浒苔来源芽孢杆菌PHA合成潜力鉴定与发酵条件优化

来源：Identification of PHA synthesis potential and fermentation condition optimization of a Bacillus strain isolated from Ulva prolifera（Biomass and Bioenergy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

黄海绿潮的主要肇事藻种——浒苔（Ulva prolifera）的资源化利用与聚羟基脂肪酸酯（PHA）生产相结合，是海洋生物技术领域的新兴方向。本研究从浒苔样品中筛选出一株具有PHA合成能力的芽孢杆菌X-3，通过全基因组测序、基因簇分析和响应面优化，将PHB产量提升至1.383 g/L，较优化前提高56.76%。以浒苔为底物时，PHB产量达1.11 g/L，产率优于同类海藻发酵研究。

研究背景

PHA是微生物通过线性羟基脂肪酸聚合而成的可生物降解高分子材料，依据单体碳链长度分为短链和中长链两类。以聚羟基丁酸酯（PHB）为代表的短链PHA结晶度高，在营养失衡条件下作为微生物的储备能量物质合成，其降解速率优于聚乳酸，降解单体可参与代谢循环。与石油基塑料相比，PHA原料来源多样、碳排放更低，经共聚改性后可满足组织工程要求，已应用于支架、手术缝线、药物载体等医疗产品。然而，PHA的大规模生产仍面临成本瓶颈——革兰氏阴性菌（如Cupriavidus、Pseudomonas）的PHA积累依赖生长非偶联型过程，需严格营养限制，且内毒素污染风险限制了其在生物医学领域的应用。芽孢杆菌属菌株的PHA合成可呈生长偶联型，无需严格营养限制或前体补充，细胞壁不含脂多糖，更适合工业化生产。本研究从黄海绿潮浒苔中筛选PHA合成菌株，结合基因组分析与发酵工艺优化，探索浒苔资源化利用与生物塑料制造的协同路径。

研究方法

2.1 实验样品

用于分离PHA合成菌株的浒苔采集自江苏省大丰近岸海域。部分样品经干燥、粉碎成粉末后，储存于阴凉干燥处。

【数据】样品来源：江苏大丰近岸海域；处理方式：干燥粉碎

2.2 实验试剂

Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR Mix、2000 DNA Marker、Tris-乙酸-EDTA缓冲液、GelRed核酸染料购自生工生物工程（上海）股份有限公司；尼罗红（>97.0%）购自北京索莱宝科技有限公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、二甲基亚砜、葡萄糖、氯化钠、七水合硫酸镁、氯化钙、氯化钾、碳酸氢钠、甲醇、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、硫酸铵、氯化铵、浓硫酸、氯仿购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯；10%次氯酸钠购自国药集团化学试剂有限公司，化学纯；琼脂、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖、牛肉浸膏购自国药集团化学试剂有限公司，均为微生物用试剂；PHB标准品购自上海源叶生物科技有限公司。

【数据】试剂来源：生工生物、索莱宝、国药集团、源叶生物；尼罗红纯度：>97.0%；次氯酸钠浓度：10%

2.3 培养基与引物配制

富集培养基配方：葡萄糖20 g/L；氯化钠19.4 g/L；六水合氯化镁8.8 g/L；七水合硫酸铁3.24 g/L；氯化钙1.8 g/L；氯化钾0.55 g/L；碳酸氢钠0.16 g/L；酵母提取物1 g/L；胰蛋白胨5 g/L；溶剂为去离子水。该配方中添加15 g/L琼脂制成固体平板培养基1。

种子培养基配方：七水合硫酸镁0.3 g/L；磷酸氢二钾4.3 g/L；磷酸二氢钾2.5 g/L；氯化钠10 g/L；葡萄糖8 g/L；酵母提取物3 g/L；溶剂为去离子水。

发酵培养基配方：七水合硫酸镁0.3 g/L；磷酸氢二钾4.3 g/L；磷酸二氢钾2.5 g/L；氯化钠10 g/L；葡萄糖10 g/L；酵母提取物4 g/L；溶剂为去离子水。该配方中添加15 g/L琼脂制成固体平板培养基2。

