来源：Efficient quenching activity and thermostability of N-acyl homoserine lactonase AiiA against fish spoilage mediated by Pseudomonas fluorescens via rational design（Food Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
N-酰基高丝氨酸内酯酶（AHL-lactonase）可通过淬灭群体感应（QS）信号来抑制细菌腐败，但其催化效率低下限制了实际应用。本研究基于计算机辅助结构分析、分子动力学模拟与能量计算，对来自芽孢杆菌的AiiA内酯酶进行理性设计，获得一个高效突变体AiiAA130T。该突变体对短链AHL（C4-HSL和C6-HSL）的降解能力显著增强，热稳定性提高，并能有效抑制荧光假单胞菌PF07的生物被膜形成及多种腐败表型，将大黄鱼鱼片的货架期延长2天。
研究背景
微生物性食品腐败对全球粮食安全和环境可持续性构成重大威胁。尽管食品工业实施了大量质控措施，微生物腐败仍导致全球约四分之一食品供应损失，每年多达30%的渔获产品被浪费。假单胞菌属是食品加工、运输和储存过程中的优势腐败菌之一，凭借良好的嗜冷特性、适应性和强生物被膜形成能力，污染各种冷藏食品。其腐败相关表型受由N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）介导的群体感应系统严密调控：当AHLs分泌达到阈值浓度时，与LuxR型受体结合形成复合物，触发腐败和生物被膜相关基因的转录，促进水解酶分泌和生物被膜形成，加速水产品变质。因此，靶向淬灭AHLs以破坏QS系统是控制食品腐败的有效策略。天然无毒的AHL内酯酶虽被视为有前景的QS淬灭工具，但其催化性能不佳仍是实际应用的主要障碍。
研究方法
2.1 材料、菌株与培养条件
新鲜大黄鱼（Larimichthys crocea）在冷藏条件下购买，个体重量为500 g ± 50 g，购自当地海鲜市场，1小时内冰上运至实验室。磷酸盐缓冲液（PBS，0.1 M，pH 8.0）、异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）、氯霉素（Cm）和硫酸卡那霉素购自阿拉丁生化科技股份有限公司（中国上海）。七种N-酰基-L-高丝氨酸内酯（AHL）标准品购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），包括N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯（C4-HSL，≥97%）、N-己酰基-L-高丝氨酸内酯（C6-HSL，≥97%）、N-辛酰基-L-高丝氨酸内酯（C8-HSL，≥97%）、N-癸酰基-L-高丝氨酸内酯（C10-HSL，≥97%）、N-十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯（C12-HSL，≥97%）、N-十四烷酰基-L-高丝氨酸内酯（C14-HSL，≥97%）和N-十六烷酰基-L-高丝氨酸内酯（C16-HSL，≥97%）。本研究中使用的所有其他化学品均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。荧光假单胞菌PF07分离自腐败鱼（前期研究），在Luria-Bertani（LB）培养基中于30°C培养。大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）购自诺唯赞生物科技股份有限公司（中国南京），在LB培养基中于37°C培养，必要时添加适当抗菌素。紫色色杆菌CV026由杨博士惠赠（浙江农林大学，中国杭州），在含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中于30°C培养。作为紫色色杆菌ATCC 31532的mini-Tn5突变体，CV026不产生内源性AHLs，但响应外源短链AHLs（C4∼C8-HSL）合成紫色紫色杆菌素。重组质粒pET-28a-AiiA由饶博士惠赠（西华大学食品科学与生物工程学院，中国成都）。该质粒含有芽孢杆菌来源AiiA内酯酶的全长基因（本研究亲本酶），携带C端6×His标签用于蛋白纯化和氯霉素抗性基因（Cmr）用于宿主菌株筛选。
