来源：Cell wall engineering of Yarrowia lipolytica to improve extraction efficiency of functional lipids（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）因其卓越的脂质积累能力，被视为食品配料与添加剂生产中极具潜力的菌株。然而，其细胞壁的刚性与抗裂解特性严重制约了胞内脂质化合物的工业化回收。本研究通过CRISPR/Cas9介导的细胞壁工程策略，系统敲除几丁质合成、菌丝形成及甘露糖蛋白相关基因，成功削弱细胞壁强度。最终工程菌株yl-B6的脂质提取效率达88.17%，较起始菌株提升2.90倍，EPA含量与脂质滴度同步显著提高，为功能性脂质的绿色高效提取开辟了新路径。
研究背景
解脂耶氏酵母是一种非常规型产油酵母，被认定为GRAS（Generally Recognized as Safe）菌株，广泛用于食品与医药添加剂的生产。此前研究已在该菌株中实现虾青素3.3 g/L的产量（Zhu et al., 2022），并借助机器学习优化基因拷贝数组合，实现EPA产量27.50 g/L（Du et al., 2024）。然而，工业规模的脂质回收仍面临成本高昂、操作繁琐等瓶颈。其根源主要在于细胞壁的刚性结构——内层以β-1,3-D-葡聚糖-几丁质复合物形成纤维支架，外层富含甘露糖蛋白。这种坚固的细胞壁虽赋予菌株机械稳定性，却严重阻碍了胞内脂质的释放。本研究旨在通过细胞壁工程手段，从基因层面"松绑"细胞壁结构，从而提升功能性脂质——特别是EPA的提取效率。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
大肠杆菌DH5α（南京擎科生物技术有限公司，中国）用于质粒克隆与增殖，培养于LB培养基中，按需添加氨苄青霉素。起始酵母菌株来源于解脂耶氏酵母PO1f。酵母基础培养基为YPD培养基，筛选培养基为YNB培养基，反选择培养基为5-氟乳清酸（5-FOA）反选择培养基。本研究所用YPD、YNB及反选择培养基与前期研究一致（Du et al., 2024）。所有固体培养基补充3%琼脂粉（w/v）。限氮培养基用于解脂耶氏酵母发酵（Blazeck et al., 2014; Pomraning et al., 2016），其组成为2.5 g/L酵母提取物、60 g/L葡萄糖和10 g/L YNB。5 L生物反应器所用限氮培养基与摇瓶发酵培养基的主要差异如下：葡萄糖含量提高至140 g/L，酵母提取物提高至5 g/L，YNB降低至3.4 g/L，并额外添加0.5 g/L蛋白胨。本研究所用菌株与质粒列于表S1和S2。
【数据】菌株：大肠杆菌DH5α、解脂耶氏酵母PO1f；培养基：LB、YPD、YNB、5-FOA反选择培养基；琼脂：3%（w/v）；限氮培养基：2.5 g/L酵母提取物、60 g/L葡萄糖、10 g/L YNB；生物反应器培养基：140 g/L葡萄糖、5 g/L酵母提取物、3.4 g/L YNB、0.5 g/L蛋白胨
2.2 质粒构建
CRISPR敲除质粒的构建包含两个主要部分。第一部分是将待敲除基因的sgRNA与pCRSPRylura质粒骨架连接，获得pCRISPR-sgRNA质粒。第二部分是将待敲除基因的上、下游同源臂与pCRISPR-sgRNA质粒骨架连接，得到CRISPR敲除质粒。质粒构建过程中使用的限制性内切酶均购自生工生物工程（上海）股份有限公司（中国）。片段扩增使用高保真酶Prime Star（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国）。片段与骨架的组装通过同源重组实现。所用引物均列于表S3。质粒转化进入解脂耶氏酵母采用醋酸锂法（Gietz & Schiestl, 2007）。
【数据】内切酶来源：生工生物（上海）；高保真酶：Prime Star（南京诺唯赞）；转化方法：醋酸锂法；引物：表S3
2.3 CRISPR/Cas9介导的基因敲除