改良种子培养基配方：七水合硫酸镁0.3 g/L；磷酸氢二钾4.3 g/L；磷酸二氢钾2.5 g/L；氯化钠10 g/L；葡萄糖5 g/L；酵母提取物1.5 g/L；溶剂为去离子水。

实验所用引物列于表SA1，均由上海迈普生物科技有限公司合成。

【数据】富集培养基：葡萄糖20 g/L、NaCl 19.4 g/L、酵母提取物1 g/L、胰蛋白胨5 g/L；种子培养基：葡萄糖8 g/L、酵母提取物3 g/L；发酵培养基：葡萄糖10 g/L、酵母提取物4 g/L；琼脂添加量：15 g/L

2.4 PHA合成菌株的筛选、分离与鉴定

#### 2.4.1 PHA合成菌株的筛选

配制富集培养基并高压灭菌备用。精确称取10 mg尼罗红，溶于1 mL二甲基亚砜中，配制成尼罗红染色液。取适量新鲜浒苔样品置于无菌海水中，振荡过夜。将适量含菌海水加入液体富集培养基中，于30 °C、180 rpm振荡培养至培养基变浑浊。将富集后的菌液梯度稀释后涂布于固体平板培养基上。挑取单菌落多次传代纯化，直至划线平板上无杂菌分离。菌株纯化培养后，在平板上划线。无菌条件下挑取一环菌落，在平板上标记后加入含1 mL无菌水的离心管中，吹打重悬，加入3 μL 10 mg/mL尼罗红染色液，避光染色30 min。10,000 rpm离心5 min（5810R高速离心机，Eppendorf（上海）国际贸易有限公司），弃上清，加入1 mL无菌水洗涤，重复上述步骤两次。取适量染色菌液，在暗室中采用Tx-red滤光片于荧光显微镜下观察。选出有明显荧光的细菌进行纯培养及后续实验。

【数据】尼罗红染色液：10 mg尼罗红/1 mL DMSO；染色条件：3 μL 10 mg/mL尼罗红染液、避光30 min；离心：10,000 rpm、5 min；培养条件：30 °C、180 rpm

#### 2.4.2 细菌16S rDNA鉴定

取适量纯化后的尼罗红阳性菌接种于含1 mL富集培养基的离心管中，30 °C过夜培养。使用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，采用Taq PCR Mix进行基因扩增（Mastercycler nexus平板PCR仪，Eppendorf（上海）国际贸易有限公司）。扩增基因为16S rDNA，正向引物和反向引物分别为27F和1492R（表SA1）。PCR扩增体系（25 μL）：PCR Mix 12.5 μL；27F 1 μL；1492R 1 μL；模板DNA 1 μL；ddH₂O 9.5 μL。扩增程序：95 °C预变性5 min；30个循环扩增（94 °C变性30 s，57 °C退火30 s，72 °C延伸90 s）；72 °C终延伸10 min。配制电泳缓冲液和凝胶。将扩增产物加入样品孔，120 V恒压电泳20 min（PowerPac Basic核酸电泳仪，Bio-Rad Laboratories（上海）有限公司）。电泳后将凝胶转移至凝胶成像系统（Tanon 1600，上海天能科技有限公司）观察条带。3株菌的16S rDNA扩增产物采用Sanger法测序。将所得基因序列上传至美国国家生物技术信息中心（NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov），与NCBI数据库中其他海洋细菌的16S rDNA序列一同保存为fasta格式。使用MEGA-X构建邻接法系统发育树。采用ClustalW进行多重序列比对，核苷酸替代模型为Tamura 3，启发式搜索随机添加1000次。

【数据】PCR体系（25 μL）：PCR Mix 12.5 μL、引物各1 μL、模板1 μL、ddH₂O 9.5 μL；扩增程序：95 °C 5 min预变性；94 °C 30 s/57 °C 30 s/72 °C 90 s × 30循环；72 °C 10 min；电泳：120 V、20 min