【数据】大黄鱼重量：500 g ± 50 g；PBS浓度：0.1 M，pH 8.0；AHL标准品纯度：≥97%；PF07培养温度：30°C；E. coli培养温度：37°C；CV026培养条件：30°C、50 μg/mL卡那霉素；质粒标签：C端6×His
2.2 AiiA内酯酶的理性设计
#### 2.2.1 AiiA与不同底物的分子对接
亲本AiiA内酯酶序列通过AlphaFold 2中的Modeller模块进行同源建模。模型质量通过SWISS-MODEL的Structure Assessment工具验证。七种AHL（C4∼C16-HSL）的3D结构从NCBI的PubChem获取。使用Discovery Studio（DS，版本2021）进行对接。不同受体-配体结合复合物的对接构象最终在CHARMm力场中生成，其他对接参数设为默认值。
【数据】建模工具：AlphaFold 2/Modeller；对接软件：Discovery Studio 2021；力场：CHARMm；AHL种类：7种（C4∼C16-HSL）
#### 2.2.2 分子动力学（MD）模拟
使用AmberTools 2022进行1-μs无监督MD模拟和100 ns对接偏向MD模拟，方法如前人所述并稍作修改。AiiA-AHLs复合物的MD模拟使用AMBER ff19SB力场。每个复合物溶剂化在截断八面体水盒（OPC）中，复合物到盒边缘的缓冲距离为8 Å，并用四个钠离子中和。能量最小化和平衡后，在NPT系综下进行100 ns无约束MD模拟。轨迹每10 ps保存一次。每次模拟进行三个独立重复以确保可重复性。使用分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）方法计算蛋白组分在结合不同底物时的个体能量。从100 ns生产轨迹中每隔0.1 ns提取快照用于MM-PBSA计算。自由能景观（FEL）分析如前人所述进行。沿复合物前两个主成分的FEL使用从MD模拟获得的均方根偏差（RMSD）和回转半径（Rg）结果生成。详细参数见补充材料。
【数据】MD模拟时间：1 μs无监督+100 ns偏向；力场：AMBER ff19SB；水盒：OPC截断八面体；缓冲距离：8 Å；钠离子：4个；系综：NPT；轨迹保存间隔：10 ps；重复次数：3次独立重复；MM-PBSA快照间隔：0.1 ns
#### 2.2.3 AiiA的虚拟饱和突变
虚拟饱和突变在DS中进行，方法如前人所述并稍作修改。使用DS中的Calculate Mutation Energy协议将每个靶标位点突变为其他19种氨基酸。最终基于突变结合能选择十个突变进行定点突变。
【数据】突变策略：每个位点突变为19种氨基酸；筛选工具：Calculate Mutation Energy；最终选择突变数：10个
2.3 AiiA定点突变
使用QuickMutation™定点突变试剂盒（Beyotime，#D0206M）按照制造商说明书构建十个aiiA基因重组载体（2.2.3节的靶标突变）。引物和模板载体列于补充表1。产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆在含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上筛选。测序验证后，将pET28a-AiiA质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）进行蛋白表达。含有pET28a-AiiA的大肠杆菌BL21（DE3）在37°C培养至OD600达到0.5–0.6。加入0.5 mM IPTG诱导AiiA表达，随后在16°C孵育24小时。离心（4°C，10000×g，15 min）后，通过超声破碎仪破碎细胞，再次离心收集上清。使用His-tag蛋白纯化试剂盒（Beyotime，#P2229S）按说明书纯化His标记的重组酶。经12% SDS-PAGE鉴定后，纯化野生型（AiiAWT）或突变体酶，然后用PBS缓冲液透析过夜以去除残余咪唑，最后通过真空冷冻干燥浓缩。使用改良Bradford蛋白测定试剂盒（生工生物，中国上海）测定蛋白浓度。
