来源：Bioconversion of carboxylic acids derived from Kraft black liquor into lipids by Yarrowia lipolytica（Journal of Cleaner Production）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
全球每年产生约13亿吨硫酸盐黑液，传统燃烧处理带来环境负担。本研究以解脂耶氏酵母为底盘，将黑液酸沉淀回收木质素后的残余液（LRKBL）作为底物，系统优化了C/N比、氮源类型及补料分批策略，最终实现脂质含量从38%提升至52%，油脂浓度翻倍。该策略为工业废液高值化与生物柴油原料替代提供了可行路径。
研究背景
化石燃料枯竭及其燃烧引发的环境与气候问题，迫使人类寻找可再生替代能源。生物柴油具有可再生、可生物降解、无毒且无需改装发动机即可直接使用等优点，目前约95%通过动物脂肪或植物油转酯化合成。然而，原料成本高昂、毁林与耕地占用、能源与食品工业竞争等伦理问题，限制了生物柴油的竞争潜力。微生物油脂（单细胞油，SCO）因其化学组成和能量价值与植物油高度相似，被视为极具前景的替代脂质来源。多种产油微生物（藻类、真菌、酵母）能够在胞内积累脂质滴。本研究聚焦于以硫酸盐黑液（KBL）这一造纸工业废液为可再生原料，通过解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）实现木质素回收与单细胞油联产，考察C/N比、氮源类型及细胞循环补料策略对油脂积累的影响。
研究方法
2.1 材料
本研究所用试剂均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州）：硫酸、甘油、酵母提取物、蛋白胨、尿素、甘氨酸、硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、甲醇、氯仿、三氟化硼甲醇溶液、氯化钾和氢氧化钠。此外，葡萄糖、琼脂和氯化钠购自VWR International（美国宾夕法尼亚州）。
2.2 硫酸盐黑液（KBL）
KBL来源于桉木，取自西班牙阿斯图里亚斯地区的一家造纸厂。样品在4–5°C下保存至使用，以保持其性质。
2.3 木质素回收
通过酸沉淀法从KBL中回收木质素，以部分纯化其中的羧酸。具体操作：缓慢逐滴加入5 M硫酸，直至pH达到3。随后将混合物离心（Heraeus, Multifuge X1, Thermo Fisher Scientific, 美国马萨诸塞州），8000 rpm离心20 min，分离液体与沉淀木质素。沉淀（含木质素组分）用酸化水洗涤三次，105°C干燥至恒重。收集上清液（LRKBL），用5 M NaOH溶液调节pH至6.5——根据研究组前期工作（Moreno et al., 2023），该值为解脂耶氏酵母培养的最适pH。最后，LRKBL储存于4–5°C备用。
2.4 微生物
产油酵母解脂耶氏酵母CECT 1240（野生型菌株）购自西班牙典型培养物保藏中心（西班牙瓦伦西亚），保存在40%（v/v）甘油溶液中，−80°C保存。发酵试验前，菌株在YPD营养琼脂平板（酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L）上30°C活化培养48 h。保藏培养物置于4–5°C，每两周传代一次。
2.5 种子液制备
挑取解脂耶氏酵母单菌落，接种至100 mL YPD液体培养基（组成同前）中，置于500 mL锥形瓶。锥形瓶在旋转摇床（Ecolan 70-R, Labolan, 西班牙纳瓦拉）上150 rpm、30°C培养12 h。该培养基中活跃增殖的细胞随后用作摇瓶SCO生产的种子接种物。
2.6 摇瓶培养
#### 2.6.1 分批培养
发酵实验设三组重复，使用500 mL锥形瓶。所有培养基经0.2 μm孔径过滤灭菌。锥形瓶经121°C、20 min高压灭菌后，无菌分装100 mL LRKBL（pH = 6.5）。随后，以10%（v/v）的比例接种经离心收集的种子液。锥形瓶置于旋转摇床（Ecolan 70-R, Labolan, 西班牙纳瓦拉）上，150 rpm、30°C培养。定期取样监测底物消耗与细胞生长。生物量通过离心（13000 rpm, 10 min）（Centrifuge 5424, Eppendorf, 德国汉堡）收集，无细胞上清液冷冻（−20°C）供后续分析。为优化解脂耶氏酵母在LRKBL中的培养条件，考察了不同C/N比（10、20、40、60、80、120、160和200）对SCO积累和细胞生物量产生的影响。培养基通过调整氮源含量（酵母提取物[11% N, w/w]）配制，依据LRKBL中乙酸和丙酸含量计算。此外，还考察了多种氮源类型对SCO生物转化过程的影响。采用先前优化的C/N比，评估不同有机氮源（蛋白胨[14% N, w/w]、酵母提取物[11% N, w/w]、尿素和甘氨酸）和无机氮源（硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵和硝酸铵）。