采用CRISPR/Cas9介导的基因敲除方法，构建了几丁质相关基因（chs3、chs4、csm1、csm2）、菌丝相关基因（hoy1、mhy1、snf5、rac1、cdc25）和甘露糖蛋白相关基因（pir1、cwp1）的单敲除或多敲除菌株。每个基因特异性的gRNA N20序列使用CHOPCHOP v3（http://chopchop.cbu.uib.no）设计，详见表S4。简言之，gRNA和Cas9基因整合于同一质粒中，随后将表达质粒转化进入解脂耶氏酵母。菌株在YNB培养基上培养72小时以实现单基因或多基因的部分敲除。目标位点的基因编辑通过Sanger测序验证。随后，单敲除或多基因敲除菌株先在YPD肉汤中培养24小时，再转移至反选择培养基中去除携带Cas9和gRNA的共表达质粒。去除共表达质粒的菌株用于后续实验。
【数据】基因：chs3、chs4、csm1、csm2、hoy1、mhy1、snf5、rac1、cdc25、pir1、cwp1；gRNA设计工具：CHOPCHOP v3；YNB培养时间：72h；YPD培养时间：24h；验证方法：Sanger测序
2.4 发酵与生长曲线测定
摇瓶发酵。 待发酵菌株划线接种于YPD琼脂平板，30°C培养72小时；挑取单克隆接种于5 mL YPD肉汤中培养24小时制备种子液。测定培养物OD600值，按终OD为0.1的接种量将种子液转移至250 mL摇瓶中。发酵温度为30°C，转速220 rpm，时间96小时。发酵培养基体积为50 mL。
5 L生物反应器发酵。 待发酵菌株划线接种于YPD琼脂平板，30°C培养72小时。挑取单克隆接种于15 mL肉汤中培养22小时制备一级种子液。将全部一级种子液转移至150 mL YPD肉汤中继续培养22小时，制备二级种子液。测定培养物OD600值，按终OD为0.1的接种量将种子液转移至含1.5 L发酵培养基的发酵罐中。5 L生物反应器发酵过程维持温度30°C、通气速率0.3 vvm、转速300–600 rpm、pH 5.5，pH调节方式及补料策略参照前期研究（Du et al., 2024）。脂肪酸谱、脂质滴度、细胞干重（DCW）和残余葡萄糖浓度每12小时测定一次，葡萄糖使用SBA-40E生物传感分析仪（葡萄糖/乳酸专用）定量。
生长曲线测定。 每隔24小时取出少量发酵液，用纯水稀释至OD600介于0.2至1.0之间。样品吸光度通过紫外-可见分光光度计（光吸收波长设定为600 nm）测定，并根据稀释倍数换算原始OD600值。
【数据】摇瓶发酵：30°C、220rpm、96h、50mL培养基；生物反应器：30°C、0.3vvm、300–600rpm、pH 5.5、1.5L培养基；OD600测定范围：0.2–1.0；葡萄糖检测：SBA-40E生物传感分析仪；取样间隔：12h
2.5 酵母细胞对几丁质结合试剂的敏感性
采用刚果红（CR）敏感性实验评估菌株的细胞壁完整性（Ram & Klis, 2006）。CR与几丁质结合可阻碍细胞壁构建。该技术常用于检测携带细胞壁突变的菌株。一般认为，细胞壁中几丁质含量越高，对CR越敏感；而几丁质含量降低则与较低的敏感性相关。然而，CR敏感性不仅受几丁质丰度影响，还受其他细胞因素调控。解脂耶氏酵母在YPD培养基中培养至指数期。取1 mL样品，25°C下4000 g离心5分钟，去除上清液。用无菌水重悬后，进行梯度稀释。将5 μL稀释液点样于含50 μg/mL CR的YPD平板上，平板于30°C培养4天（Ram & Klis, 2006）。通过拍照记录菌株生长情况进行评估。
【数据】CR浓度：50μg/mL；离心：4000g、5min、25°C；点样量：5μL；培养：30°C、4天
2.6 光学显微镜观察
菌丝形成观察。 实验组与对照组的解脂耶氏酵母划线接种于YPD平板，培养72小时以观察非胁迫条件下的菌丝形成。随后挑取单菌落接种于YPD液体培养基中培养24小时。将培养物接种至50 mL限氮培养基中，30°C、220 rpm条件下培养96小时。取发酵液样品，稀释10倍，于显微镜下观察菌丝形成情况。
酵母细胞大小测定。 培养方法与样品制备与菌丝观察一致。通过测量光学显微镜图像中的细胞面积来评估酵母细胞大小，使用Fiji ImageJ进行分析。每个工程菌株选取两张图像，每张图像测量10个酵母细胞的面积。数据随后使用GraphPad Prism 8进行分析和可视化，以评估不同菌株间细胞大小的差异。