【数据】筛选抗生素：50 μg/mL硫酸卡那霉素；诱导条件：0.5 mM IPTG、16°C、24 h；离心条件：4°C、10000×g、15 min；SDS-PAGE：12%；纯化试剂盒：His-tag Protein Purification Kit (#P2229S)
2.4 AiiA及其突变体的酶活测定
AiiA及其突变体对C4-HSL的活性首先通过紫色色杆菌CV026牛津杯法检测。将牛津杯置于含有105 CFU/mL CV026培养物和50 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，向每个杯中加入200 μL AiiA酶溶液（含或不含AHLs）。30°C孵育24小时后，CV026平板上的紫色圈表示残余AHLs含量。此外，通过改良比色法测定AiiAA130T突变体对C4∼C16-HSL的相对活性。最适pH（pH 2–8，100 mM柠檬酸/磷酸缓冲液）、最适温度（5°C–70°C）、60°C热稳定性、30°C和4°C储存稳定性以及动力学参数均使用改良方法测定。测试酶的最适pH使用1 mM C4-HSL作为底物，在不同pH条件（pH 2–8）下于30°C反应20 min测定。测试酶的最适温度通过将酶与1 mM C4-HSL在各自最适pH下、不同温度（5至70°C）反应20 min测定。测试酶分别在4°C和30°C储存0、12、24、48、72、96和120 h。然后通过将纯化酶在含1 mM C4-HSL的PBS缓冲液中于30°C孵育20 min测定储存稳定性。使用等体积PBS缓冲液代替纯化酶作为对照组。反应后，AiiA酶在沸水中灭活10 min，内酯使用2.3节所述比色法定量。所有反应进行三次重复。对于动力学参数，两种AiiA的酶反应按照纯化酶的标准反应体系，使用不同浓度（0–2.0 mM）的C4-HSL进行，然后在沸水中灭活10 min。
【数据】CV026检测浓度：105 CFU/mL；酶液体积：200 μL；孵育条件：30°C、24 h；pH范围：2–8（100 mM柠檬酸/磷酸缓冲液）；温度范围：5–70°C；底物浓度：1 mM C4-HSL；反应时间：20 min；储存时间点：0–120 h；动力学底物浓度：0–2.0 mM；灭活条件：沸水10 min
研究结果
3.1 基于结构分析和MD模拟的突变热点鉴定
#### 3.1.1 AiiAWT对荧光假单胞菌PF07产生的AHLs的降解活性
HPLC-MS/MS显示荧光假单胞菌PF07分泌四种酰基高丝氨酸内酯（AHLs）：C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL和3-氧代-C4-HSL（补充图1）。定量分析表明C4-HSL浓度显著高于其他AHLs（P < 0.001），确认其在PF07的QS系统中的主导作用。经AiiAWT处理后，PF07的C4-HSL和总AHLs仅分别下降15.81%和25.58%，揭示了对主要C4-HSL的降解能力有限。这与Kyeong等人（2015）的前期研究一致，该研究报告AiiAWT对C10-AHL的kcat/Km（2.10 × 105 M−1 S−1）比对C4-AHL（4.38 × 103 M−1 S−1）高约50倍。AiiAWT与C4∼C16-HSL的分子对接显示，AiiA-C4-HSL复合物比其他AHLs具有更高的CDOCKER能量（补充表2），前10个构象之间的CDOCKER能量差异最小。这表明由于缺乏稳定的氢键或疏水相互作用，AiiA-C4-HSL结合亲和力弱，导致C4-HSL在结合位点之间"漂浮"且催化效率低下。高效的酶-底物结合需要精确的构象匹配和稳定的分子间作用力。为解决这一缺陷，我们整合蛋白质结构分析与无偏或基于对接的MD模拟来识别突变位点，以增强C4-HSL识别和AiiA降解能力以及结构稳定性。
【数据】PF07分泌AHLs：C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、3-oxo-C4-HSL；C4-HSL显著性：P < 0.001；AiiAWT处理后C4-HSL下降：15.81%；总AHLs下降：25.58%；AiiAWT对C10-AHL的kcat/Km：2.10 × 105 M−1 S−1；对C4-AHL的kcat/Km：4.38 × 103 M−1 S−1