#### 2.6.2 补料分批培养
采用补料分批培养策略以期提高LRKBL产SCO的效率。生物转化过程设三组重复，使用100 mL先前优化的培养基。第一周期，以10%（v/v）的比例接种来自YPD种子培养的湿生物量。整个培养过程中密切监测生长曲线及乙酸和丙酸浓度。到达稳定期后，通过离心（13000 rpm, 10 min）（Heraeus, Multifuge X1, Thermo Fisher Scientific, 美国马萨诸塞州）分离培养基与细胞。随后，将分离的酵母细胞重新悬浮于新鲜发酵培养基（LRKBL）中，启动下一生长周期。本研究共进行五个周期。
2.7 分析方法
#### 2.7.1 生物量测定
发酵过程中，通过测量600 nm处光密度（OD600）（GENESYS™ 150 UV–Vis分光光度计, Thermo Fisher Scientific, 美国马萨诸塞州）确定细胞增殖情况，样品预先离心（13000 rpm, 10 min）。细胞干重测定：取5 mL培养液离心（条件同上），所得细胞用0.7%（w/v）NaCl溶液洗涤，90°C干燥至恒重。
#### 2.7.2 理化表征
羧酸浓度采用高效液相色谱（HPLC）（Agilent 1200, Agilent Technologies Inc., 美国加利福尼亚州）配示差折光检测器（RID）分析。Coregel ION-300色谱柱（Concise Separations, 美国加利福尼亚州）柱温维持75°C，采用等度洗脱模式，流动相为硫酸溶液（0.45 mM, pH 3.1），流速0.35 mL/min。总有机碳（TOC）使用TOC-V-CSH分析仪（Shimadzu Corporation, 日本京都）测定。镁和钾浓度使用883 Basic IC plus离子色谱仪（Metrohm, 瑞士黑里绍）测定，配备MetroSep C色谱柱（Metrohm, 瑞士黑里绍）。磷分析使用同一离子色谱仪，配备MetroSep A色谱柱（Metrohm, 瑞士黑里绍）。氮和铵浓度使用SKALAR SAN PLUS分段流动自分析仪（Skalar Analytical B.V., 荷兰布雷达）定量。pH值使用Eutech ION 700 pH计（Thermo Fisher Scientific, 美国马萨诸塞州）在环境温度下测定。运动粘度和密度分别在环境温度和大气压下，使用Cannon-Fenske逆流粘度计（VWR International, 美国宾夕法尼亚州）和比重瓶（VWR International, 美国宾夕法尼亚州）测定。化学需氧量（COD）按照标准方法（Lipps et al., 2023）所述程序评估。光谱吸收系数（SAC）在三个波长（436、525和620 nm）（GENESYS™ 150 UV–Vis分光光度计, Thermo Fisher Scientific, 美国马萨诸塞州）下获得，用公式(1)计算色度数（CoN）（Núñez et al., 2022）。
(1) CoN = (SAC436² + SAC525² + SAC620²) / (SAC436 + SAC525 + SAC620)
#### 2.7.3 脂质含量分析
培养结束获得的细胞沉淀用0.7%（w/v）NaCl溶液洗涤。随后，根据Folch et al.（1957）所述方法（略作修改）从酵母细胞中提取胞内生物脂质。简言之，取500 mg细胞转移至试管中，进行两轮提取。第一轮使用甲醇和氯仿以2:1（v/v）比例作为溶剂，第二轮使用1:2（v/v）比例。
