来源：Pressing extraction: A novel and environmentally sustainable approach to microbial lipid extraction from Yarrowia lipolytica（Separation and Purification Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物脂质提取通常需要在湿态下破碎细胞后再用有机溶剂萃取，流程复杂且效率有限。本研究将油料作物常用的压榨提取工艺引入产油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica），通过流化床干燥调控颗粒粒径，实现了无需细胞破碎、无需有机溶剂的高效提油。工程菌株脂质含量达45.8%，粒径超过2,000 μm的干酵母颗粒压榨提油率约88%，且油脂在长期储存中保持稳定。生命周期评估（LCA）证实压榨法比溶剂法更具环境可持续性，为微生物油脂的商业化下游加工提供了全新路径。
研究背景
脂质在细胞构建和能量代谢中不可或缺，广泛应用于食品、化妆品和洗涤剂等领域。全球人口增长推动动物源和植物源脂质需求持续攀升，但饲料成本上涨、疾病暴发和森林砍伐等问题使传统供应难以为继。欧盟已宣布自2026年起， palm油出口须提供碳足迹证明方可进入市场。在此背景下，微生物源替代脂质受到广泛关注。
解脂耶氏酵母是公认的产油酵母，胞内脂质积累量可超过细胞干重的20%。通过代谢工程策略——包括强化脂质合成通路、增加前体供应、提升还原力及进化工程等——该酵母的脂质产量已接近理论得率（0.27 g/g）。然而，微生物脂质的商业化仍受制于发酵放大和下游加工（DSP）等环节。下游加工尤为关键，因为经济高效地回收胞内脂质是微生物油脂产业化的核心瓶颈。
传统微生物脂质提取通常包含湿态细胞破碎和有机溶剂萃取两步，不仅效率低，而且步骤繁琐。压榨提取虽在芝麻、紫苏等油料种子中广泛应用，却从未被用于酵母体系。本研究尝试将压榨提取引入产油酵母的脂质回收流程——这是一次从"溶剂依赖"向"物理压榨"的范式转换。
研究方法
2.1 菌株与补料分批发酵
本研究所用 Y. lipolytica CJ0415 菌株由 CJ BIO 研究所（韩国水原）提供。CJ0415 细胞在 YPD 培养基（10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、20 g/L 葡萄糖）中过夜培养，随后在含 YPDP 培养基 [10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、20–40 g/L 葡萄糖、100 mM 磷酸钾（pH 7.0）] 的 500 mL 摇瓶中初步培养。取 100 mL 培养液接种至 5 L 生物反应器（BIOCNS Co., Ltd.）中的 1.5 L 发酵培养基中。培养基组成包括：40 g/L 葡萄糖、2 g/L MgSO₄·7H₂O、1.66 g/L H₃PO₄（85%）、0.95 g/L KOH（45%）、2 g/L 尿嘧啶、7 g/L 硫酸铵、5 g/L 酵母提取物、26 mg/L CaCl₂·2H₂O、35.1 mg/L FeSO₄·7H₂O、18.2 mg/L ZnSO₄·5H₂O、25.9 mg/L CuSO₄·5H₂O、26 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、6.5 mg/L H₃BO₃、26 mg/L MnSO₄·H₂O 及微量元素溶液。