【数据】菌丝观察：YPD平板72h + YPD液体24h + 限氮培养基96h（30°C、220rpm）；稀释倍数：10倍；细胞大小分析：Fiji ImageJ，每菌株2张图像×10个细胞
2.7 电子显微镜分析
电子显微镜分析参照前期研究并稍作修改（Inokuma et al., 2021）。主要包括两个部分：样品前处理与电子显微镜分析。
样品前处理。 菌株在YPD中培养至OD600达0.5–1.0。随后，培养物于4°C下4000 g离心5分钟，收集约300 mg菌体。菌体用PBS缓冲液（pH 7）清洗三次。最后加入1 mL预冷的3%戊二醛固定液，含固定液的样品置于4°C冰箱中固定4小时。
【数据】OD600：0.5–1.0；离心：4000g、5min、4°C；菌体量：约300mg；PBS：pH 7；固定液：3%戊二醛，1mL，4°C、4h
研究结果
3.1 细胞壁与菌丝基因缺失对生长和形态的影响
根据NCBI检索和基因组注释，基于与解脂耶氏酵母细胞壁组成和菌丝形成的关联性，共筛选出11个基因。这些基因包括几丁质合成相关基因（chs3、chs4、csm1、csm2）、菌丝形成相关基因（hoy1、mhy1、snf5、rac1、cdc25）和甘露糖蛋白相关基因（pir1、cwp1）（表1）（Sheng et al., 2013; Torres-Guzmán & Domínguez, 1997; Yuzbasheva et al., 2011）。工程菌株PO1f-Δchs3、PO1f-Δchs4、PO1f-Δcsm1、PO1f-Δcsm2、PO1f-Δhoy1、PO1f-Δmhy1、PO1f-Δsnf5、PO1f-Δrac1、PO1f-Δcdc25、PO1f-Δpir1和PO1f-Δcwp1被成功构建（图1A）。
与起始菌株PO1f-Δku70相比，snf5、rac1和cdc25基因的缺失导致工程菌株生长显著受抑。相比之下，其他八个基因缺失的菌株未观察到明显的生长缺陷，表明chs3、chs4、csm1、csm2、hoy1、mhy1、pir1和cwp1基因在测试条件下对生长影响甚微（图1B）（Richard et al., 2001; Sheng et al., 2013）。
为评估单基因缺失对解脂耶氏酵母的生物学效应，采用CR敏感性实验评估工程菌株的细胞壁完整性。CR与几丁质结合，可检测细胞壁结构中与几丁质相关的缺陷（Ram & Klis, 2006）。PO1f-Δsnf5、PO1f-Δrac1、PO1f-Δcdc25和PO1f-Δcsm1菌株表现出增强的CR敏感性。相反，PO1f-Δchs4、PO1f-Δhoy1和PO1f-Δcwp1菌株则表现出降低的CR敏感性（图2A）。这些发现表明，snf5、rac1、cdc25和csm1基因的缺失损害了细胞壁结构和生长，与前期研究一致（Richard et al., 2001）。chs4、hoy1和cwp1基因的缺失可能降低了几丁质水平，从而削弱了与CR的相互作用，降低了CR敏感性（Sheng et al., 2013）。其他基因缺失菌株未检测到显著的CR敏感性差异（图2A）。
此外，我们观察了菌株在非胁迫和限氮条件下的菌丝形成情况。与菌株PO1f-Δku70相比，PO1f-Δmhy1、PO1f-Δsnf5、PO1f-Δrac1和PO1f-Δcdc25菌株在培养过程中表现出光滑的细胞表面且无菌丝，表明这些基因的缺失消除了解脂耶氏酵母的菌丝（图2B和S1）（Richard et al., 2001）。PO1f-Δhoy1菌株表面粗糙且菌丝较少（图S1），表明hoy1基因参与菌丝发育，但其缺失并未完全消除菌丝（Konzock & Norbeck, 2020）。此外，cdc25基因的缺失显著增加了细胞大小（图2B），较PO1f-Δku70增大约96.52%（图S2）。这可能归因于细胞壁完整性的显著破坏，导致胞内外渗透压失衡（Jin et al., 2022; Wu et al., 2024）。
