面积显著增大，表明固定化酶更有效地促进了DHA/EPA嵌入PC。
【数据】最佳条件：质量比1:5（PC:DHA/EPA-EE），酶添加量25%，温度60°C，水添加量0.75%，时间32 h；DHA/EPA总嵌入率：22.77 ± 0.62%
3.5 固定化酶的重复使用性
固定化酶的可重复使用性是评价其工业应用价值的重要指标。如图7F所示，固定化PLA1在重复使用4次后，仍保留超过50%的初始酶活性。酶活性的逐渐下降可能归因于反复使用过程中酶的少量脱落和不可避免的构象变化。
【数据】重复使用4次后残余酶活：>50%
讨论与解读
本研究成功实现了米曲霉PLA1在PichiaPink™中的异源表达，并通过50 L发酵罐放大培养将酶活性提升至114.30 U/mL，为目前Pichia表达系统中报道的最高值。通过密码子优化（CAI从0.63提升至0.95，GC含量从53.00%调整至40.30%），显著提高了表达效率。在固定化方面，弱酸性阳离子交换树脂724因其与PLA1的等电点特性匹配，实现了最高的蛋白吸附量和酶活性回收率。在酯交换合成DHA/EPA-PC的过程中，确定了最佳反应条件：底物质量比1:5、酶添加量25%、温度60°C、水添加量0.75%、反应时间32 h，DHA/EPA总嵌入率达22.77%。固定化酶重复使用4次后仍保持50%以上活性，展现出良好的工业应用潜力。
【编译者解读】该研究的技术路线清晰且具有工业导向性：从基因密码子优化到50 L发酵罐放大，再到固定化催化合成功能脂质，形成了完整的产业化链条。选择PichiaPink™分泌表达系统配合弱酸性阳离子交换树脂固定化策略，兼顾了酶产量与操作稳定性。值得注意的是，固定化后酶活翻倍的现象提示树脂载体可能通过界面激活机制改善了酶构象。局限在于22.77%的嵌入率仍有提升空间，且DHA与EPA的竞争性嵌入差异未深入探讨。从合成生物学角度看，若能将PLA1的底物选择性定向进化与发酵工艺优化结合，有望进一步提高DHA/EPA-PL的合成效率。
参考来源
Liu, M. (2026). Heterologous expression of phospholipase A1 gene in PichiaPink™ and optimization of catalytic conditions for phospholipid ω-3 fatty acid synthesis. Food Bioscience, 2026.
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108344
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108344