补料分批发酵时，种子培养液接种至 1.4 L 含 40 g/L 葡萄糖、2 g/L MgSO₄·7H₂O、1.7 g/L H₃PO₄（85%）、1 g/L KOH（45%）、2 g/L 尿嘧啶、7 g/L 硫酸铵、26 mg/L CaCl₂·2H₂O 及微量元素溶液的培养基中。5 L 反应器内初始 OD₆₀₀ 调至 25。发酵过程在 30°C、通气量 1 v/v/min、搅拌转速 900 rpm 下运行。通过通入氨气维持 pH 6.5。泡沫控制使用 PURECHEM AF-4000（IC CHEMICAL Co. Ltd.）。培养 6 h 后启动补料分批过程，使用 60%（w/v）葡萄糖浓缩储备液。在氮源非限制条件下，每当溶解氧浓度骤升（指示碳源耗尽）时，间歇补入 40 mL 培养基，总计补料 1 L。
【数据】菌株：Y. lipolytica CJ0415；培养基：YPD/YPDP/发酵培养基；温度：30°C；通气量：1 v/v/min；转速：900 rpm；pH：6.5；补料葡萄糖浓度：60%（w/v）；初始OD₆₀₀：25；反应器体积：5 L
2.2 干燥方法
提取前采用四种不同干燥方法：喷雾干燥、双滚筒干燥、冷冻干燥和流化床干燥。巴氏杀菌后的截留液收集后于 4°C 保存，再进行粉末干燥。
第一，喷雾干燥（EIN Pilot SD2010, EIN SYSTEM, 韩国）不添加任何辅助添加剂或晶种材料。干燥时入口温度设为 180（±5）°C，出口温度 80（±5）°C。
第二，双滚筒干燥机（Φ300 * L400, DAESUNG PLANT, 韩国）采用蒸汽加热，滚筒温度设为 125°C，压力 0.4（±0.1）MPa。干燥过程中以 0.8 rpm 旋转，干燥后不再进行额外研磨。
第三，冷冻干燥使用冷冻干燥机（Lyoph-Pride, IlshinBiobase, 韩国），真空度设为 −60°C 和 0.1 Mbar。干燥 72 h 后收集干粉。
第四，流化床干燥机（PFB-L, PTK, 韩国）在 75–85°C 下运行，出口温度 65°C，排气量设为 70%，喷雾压力 150 kPa。根据需要将粉末制成颗粒形态，实验条件设为晶种进料速率 100–500 g/h，晶种固含量 180–300 g/L。
所有干燥产品使用激光衍射粒度分析仪（LS 13 320, Beckman Coulter, CA）进行粒径分析。无法用粒度分析仪分析的颗粒粉末，通过筛分按粒径收集，用于后续实验。
【数据】喷雾干燥：入口180±5°C/出口80±5°C；滚筒干燥：125°C、0.4±0.1 MPa、0.8 rpm；冷冻干燥：−60°C、0.1 Mbar、72 h；流化床干燥：75–85°C、出口65°C、排气70%、喷雾压力150 kPa；晶种进料速率：100–500 g/h；晶种固含量：180–300 g/L
2.3 酵母细胞破碎
发酵液经微滤收集截留液，用去离子水洗涤两次，巴氏杀菌（80°C、1 h）后收集。自溶处理：35°C 搅拌 24 h，不添加任何外源试剂。酶处理：使用 Viscozyme®（15% v/v）于 75°C 处理 3 h，或 Alcalase®（15% v/v）于 55°C 处理 3 h（Novozymes A/S, Bagsværd, 丹麦）。物理破碎采用高压均质机（HPH），样品在 1,200 bar 下处理三个循环。为减轻热损伤，过程中循环通入 25°C 水。脉冲电场（PEF）处理使用 PEF Advantate Pipe 100e（Elea, 德国），流速 197 L/h。处理温度维持在 22°C，过程液电导率为 50 mS/cm。比色皿内电场强度最高约 22 kV/cm，施加的比能量为 82 kJ/kg。
【数据】巴氏杀菌：80°C、1 h；自溶：35°C、24 h；Viscozyme®：15% v/v、75°C、3 h；Alcalase®：15% v/v、55°C、3 h；HPH：1,200 bar、3个循环、冷却水25°C；PEF：流速197 L/h、22°C、电导率50 mS/cm、场强约22 kV/cm、比能量82 kJ/kg