进一步采用透射电子显微镜检查了各单基因缺失菌株的细胞壁形态（图S3）。与PO1f-Δku70菌株相比，PO1f-Δchs3、PO1f-Δcsm2、PO1f-Δhoy1、PO1f-Δmhy1、PO1f-Δrac1、PO1f-Δcdc25和PO1f-Δcwp1菌株的细胞壁厚度显著降低。相反，PO1f-Δchs4、PO1f-Δcsm1、PO1f-Δsnf5和PO1f-Δpir1菌株未见显著变化（图2C）。其中，PO1f-Δsnf5、PO1f-Δrac1、PO1f-Δcdc25和PO1f-Δpir1菌株的葡聚糖层呈淡色，外层甘露糖蛋白层的刷状纤维减少（图S3）。这些变化表明细胞壁密度和外层甘露糖蛋白层降低，很可能源于基因缺失导致的细胞壁组分间交联减弱。该观察结果与酿酒酵母中的发现一致，类似的缺失导致细胞壁密度降低和结构完整性受损（Inokuma et al., 2021）。
【数据】基因数：11个；生长显著抑制基因：snf5、rac1、cdc25；CR敏感性增强菌株：PO1f-Δsnf5、PO1f-Δrac1、PO1f-Δcdc25、PO1f-Δcsm1；CR敏感性降低菌株：PO1f-Δchs4、PO1f-Δhoy1、PO1f-Δcwp1；无菌丝菌株：PO1f-Δmhy1、PO1f-Δsnf5、PO1f-Δrac1、PO1f-Δcdc25；cdc25缺失细胞增大：96.52%；细胞壁厚度显著降低菌株：PO1f-Δchs3、PO1f-Δcsm2、PO1f-Δhoy1、PO1f-Δmhy1、PO1f-Δrac1、PO1f-Δcdc25、PO1f-Δcwp1
3.2 细胞壁与菌丝基因缺失对脂质生产的影响
对工程菌株进行发酵，以考察基因缺失对脂质滴度和脂肪酸组成的影响。与PO1f-Δku70相比，PO1f-Δsnf5、PO1f-Δrac1、PO1f-Δcdc25和PO1f-Δcwp1菌株的脂质滴度显著降低（图3A）。其中PO1f-Δcdc25菌株降幅最大，减少了37.53%。其他工程菌株的脂质滴度未见显著变化（图3A）。
就脂肪酸谱而言，与PO1f-Δku70相比，PO1f-Δsnf5、PO1f-Δrac1和PO1f-Δcdc25菌株的C16:0含量（占总脂肪酸百分比，TFAs）分别增加了28.47%、13.59%和19.94%，而PO1f-Δsnf5、PO1f-Δrac1和PO1f-Δcdc25的C18:1含量分别下降了26.00%、15.06%和13.50%（图3B）。这些结果表明，snf5、rac1和cdc25的缺失降低了不饱和脂肪酸含量，增加了饱和脂肪酸含量。这可能是因为细胞壁完整性的破坏损害了工程菌株的生长和脂质滴度。基于上述发现，chs3、chs4、mhy1、hoy1、csm1、csm2和pir1基因被选作进一步研究对象。
【数据】脂质滴度显著降低菌株：PO1f-Δsnf5、PO1f-Δrac1、PO1f-Δcdc25、PO1f-Δcwp1；PO1f-Δcdc25降幅：37.53%；C16:0增幅：snf5 +28.47%、rac1 +13.59%、cdc25 +19.94%；C18:1降幅：snf5 −26.00%、rac1 −15.06%、cdc25 −13.50%
3.3 细胞壁与菌丝基因多基因缺失对生长和脂质生产的影响
在PO1f-Δku70菌株基础上进行多基因缺失，构建工程菌株以考察对菌株生长和脂质生产的影响。这些菌株包括PO1f-A2、PO1f-A3、PO1f-A4、PO1f-A5、PO1f-A6和PO1f-A7（表S1）。与PO1f-Δku70相比，六个工程菌株均未观察到显著的生长抑制（图4A）。就脂质滴度和脂肪酸谱而言，与PO1f-Δku70相比，大多数工程菌株的脂质滴度和DCW未见显著变化（图4B和C）。仅PO1f-A3、PO1f-A4和PO1f-A5菌株的脂肪酸谱出现轻微变化。
与PO1f-Δku70菌株相比，PO1f-A4和PO1f-A5菌株的C16:0含量分别降低了10.60%和11.78%，C18:0含量分别降低了23.30%和22.43%。此外，PO1f-A3、PO1f-A4和PO1f-A5菌株的C18:2含量分别增加了8.32%、6.91%和17.88%（图4C）。这种变化可能归因于随着更多基因被敲除，对细胞壁的影响逐渐增大，扰乱了代谢途径，导致C16:0含量降低和C18:2含量升高。此外，研究表明C18:2含量的增加可能与细胞大小的增加有关（Chang et al., 2024）。这些代谢变化得到了显微镜观察的进一步支持。PO1f-A3、PO1f-A4和PO1f-A5菌株的细胞体积较PO1f-Δku70菌株分别增加了12.51%、28.61%和16.36%（图S4）。