【数据】菌株：Yarrowia lipolytica CECT 1240；KBL来源：桉木；酸沉淀pH：3；离心：8000 rpm/20 min；干燥：105°C至恒重；LRKBL pH调节：6.5；保存温度：4–5°C；甘油保存：40%（v/v）/−80°C；YPD活化：30°C/48 h；种子培养：150 rpm/30°C/12 h；灭菌：0.2 μm过滤+121°C/20 min；接种量：10%（v/v）；培养条件：150 rpm/30°C；生物量离心：13000 rpm/10 min；C/N比梯度：10–200；有机氮源：蛋白胨[14% N, w/w]、酵母提取物[11% N, w/w]、尿素、甘氨酸；无机氮源：硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵；补料分批：5个周期；OD600测定；细胞干重：5 mL培养液/0.7% NaCl洗涤/90°C干燥；HPLC条件：Coregel ION-300柱/75°C/0.45 mM硫酸（pH 3.1）/0.35 mL/min；脂质提取：500 mg细胞/甲醇:氯仿2:1和1:2（v/v）两轮
研究结果
3.1 KBL预处理的效果
表1展示了KBL和LRKBL的主要理化性质。KBL是一种高碱性废液，COD浓度极高，颜色深暗。这些性质加上木质素的存在，可能导致微生物生长受到抑制（Brown et al., 2021; Díaz et al., 2022）。为验证这一点，研究人员用原始KBL培养解脂耶氏酵母进行了多次发酵试验。结果显示，该培养基对生物转化过程产生不利影响，导致细胞增殖不良，60 h后细胞浓度仍低于0.17 ± 0.05 g/L。值得注意的是，木质素沉淀在改善原始KBL多项理化性质的同时，还回收了高附加值产物。LRKBL的粘度适度降低了21%，而COD和CoN值分别显著下降了65%和85%。这一事实表明，木质素是导致高COD和深色度的主要化合物（Pola et al., 2019）。此外，KBL中羧酸总浓度约为20 g/L，主要成分为乙酸（34%）、乳酸（33%）和丙酸（19%）。然而，当原始KBL用作解脂耶氏酵母底物时，高浓度羧酸可能增强了对脂质积累和细胞生长的抑制作用（Llamas et al., 2019）。在这方面，木质素沉淀也有利于降低羧酸总浓度，其值比原始KBL低33%。在LRKBL中，乙酸和丙酸浓度（占总酸56%）分别为5.9 ± 0.3 g/L和1.8 ± 0.2 g/L。这些浓度可认为足以支持后续SCO生物合成——其他研究报道了类似浓度适用于解脂耶氏酵母生产微生物油脂（Llamas et al., 2020a, 2020b）。此外，LRKBL分析显示钾、磷和镁浓度分别为0.5 ± 0.1 g/L、14.6 ± 0.6 mg/L和22 ± 3 mg/L（表1）。这些微量营养素的存在可能对解脂耶氏酵母的代谢产生有益影响，可能促进酵母生长（Bao et al., 2021）。具体而言，前期研究表明磷和镁对多种细胞功能至关重要，包括核酸、辅酶和磷脂的合成（Hoarau et al., 2020; Polat et al., 2022）。因此，LRKBL中这些微量营养素的可用性可为酵母生长创造适宜条件。此外，这些微量营养素之间的协同作用可能增强其对细胞过程的积极影响（Polat et al., 2022）。关于氮含量，LRKBL中相对较低（表1）。然而，这种营养素在脂质生物合成中起关键作用（Bao et al., 2021）。因此，优化氮水平作为最大化SCO生产的关键参数，将在本研究后续阶段详细评估。
图1显示，在LRKBL底物上培养解脂耶氏酵母时，不同C/N比对脂质含量、细胞生长和脂质浓度的影响。结果表明，初始C/N比与脂质含量之间存在显著相关性，随着C/N比从10增加到200，脂质含量持续提升。在C/N比为200时，最大脂质含量达到44 ± 1%，比最低C/N比时增加了约10%。这一趋势凸显了较低氮源水平对脂质含量的积极影响。这些发现与多位作者观察到的结果一致——较高的C/N比在多种底物类型下均能提高脂质含量（Liu et al., 2016a; Nair et al., 2020）。需要指出的是，产油微生物中脂质合成与积累的途径可能因底物类型而异。对于糖类及类似碳源，脂质通过de novo途径合成，该途径在次级代谢生长阶段占主导，需要营养限制（尤其是氮限制）（Dourou et al., 2018）。此时，随着氮耗尽，细胞增殖减慢。然而，酵母继续同化碳源，将过量碳转化为胞内柠檬酸，作为细胞质中乙酰-CoA的前体，进而转化为脂肪酸和甘油三酯（Dourou et al., 2018; Llamas et al., 2019）。相反，ex novo脂质生物合成与疏水性碳源相关，主要发生在初级代谢生长阶段（Papanikolaou and Aggelis, 2011）。在这种情况下，脂质积累与生长偶联，且存在可同化氮（Llamas et al., 2019）。然而，产油酵母同化VFA的精确代谢途径以及影响脂质积累的关键因素仍仅被部分理解。