2.4 脂质提取
酵母总脂质含量采用提取后重量分析法测定。具体步骤如下：酵母细胞培养、收获后经离心用蒸馏水洗涤两次。洗涤后的细胞在 60°C 干燥 24 h。随后，干燥细胞与 10 mL 8 N HCl 混合，在 80°C 水浴中孵育 1 h。孵育后冷却至室温。加入 30 mL 乙醚，剧烈涡旋 30 s。混合物在 4,000 rpm、4°C 条件下离心 5 min，上清液转移至预先称重的烧瓶中。此乙醚提取和上清收集过程重复两次。含总脂质的溶剂混合物用氮吹系统蒸发。蒸发后的样品用于计算总脂质含量，以总脂质重量和占干酵母重量的百分比表示。
溶剂萃取使用桨式搅拌器，以正己烷为溶剂，溶剂与干物质的比例为 5:1（w/v）。萃取在 25°C 下剧烈搅拌 1 h，确保充分混合。萃取后，使用努奇过滤器分离固液相。液相在减压条件下用旋转蒸发仪浓缩去除溶剂，得到提取油。
压榨提取法不涉及任何溶剂。系统预热至 90°C 至 180°C 的温度范围。制备好的干粉送入机器，在通过螺杆时油和残渣分离。压榨提取使用 AP08 提取机（REINARTZ GmbH&Co., 德国）完成。
溶剂萃取和压榨萃取的提取率均按以下公式计算：
提取率（%）=（提取脂质重量（g）÷ 干物质中粗脂质含量（g））× 100
【数据】总脂质测定：8 N HCl、80°C、1 h；乙醚提取：30 mL×3次、涡旋30 s、4,000 rpm、4°C、5 min；溶剂萃取：正己烷、溶剂:干物质=5:1（w/v）、25°C、1 h；压榨提取：预热90–180°C、AP08提取机
2.5 脂肪酸组成分析
脂肪酸组成分析时，取约 20 mg 脂质提取物置于 12 mL 样品瓶中。加入 2 mL 内标（ISTD）和 1.5 mL NaOH。混合物在 90°C 水浴中孵育 5 min，冷却至室温。随后加入 2 mL 14% 三氟化硼-甲醇溶液，再次在 90°C 孵育 30 min，冷却至室温。之后加入 2 mL 异辛烷和 5 mL 饱和氯化钠溶液，涡旋混匀。分层后，取 1 mL 上层液转移至含 100 mg Na₂SO₄ 的 2 mL EP 管中，反复颠倒数次。Na₂SO₄ 沉降后，取 1 mL 上清液转移至 2 mL 分析瓶中用于脂肪酸组成测定。
脂肪酸甲酯（FAMEs）使用配备 8890 GC 系统（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）的气相色谱仪分析。分析物在 DB-FastFAME GC 色谱柱（30 m × 0.25 mm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA）上分离，使用火焰离子化检测器（FID）检测。操作条件如下：进样口温度……
【数据】样品量：约20 mg；内标：2 mL；NaOH：1.5 mL；皂化：90°C、5 min；BF₃-甲醇（14%）：2 mL、90°C、30 min；异辛烷：2 mL；饱和NaCl：5 mL；Na₂SO₄：100 mg；GC系统：8890；色谱柱：DB-FastFAME（30 m × 0.25 mm）
研究结果
3.1 不同条件下干燥生物质的脂质提取
脂质提取前，发酵后的微生物生物质需先干燥。已知从干燥生物质中用溶剂提取脂质比从湿生物质中提取更高效。然而，由于脱水过程能耗高，研究多聚焦于湿生物质的脂质回收。此外，产油酵母的细胞壁特性决定了有效回收脂质必须经过细胞破碎步骤。因此，标准流程为：离心收集细胞、洗涤去除杂质、物理和化学破碎后再用溶剂提取脂质。然而，湿生物质脂质提取得率低且会共提取不需要的物质，使纯化过程复杂化。因此，尽管干生物质制备能耗高，仍有必要开发能高效从中提取脂质的方法。