【数据】C16:0降幅：PO1f-A4 −10.60%、PO1f-A5 −11.78%；C18:0降幅：PO1f-A4 −23.30%、PO1f-A5 −22.43%；C18:2增幅：PO1f-A3 +8.32%、PO1f-A4 +6.91%、PO1f-A5 +17.88%；细胞体积增幅：PO1f-A3 +12.51%、PO1f-A4 +28.61%、PO1f-A5 +16.36%
3.4 细胞壁与菌丝基因多基因敲除对工程酵母菌株生长和脂质生产的影响
进一步表征了多基因缺失对工程菌株yl-Δku70细胞壁破碎率的影响。首先，将多不饱和脂肪酸生产途径的酶整合至PO1f-Δku70中，生成yl-Δku70菌株（表S1）。yl-Δku70菌株的脂质滴度为97.27 mg/g DCW，EPA含量为28.49%。在yl-Δku70中依次敲除七个基因，生成yl-Δchs3、yl-Δchs4、yl-Δcsm1、yl-Δcsm2、yl-Δhoy1、yl-Δmhy1和yl-Δpir1菌株（表S1）。与yl-Δku70菌株相比，yl-Δcsm1菌株的DCW下降了22.77%，脂质滴度下降了13.16%，其他菌株未见显著变化（图S5）。
前期研究结果（原文在此处继续阐述多基因敲除对菌株生长和脂质生产的影响，包括生长曲线、脂质滴度、DCW及脂肪酸谱的变化，具体数据见后续段落）。
【数据】yl-Δku70脂质滴度：97.27mg/g DCW；EPA含量：28.49%；yl-Δcsm1：DCW −22.77%、脂质滴度 −13.16%
3.5 工程菌株的发酵性能与功能性脂质提取效率
对yl-B2、yl-B3和yl-B6菌株进行了DCW、葡萄糖消耗、脂质滴度和功能性脂质提取效率的表征（图6）。
【数据】具体数值原文未详述，见正文后续段落
讨论与解读
本研究通过系统的细胞壁工程策略，成功构建了具有工业应用潜力的工程菌株yl-B6和具有最高功能性脂质提取效率的yl-B3。yl-B6菌株在不影响细胞生长的前提下，脂质滴度提高了1.33倍，功能性脂质提取效率达88.17%，EPA产量达3.60 g/L。yl-B3菌株则实现了90.02%的最大功能性脂质提取效率。这一效应可能归因于yl-B3菌株中chs4和pir1基因的敲低，改变了细胞壁组成（Inokuma et al., 2021; Sheng et al., 2013）。此外，csm2基因的缺失被认为破坏了细胞壁完整性调控系统（Sheng et al., 2013），使细胞壁更易被酶解，从而获得更高的脂质提取率。虽然yl-B3菌株保留了菌丝相关基因，但yl-B6较yl-B2显著更高的脂质提取效率表明，菌丝基因的缺失可能增强了酶消化效率（图6E）。yl-B6相对于yl-B3提取效率略低，可能归因于mhy1基因的缺失增强了细胞壁裂解（Celińska, 2022; Jiang & Chen, 2016; Liu et al., ...）。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，本研究巧妙地将"细胞壁工程"这一上游改造策略与下游脂质提取效率相衔接，跳出了单纯追求代谢通量提升的传统框架。通过系统敲除11个细胞壁与菌丝相关基因，研究者不仅绘制了这些基因对菌株生长、形态和脂质积累的影响图谱，更筛选出"弱壁高产"的最优组合。yl-B6菌株在不牺牲生长的前提下实现提取效率2.90倍提升，这一策略对降低工业下游加工成本具有直接价值。值得注意的是，细胞壁削弱与脂质合成之间的代谢权衡关系仍需深入解析——如何在"易裂解"与"高抗逆"之间找到工业发酵的最佳平衡点，将是后续放大研究的关键命题。
参考来源
期刊：Food Bioscience, 2025
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.106678
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.106678