#### 3.1.2 对接引导的热点筛选
分子对接显示AiiA的配体始终占据酶的中心空腔，靠近催化Zn2+离子（图1A），与前期AiiA结构研究一致，确认了其活性位点保守性和关键水解相关残基。AiiA-C4-HSL结合口袋由Ala206、Ile73、His169、Tyr194、Leu16、Leu33、Cys14、His235、Phe107和Asp108残基组成。其中几个残基构成AiiA保守催化核心的一部分。值得注意的是，H104-A110片段含有Zn2+结合基序HXHXDH（His104、His106和His109），这对AHL内酯酶的催化功能至关重要。相比之下，非保守的外周残基（Ala206、His235、Leu16、Leu33和Ile73）位于底物进入通道。这些残基辅助底物进入而非直接催化，因此代表了修饰底物特异性的理想突变位点。值得注意的是，Ala206突变为谷氨酸（A206E）在28°C下催化活性提高34.4%，验证了其潜力。未报道的外周残基Leu16、Leu33和Ile73被筛选为候选位点，以避免破坏催化核心并通过调节口袋疏水性或体积来改善短链底物结合。
【数据】Zn2+结合基序：HXHXDH（His104、His106、His109）；A206E突变体活性提升：34.4%（28°C）；结合口袋残基：Ala206、Ile73、His169、Tyr194、Leu16、Leu33、Cys14、His235、Phe107、Asp108
#### 3.1.3 MD模拟引导的热点验证
进行1-μs无监督MD模拟以探索AHL底物的进入路径和动态行为，无需任何预定义构象或偏向势。AHL动力学显示短链C4-HSL扩散迅速，未能与AiiA形成稳定相互作用。C6-HSL未进入中心空腔，而是持续结合一个柔性环（残基125–147），表明该柔性环充当中间配体结合平台。相比之下，较长链AHL（C10-HSL ∼ C16-HSL）容易进入并与另外两个柔性环（残基16–33和54–76）相互作用（补充视频1）。因此，这表明AHLs与AiiA之间的结合具有链长依赖性，与其体外观察到的催化效率一致。这些观察结果也支持"捕获-引导"机制，即AHL首先结合柔性环，然后移动至活性位点，这在底物识别或转运中很常见。在100 ns基于对接的MD模拟中，C4-HSL在AiiA-C4-HSL系统中迅速离开结合口袋并在环125–147附近稳定。离开空腔后，C6-HSL短暂结合环125–147，经过环54–76，然后重新进入空腔，表现出与无监督MD一致的不良结合稳定性。相比之下，较长链AHL在稳定于活性位点前同样采样了环16–33、54–76和125–147附近的区域（补充视频2）。此外，RMSF分析确认这三个环是AiiA最灵活的区域（图1B），包括主要与C6-HSL对接的环125–147、转运较长链AHL（C10∼C16）的环54–76，以及作为环催化腔疏水门的环16–33（图1C）。它们共同作为底物识别和定位的"门控"，通过经典"诱导契合"机制介导构象调整。因此，此类柔性区域代表酶优化的理想靶标。结合对接、无监督MD和基于对接的MD结果，三个柔性环16–33、54–76和125–147被确定为关键的底物引导元件，被选择用于后续突变。
【数据】无监督MD时间：1 μs；C4-HSL行为：快速扩散、未形成稳定相互作用；C6-HSL结合位点：环125–147；长链AHL结合位点：环16–33和54–76；RMSF确认的柔性区域：3个环
#### 3.1.4 虚拟饱和突变
DS中的两个模块Calculate Mutation Energy（Binding）和Calculate Mutation Energy（Stability）用于评估突变对AiiA底物结合亲和力和结构稳定性的影响。根据默认阈值，ΔE ∈ [−0.5, 0.5] kcal/mol被分类为"STABILIZING"（影响可忽略），ΔE < −0.5 kcal/mol被视为"NEUTRAL"（潜在改进），ΔE > 0.5 kcal/mol被视为"DESTABILIZING"（结构或功能破坏）。这种基于能量的方法广泛用于理性设计以预测突变影响并减少实验工作量。对64个候选残基使用10个AiiA-C4-HSL对接构象进行饱和突变，生成1,216个突变体。通过两个模块的初步筛选鉴定出185个具有增强结合（ΔE < −0.5 kcal/mol）和稳定性的突变体，其中31个在多个对接构象中一致。如突变能量分布热图所示（补充图2），这31个突变中的许多复合物与C6∼C16-HSL的能量增加，表明对非C4底物的亲和力或稳定性降低，这是蛋白质工程中常见的权衡。例如，AiiAF64W对C4-HSL的kcat/Km值是AiiAWT的2.25倍，但对C10-HSL降至0.15倍。为平衡效率和稳定性，进一步筛选31个突变体在所有测试AHL中的结合和稳定性。最终确定10个有前景的突变靶标（图1D）。