为此，本研究旨在开发一种从干生物质中高效提取脂质的方法。进行脂质提取实验前，使用 CJ CheilJedang Corp. 开发的 Y. lipolytica 菌株 CJ0415 在氮源丰富条件下进行了 5 L 补料分批发酵。CJ0415 菌株是 Y. lipolytica Po1f 的基因工程衍生株，即使在氮源丰富条件下也能实现高脂质积累，从而提高了脂质生产率。发酵过程在 26.6 h 内完成，细胞干重达 119.4 g DCW/L，脂质含量 45.8%，脂质滴度 54.6 g/L。显微镜检查显示细胞内积累了脂质液滴（图1a）。
发酵后，洗涤并浓缩的发酵液经巴氏杀菌获得生物质，随后用滚筒干燥机干燥（图1b）。生物质用正己烷处理，室温搅拌 1 h 评估脂质提取率。结果显示，未进行细胞破碎的对照组样品脂质回收率为 34.6（±1.8）%（图1c）。这种低脂质提取率可能归因于细胞壁中极性脂质的存在，阻碍了溶剂的有效作用。实际上，先前研究已报道细胞壁中的多糖、蛋白质和糖脂会显著影响脂质提取效率。这可能解释了为何许多先前研究在溶剂处理前采用细胞破碎。
细胞破碎方法通常分为机械法（压缩、超声、微波、电脉冲）和非机械法（酸化、超临界、生物酶）两类。本研究采用非机械方法——自溶和生物酶处理（alcalase，内切蛋白酶；viscozyme，细胞壁降解酶复合物），以及机械方法——脉冲电场（PEF）和高压均质机（HPH）对细胞进行破碎。破碎后，生物质经滚筒干燥用于脂质提取（图1b）。结果显示，脂质回收率分别为：自溶 48.2（±2.6）%、alcalase 40.0（±2.7）%、viscozyme 40.8（±4.1）%、PEF 30.5（±2.2）%、HPH 49.8（±0.8）%（图1c）。自溶和 HPH 破碎对脂质提取率的提升最为显著。然而，非机械方法导致酸值大幅上升，促进了游离脂肪酸的形成。由于高酸值会因游离脂肪酸的存在而降低纯化得率，自溶方法不被认为理想。因此，HPH 处理后用正己烷从干生物质中提取脂质似乎是最有效的提取方式。
【数据】发酵时间：26.6 h；细胞干重：119.4 g DCW/L；脂质含量：45.8%；脂质滴度：54.6 g/L；未破碎对照提取率：34.6±1.8%；自溶：48.2±2.6%；alcalase：40.0±2.7%；viscozyme：40.8±4.1%；PEF：30.5±2.2%；HPH：49.8±0.8%
3.2 基于生物质干燥方法的脂质提取效率
干燥前经 HPH 细胞破碎可提高溶剂法脂质提取率（图1c）。然而，通过机械破碎、酶处理或化学处理从微生物中提取脂质存在杂质共提取的挑战，需要多个复杂的处理步骤。因此，微生物脂质提取的商业化需要一种步骤更少、无需细胞破碎且提取率更高的方法。
近期研究表明，减小干燥颗粒的尺寸可通过改善溶剂可及性来提高脂质提取率，即使没有细胞破碎步骤也是如此。生物质的粒径可根据干燥方法进行控制。因此，本研究考察了不进行细胞破碎时，脂质提取率是否随干燥生物质粒径的变化而变化。
为此，将浓缩发酵液巴氏杀菌后，采用四种常见工业干燥方法制备生物质：滚筒干燥、喷雾干燥、冷冻干燥和流化床干燥（图2a）。滚筒干燥、喷雾干燥、冷冻干燥和流化床干燥的平均粒径分别为 294.7（±20.7）μm、25.3（±4.3）μm、253.8（±26.4）μm 和 780.5（±23.4）μm（图2b）。
用正己烷从这四种方法干燥的生物质中提取脂质，冷冻干燥的脂质提取率最高，为 55.8（±1.7）%。滚筒干燥为 34.6（±1.8）%，喷雾干燥为 23.4（±1.3）%，流化床干燥为 23.9（±1.2）%（图2c）。这些结果表明，溶剂法脂质提取率并不直接受粒径影响。