#### 2.4.3 PHA合成菌株的复筛

根据16S rDNA比对确定的菌种，在NCBI中搜索相应物种全基因组序列中的关键PHA合成基因phaC。以所得序列为模板，使用Primer Premier 5设计引物。对于无完整基因数据库的物种，使用通用引物进行扩增，初步检测其PHA合成能力。使用Taq PCR Mix进行基因扩增，引物为F(Ⅰ)、R(Ⅰ)；F(Ⅱ)、R(Ⅱ)；F(Ⅳ)、R(Ⅳ)（表SA1）。PCR扩增体系（25 μL）：PCR Mix 12.5 μL；27F 1 μL；1492R 1 μL；模板DNA 1 μL；ddH₂O 9.5 μL。扩增程序：95 °C预变性5 min；30个循环扩增（94 °C变性30 s，50 °C退火30 s，72 °C延伸50 s）；72 °C终延伸10 min。扩增产物采用Sanger法测序。将菌株X-3的phaC基因序列导入MEGA-X，与NCBI数据库中的phaC基因序列进行比对。共38株细菌参与系统发育分析，涵盖编码四种类型PHA合酶亚基C（PhaC）蛋白的基因序列。构建邻接法系统发育树。采用ClustalW进行多重序列比对，核苷酸替代模型为Tamura 3，启发式搜索随机添加1000次。

【数据】PCR体系（25 μL）：PCR Mix 12.5 μL、引物各1 μL、模板1 μL、ddH₂O 9.5 μL；扩增程序：95 °C 5 min预变性；94 °C 30 s/50 °C 30 s/72 °C 50 s × 30循环；72 °C 10 min；系统发育分析菌株数：38株

#### 2.4.4 胞内产物提取与检测

取适量菌株X-3接种于富集培养基中活化。将菌液置于摇床中，30 °C、180 rpm培养3天。离心收集菌体，在−80 °C超低温冰箱中预冻，然后转移至冷冻干燥机中冻干，收集冻干菌体。后续产物提取与检测步骤按原文继续。

【数据】活化培养：30 °C、180 rpm、3天；预冻温度：−80 °C

研究结果

3.1 PHA合成菌株的筛选与产物分析

#### 3.1.1 PHA合成菌株的筛选

尼罗红能与胞内脂质结合显色。菌株激发光越强，脂质含量越高，含PHA的可能性越大。从海水样品中分离纯化的20余株细菌，用新鲜配制的尼罗红染色液染色后，于荧光显微镜（80i，尼康仪器（上海）有限公司）下观察。发现其中3株菌能发出明亮的橙红色荧光，与周围暗红色背景区分明显，被判定为疑似PHA合成菌，命名为X-3、H-9和MT-1（图SA1）。

【数据】筛选菌株总数：20余株；阳性菌株：3株（X-3、H-9、MT-1）

#### 3.1.2 PHA合成菌株的16S rDNA鉴定

采用通用引物扩增3株菌的16S rDNA产物，Sanger测序获得序列长度分别为1465 bp（X-3）、1448 bp（H-9）和1449 bp（MT-1）（图SA2）。序列比对与系统发育分析显示，X-3聚类于芽孢杆菌属（Bacillus），H-9聚类于交替单胞菌属（Alteromonas），MT-1聚类于红树林杆菌属（Mangrovibacter）（图SA3）[23]。三株菌分别命名为Bacillus sp. X-3、Alteromonas sp. H-9和Mangrovibacter sp. MT-1，其16S rDNA序列已上传至NCBI，登录号分别为OR091336、OR094235和OR094234。

【数据】16S rDNA序列长度：X-3为1465 bp、H-9为1448 bp、MT-1为1449 bp；NCBI登录号：OR091336、OR094235、OR094234

#### 3.1.3 phaC基因系统发育分析

收集具有PHA合成能力的典型菌株phaC基因序列，构建phaC系统发育树（图1）。发现编码Ⅰ型phaC基因的细菌分布广泛，多属于变形菌门，进化距离远、进化分支复杂。Ⅱ型phaC基因多分布于变形菌门的假单胞菌属，与编码Ⅰ型phaC基因的细菌属于同一进化分支。Ⅲ型phaC基因分布于变形菌门和部分古菌中。Ⅳ型phaC基因多分布于厚壁菌门，芽孢杆菌属最为典型。系统发育树显示，Bacillus sp. X-3的phaC基因为Ⅳ型。与Ⅰ型和Ⅱ型phaC不同，Ⅲ型和Ⅳ型phaC分别需要phaE和phaR亚基的辅助才能完成PHA聚合的催化[24]，且进化距离更近、进化路径清晰，同属细菌携带的基因保守性更高。此外，古菌Candidatus nitrosopumilus的phaC基因序列在NCBI数据库中被归类为编码Ⅲ型phaC，但根据本节构建的系统发育树，其进化路径位于Ⅲ型和Ⅳ型phaC之间的分支上，与Ⅳ型phaC聚为一类。