虽然已有研究提出VFA在初级生长期间遵循ex novo途径（Papanikolaou and Aggelis, 2011），但乙酸等底物的详细机制以及氮等因素的作用仍在讨论中。有趣的是，本研究发现较高的C/N比提高了脂质含量。这表明氮限制将碳流转向脂质积累而非细胞生长，指示酵母发生代谢转变。在此背景下，前期研究提出C/N比的影响取决于培养基中的VFA谱（Morales-Palomo et al., 2022）。当乙酸作为主要底物时，这一现象更加明显，提示解脂耶氏酵母存在类de novo代谢（Morales-Palomo et al., 2022）。确实，前期研究提出，乙酸转化为乙酰-CoA后，直接进入de novo脂质生物合成途径（Huang et al., 2016; H. Liu et al., 2021; Llamas et al., 2020b; Morales-Palomo et al., 2022）。另一方面，值得注意的是，细胞生物量随着初始C/N比从10（3.55 ± 0.05 g/L）增加到20（3.69 ± 0.07 g/L）而略有改善。然而，随着C/N比进一步增加，酵母生长显著下降，在C/N比为200时减少了63%。这种行为可以通过氮源逐渐耗尽导致细胞生长减速来解释。氮耗尽抑制了蛋白质和核酸的合成，将细胞代谢重心从生长转向脂质积累。
图2展示了在C/N = 20条件下，不同氮源对解脂耶氏酵母在LRKBL中分批培养时脂质含量、细胞生物量和脂质浓度（a）以及生物量得率（YX/S）和脂质得率（YL/S）（b）的影响。
图3展示了在C/N = 20（硫酸铵+酵母提取物）条件下，解脂耶氏酵母在LRKBL中补料分批培养过程中乙酸和丙酸消耗（a）、底物利用（b）以及细胞生物量和SCO产生（c）的时间进程曲线。
图4展示了解脂耶氏酵母在不同C/N比（a）、不同补充氮源（b）以及补料分批培养策略（c）下产生的SCO脂肪酸谱（%）。
图5（无图注）。
【数据】原始KBL培养60h细胞浓度：<0.17 ± 0.05 g/L；LRKBL粘度降低：21%；COD降低：65%；CoN降低：85%；KBL总羧酸：~20 g/L（乙酸34%、乳酸33%、丙酸19%）；LRKBL羧酸降低：33%；LRKBL乙酸：5.9 ± 0.3 g/L；LRKBL丙酸：1.8 ± 0.2 g/L；LRKBL钾：0.5 ± 0.1 g/L；LRKBL磷：14.6 ± 0.6 mg/L；LRKBL镁：22 ± 3 mg/L；C/N=200时最大脂质含量：44 ± 1%；C/N=10时生物量：3.55 ± 0.05 g/L；C/N=20时生物量：3.69 ± 0.07 g/L；C/N=200时生长减少：63%
讨论与解读
本研究评估了一条以KBL为可再生原料获取高附加值产品的新型增值路线。酸沉淀使LRKBL的粘度和COD分别显著降低21%和65%，同时实现了残余液的部分纯化，获得可用作解脂耶氏酵母底物的羧酸——乙酸5.9 ± 0.3 g/L和丙酸1.8 ± 0.2 g/L。发酵阶段，C/N比为20时兼顾细胞生长与生物脂质积累，底物利用率达93 ± 2%，生物量浓度3.7 ± 0.1 g/L，脂质含量37 ± 1%。无机（硫酸铵）与有机（酵母提取物）氮源协同使用显著提升了生物量与脂质产量，YX/S达0.56 ± 0.03 g/g，YL/S达0.21 ± 0.01 g/g。补料分批培养策略显著提高了脂质含量和生物量产量，第四周期SCO积累量（2.9 ± 0.2 g/L）较第一周期翻倍。
编译者解读
该研究最值得借鉴之处在于"废物预处理—参数优化—过程策略升级"的三级递进逻辑。酸沉淀一步同时解决抑制物去除与木质素回收两个问题，体现了工业废液利用中"先分离、后转化"的工程思维。C/N比与氮源类型的系统筛选属于经典优化路径，但补料分批策略将脂质含量从38%推至52%，说明过程工程在微生物油脂生产中的杠杆效应不亚于菌株改造。局限也很明显——目前仍停留在摇瓶尺度，且以野生型菌株为底盘，脂质绝对产量（2.9 g/L）距离工业化尚有差距。后续若将该策略与基因工程改造（如过表达乙酰-CoA羧化酶或阻断β氧化）结合，或可进一步释放LRKBL作为工业废液碳源的潜力。
参考来源
Moreno, J.F. et al. Bioconversion of carboxylic acids derived from Kraft black liquor into lipids by Yarrowia lipolytica. Journal of Cleaner Production, 2024. DOI: 10.1016/j.jclepro.2024.144029
DOI: 10.1016/j.jclepro.2024.144029