使用正己烷等有机溶剂从干燥生物质中提取脂质，存在最终产品中溶剂残留的隐患，可能带来健康风险。正己烷因其高稳定性和低腐蚀性常用于油料种子提取。然而，其使用存在火灾隐患、环境排放和毒性风险，且价格随汽油和原油市场波动。此外，用正己烷实现 50% 以上的脂质回收率仍然具有挑战性（图1c 和图2c）。虽然已有环境友好型脂质提取方法的探索，但效率仍然较低，需要进一步研究。
为此，无溶剂提取方法被提出作为可持续的替代方案。虽然溶剂提取常用于机械和非机械细胞破碎后从植物种子中提取脂质，但某些种子——如芝麻、紫苏和向日葵——采用压榨法加工。基于压榨的脂质提取是在高温高压下从干燥芝麻中提取油脂，是一种环境友好的方法，将细胞破碎和提取合为一步，不使用有机溶剂。虽然已有关于干燥微藻压榨提取脂质的报道，但尚无将此法应用于产油酵母的案例。芝麻种子通常积累约 35–62% 的脂质，而本研究所用产油酵母的脂质含量为 45.8%。因此，我们假设可以采用类似芝麻的压榨方法从干燥生物质中提取脂质。
为验证这一假设，我们对四种干燥生物质进行了压榨提取。压榨提取方法在进料前将系统预热至高温（120°C），随后四种干粉依次送入机器。之后，原油和酵母油饼通过螺杆分离。值得注意的是，提取率分别为：滚筒干燥 27.7（±1.0）%、喷雾干燥 20.6（±0.7）%、冷冻干燥 32.1（±2.8）%、流化床干燥 69.7（±2.6）%（图2d），表明脂质提取率随……
【数据】滚筒干燥粒径：294.7±20.7 μm；喷雾干燥粒径：25.3±4.3 μm；冷冻干燥粒径：253.8±26.4 μm；流化床干燥粒径：780.5±23.4 μm；溶剂法提取率——冷冻干燥：55.8±1.7%、滚筒干燥：34.6±1.8%、喷雾干燥：23.4±1.3%、流化床干燥：23.9±1.2%；压榨法提取率——滚筒干燥：27.7±1.0%、喷雾干燥：20.6±0.7%、冷冻干燥：32.1±2.8%、流化床干燥：69.7±2.6%；压榨预热温度：120°C
讨论与解读
本研究验证了利用产油酵母颗粒干燥进行压榨脂质提取的可行性。这一加工方法通过将发酵后的生物质干燥储存、需要时压榨取油，实现了原油的环境友好型简单提取；再经脱胶、中和和过滤等步骤即可制备精炼油。此外，LCA 分析证实，压榨脂质提取法在环境绩效指标上优于已知的有机溶剂法。因此，本研究开发的基于产油酵母颗粒干燥的压榨脂质提取方法，有望对替代植物源脂质和动物脂肪的替代脂质或油脂的商业化产生积极影响。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，这项工作的核心价值在于将下游加工从"化学驱动"转向"物理驱动"。传统溶剂萃取面临的溶剂残留、安全风险和多重纯化步骤，一直是微生物油脂产业化的"最后一公里"障碍。压榨法借鉴油料作物加工经验，将细胞破碎与萃取合为一步，大幅简化了工艺链。尤其值得注意的是粒径与提取率的关系——压榨法恰好与溶剂法相反，颗粒越大提取率越高，这为流化床干燥造粒提供了明确的设计目标。LCA 的环境效益评估也为该技术的工业转化提供了量化支撑。不过，88% 的提取率虽已可观，但距离溶剂法的极限仍有差距；此外，压榨法对菌株脂质含量的下限要求、设备放大效应以及油饼的附加利用价值，原文未详述，值得后续研究关注。
参考来源
Hong, S. (2025). Pressing extraction: A novel and environmentally sustainable approach to microbial lipid extraction from Yarrowia lipolytica. Separation and Purification Technology. DOI: 10.1016/j.seppur.2025.134148
DOI: 10.1016/j.seppur.2025.134148