【数据】phaC类型：X-3为Ⅳ型；系统发育树构建方法：邻接法、Tamura 3模型、1000次随机添加

#### 3.1.4 Bacillus sp. X-3的发酵与产物检测

将Bacillus sp. X-3的提取物甲基化后进行GC-MS分析（图SA4）。将样品质谱图与NIST11.L质谱库中数据比对，发现酯化产物中含有巴豆酸甲酯（图SA5），表明Bacillus sp. X-3能发酵产生PHB。采用次氯酸钠-氯仿法提取Bacillus sp. X-3的胞内产物，氯仿挥发后获得乳白色PHB薄片（图SA6）。

【数据】产物鉴定方法：GC-MS；检测产物：巴豆酸甲酯；提取方法：次氯酸钠-氯仿法

3.2 菌种与PHA合成基因结构分析

#### 3.2.1 次级代谢产物基因簇分析

Bacillus sp. X-3基因组的测序质量和基本信息见补充材料。代谢通路中编码次级代谢产物生物合成酶的基因通常成簇分布于染色体上。对Bacillus sp. X-3的基因组分析揭示了8个次级代谢产物生物合成基因簇（表SA3），包括1个杂合基因簇（Region 1.1）和仅1个具有完整同源注释的基因簇（Region 1.2），该基因簇为铁载体类型，大小为13,667 bp（图SA7）。它与多种芽孢杆菌（如Bacillus tropicus和Bacillus cereus）中的petrobactin生物合成基因簇一致，相似度高达100%。预测其合成铁载体petrobactin，可参与石油烃的生物降解。

【数据】次级代谢产物基因簇数量：8个；铁载体基因簇大小：13,667 bp；与已知基因簇相似度：100%

#### 3.2.2 同源基因平均核苷酸一致性分析

基于Bacillus sp. X-3基因组的注释结果，通过与其近缘微生物的同源基因片段比对评估ANI。ANI最高的三株菌（均>95）为Bacillus tropicus FDAARGOS_782（ANI 98.9）、Bacillus tropicus EMB20（ANI 98.5）和Bacillus tropicus CK18（ANI 98.1），进一步确认Bacillus sp. X-3为Bacillus tropicus [25]。

【数据】ANI值：FDAARGOS_782为98.9、EMB20为98.5、CK18为98.1；判定阈值：ANI>95

#### 3.2.3 PHA合成基因簇分析

基于Bacillus sp. X-3基因组的注释结果，搜索并绘制参与PHA合成的基因簇，发现其由6个基因组成（图2a）。4个基因负责PHA合成：phaA编码β-酮硫解酶（PhaA），在基因组中与其他基因距离较远（表SA4）；phaB编码NADPH依赖型乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB）；phaC编码PhaC；phaR编码PHA合酶亚基R（PhaR）。具体过程如下：来自三羧酸循环和糖酵解途径等其他中心代谢途径的乙酰辅酶A流入PHA合成途径，经PhaA催化裂解为乙酰乙酰辅酶A，再由PhaB还原为3-羟基丁酰辅酶A，最后由PHA合酶聚合形成PHB。2个基因负责PHA合成的调控：phaP编码PHA包含体蛋白，在细胞质中起隔离和稳定作用[26]；phaQ编码PHA响应控制因子，在转录和翻译水平上作为响应通讯器，在环境触发下控制PHA颗粒的表达、大小、分布和数量[27]。