【数据】ΔE阈值：±0.5 kcal/mol；候选残基数：64个；对接构象数：10个；总突变体数：1,216个；增强突变体数：185个；跨构象一致突变体数：31个；最终选择突变体数：10个；AiiAF64W对C4-HSL kcat/Km：WT的2.25倍；对C10-HSL：WT的0.15倍
3.2 具有增强QQ活性的AiiA突变体筛选
MD模拟显示10个突变体与C4-HSL的结合自由能为−2.33至−15.86 kcal/mol，而AiiAWT为−2.23 kcal/mol（图2A），表明热力学稳定性显著提高。具有低ΔE（<−1 kcal/mol，如A130T、E136H、E136I和C141K）的突变体与C4-HSL的结合自由能明显较低，验证了有效的突变策略。随后，所有10个AiiA突变体均在大肠杆菌BL21(DE3)中构建和表达（补充图3）。值得注意的是，R134Q、R134N、E136I、E136W和M138P与WT相比可溶性表达降低，可能是由于折叠或结构稳定性受损。此外，通过CV026生物测定初步比较了AiiAWT和10个突变体降解的残余C4-HSL，显示所有10个突变体与AiiAWT相比紫色圈直径明显减小（图2B）。在这些突变体中，R134Q、E136H、C141K和A130T分别使晕圈减小71.02%、70.55%、72.35%和近100%（P < 0.05），因为AiiAA130T未见可见晕圈。
【数据】AiiAWT结合自由能：−2.23 kcal/mol；10个突变体结合自由能范围：−2.33至−15.86 kcal/mol；晕圈减小：R134Q 71.02%、E136H 70.55%、C141K 72.35%、A130T ~100%；显著性：P < 0.05
3.3 AiiAWT和AiiAA130T蛋白的催化性质
（本节原文未提供完整内容）
【数据】原文未详述
3.4 AiiAWT和AiiAA130T与C4-HSL的分子对接和MD分析
（本节原文未提供完整内容）
【数据】原文未详述
3.5 AiiAA130T对荧光假单胞菌PF07腐败表型和基因表达的增强抑制作用
（本节原文未提供完整内容）
【数据】原文未详述
3.6 AiiAA130T和AiiAWT处理对4°C冷藏大黄鱼品质的影响
（本节原文未提供完整内容）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过计算机辅助结构分析、分子动力学模拟和能量计算相结合的策略，成功实现了AHL内酯酶AiiA的理性设计改造。研究鉴定了三个高柔性区域（残基16–33、54–76和125–147）作为底物识别和定位的关键位点，并通过虚拟饱和突变从1,216个突变体中筛选出10个候选突变体。其中AiiAA130T表现最优：对短链AHL（C4-HSL和C6-HSL）的降解能力最强，热稳定性较野生型提高。在荧光假单胞菌PF07中，AiiAA130T将大部分AHLs淬灭至不可检测水平，生物被膜生物量、胞外多糖、胞外蛋白含量和胞外蛋白酶活性分别被抑制64.63%、48.86%、51.85%和61.50%，均显著优于AiiAWT（46.51%、29.08%、23.55%和19.5%），且不影响细菌生长。qRT-PCR证实16个关键QS和生物被膜相关基因的转录水平显著下调（P < 0.05）。在实际应用中，AiiAA130T有效延缓大黄鱼鱼片品质劣变并将货架期延长2天，而AiiAWT仅表现出轻微保鲜效果。
编译者解读
该研究展示了计算驱动的酶工程在食品保鲜领域的典型应用范式——通过"结构解析→动态模拟→饱和突变→实验验证"的完整闭环，将理性设计从概念落到实处。值得关注的是，研究者没有盲目追求极致活性，而是兼顾了底物谱宽度与热稳定性，这对实际冷链场景至关重要。A130T位点位于柔性环区域而非催化核心，这种"外围修饰"策略保留了催化机制完整性，是降低工程风险的有效思路。局限在于，研究主要聚焦C4-HSL这一主导信号分子，对其他AHLs的协同效应讨论有限；此外，从实验室酶改造到工业化应用之间，仍需要大规模生产成本和安全性评估数据的支撑。
DOI: 10.1016/j.fm.2025.105002