【数据】PHA合成基因簇组成：6个基因（4个合成基因+2个调控基因）；合成途径：乙酰辅酶A→乙酰乙酰辅酶A→3-羟基丁酰辅酶A→PHB

#### 3.2.4 PHA合成基因簇启动子预测

从Bacillus sp. X-3基因组中截取包含phaP、phaQ、phaR、phaB、phaC及各基因上游非编码序列的核苷酸序列，预测各基因的启动子及其对应的转录因子。BPROM预测到4个启动子区域，分别位于phaQ、phaR、phaB和phaC的上游。phaP与phaQ之间未预测到启动子区域。可能结合到phaQ上游启动子区域的转录因子为RpoD17、ArgR2、LexA和Fis；可能结合到phaR上游启动子区域的转录因子为RpoD15、Ihf、ArcA和RpoD17（图2b）。可能结合到phaB上游启动子区域的转录因子为ArcA和Crp（图2c）。可能结合到phaC上游启动子区域的转录因子为OmpR和LexA（图2d）。以上所有转录因子均在Bacillus sp. X-3的蛋白质注释中查询确认。

【数据】预测启动子数量：4个；位置：phaQ、phaR、phaB、phaC上游；转录因子：RpoD17、ArgR2、LexA、Fis、RpoD15、Ihf、ArcA、Crp、OmpR

3.3 *Bacillus* sp. X-3合成PHB的培养条件优化

#### 3.3.1 PHB浓度标准曲线

PHB浓度梯度与吸光度的标准曲线如图SA8所示，回归方程为y = 0.0214x + 0.1814（R² = 0.9987）（x：PHB浓度，y：吸光度）。PHB浓度在5–30 mg/L范围内呈良好线性关系。

【数据】回归方程：y = 0.0214x + 0.1814；R² = 0.9987；线性范围：5–30 mg/L

#### 3.3.2 碳源类型对PHB产量的影响

Bacillus sp. X-3对五种碳水化合物（海藻酸钠、浒苔多糖、羧甲基纤维素钠、葡萄糖和果糖）的利用情况如图3a所示。Bacillus sp. X-3对单糖的转化率显著高于多糖；以葡萄糖为碳源时，Bacillus sp. X-3的菌体干重和PHB含量最高。

【数据】碳源种类：海藻酸钠、浒苔多糖、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、果糖；最优碳源：葡萄糖

#### 3.3.3 氮源类型对PHB产量的影响

Bacillus sp. X-3对氮源的利用情况如图3b所示（原文后续部分未在节选中详述）。

【数据】原文未详述

讨论与解读

讨论要点

革兰氏阳性菌和阴性菌中均存在PHA产生菌，后者研究最多，如Cupriavidus、Pseudomonas和重组大肠杆菌[28]。但革兰氏阴性菌在生产应用中有一定局限性：其PHA积累呈生长非偶联型，培养时需先提供过量碳源促进菌体生长，再限制生长因子以转化PHA，严格的营养要求增加了生产成本[29]。此外，PHA在下游加工中可能被革兰氏阴性菌的脂多糖污染[30]，引发免疫原性反应，不适用于生物医学工程。相比之下，芽孢杆菌的PHA合成可呈生长偶联型，无需严格营养限制或前体补充[31]，从工业生产角度看是有利的特性。而且革兰氏阳性菌细胞壁不含脂多糖，芽孢杆菌合成的聚合物本身已被证明经过严格评估后可用于生物制品制造[32]。尼罗红染料能快速高灵敏度地识别PHA，但存在假阳性——例如，对2株不能合成PHA的阴性菌进行该染料染色后显示（原文此句未完整呈现）。

编译者解读

本研究巧妙地将黄海绿潮藻类浒苔的资源化利用与PHA生物合成耦合，一箭双雕。方法选择上，以尼罗红荧光筛选结合phaC基因系统发育分析锁定Ⅳ型PHA合酶，再通过全基因组ANI鉴定菌种，层层递进、证据链完整。值得关注的是，Bacillus sp. X-3的PHA合成呈生长偶联型，规避了革兰氏阴性菌内毒素污染风险，为生物医学级PHA生产提供了更安全的宿主选择。以浒苔水解液为底物时PHB产量达1.11 g/L，虽绝对值不算高，但实现了废弃物资源化与生物塑料合成的协同。后续若能通过代谢工程强化PhaA/PhaB/PhaC表达量或调控PhaQ响应机制，产量仍有提升空间。

参考来源

期刊：Biomass and Bioenergy, 2026

DOI: 10.1016/j.biombioe.2026.109625

DOI: 10.1016/j.biombioe.2026.109625