来源：CRISPR/Cas9-based gene deletion and targeted metabolomics reveal ectoine flux reprogramming in Halomonas campaniensis（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
四氢嘧啶（ectoine）和甜菜碱（betaine）是嗜盐菌应对盐胁迫的关键相容性溶质，在生物医药和精细化工领域应用广泛。本研究利用CRISPR/Cas9系统在Halomonas campaniensis XH26中依次敲除参与甜菜碱合成的hom基因和参与四氢嘧啶降解的doeA基因，成功构建了两株代谢缺陷菌株。结果显示，双基因敲除使胞内四氢嘧啶产量提升33.3%，甜菜碱产量下降76.92%，并通过RT-qPCR和靶向代谢组学揭示了碳代谢通量向四氢嘧啶合成途径重排的分子机制。
研究背景
四氢嘧啶及其衍生物是嗜盐或耐盐细菌胞内合成的相容性溶质，对维持细胞大分子和膜结构的稳定性至关重要，广泛应用于生物医学、食品加工和精细化工领域。四氢嘧啶的生物合成以L-天冬氨酸-4-半醛（ASA）为起点，由二氨基丁酸转氨酶（EctB）、二氨基丁酸乙酰转移酶（EctA）和四氢嘧啶合酶（EctC）三步酶促反应催化完成。通过代谢工程、基因编辑和基因敲除改造底盘细胞已成为提高四氢嘧啶产量的重要策略，其中CRISPR/Cas9基因编辑技术因其高效率、低成本和低脱靶效应而备受关注。已有研究利用CRISPR/Cas9在多种微生物中成功敲除竞争性代谢途径基因，显著提升了目标产物产量。然而，在Halomonas campaniensis XH26中，hom基因（参与甜菜碱合成）和doeA基因（参与四氢嘧啶降解）的缺失对四氢嘧啶生物合成途径内代谢通量产生的影响尚不清楚。
研究方法
2.1 菌株与培养基
野生型H. campaniensis XH26（CCTCC M2019776M）以及代谢缺陷菌株XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA保存于青海大学基础医学研究中心。基础培养基组成为：58.50 g/L NaCl、55.88 g/L KCl、24.65 g/L MgSO₄·7H₂O、9.83 g/L谷氨酸钠（MSG）、3.00 g/L柠檬酸钠、7.50 g/L酪蛋白酶解物、0.20 g/L无水CaCl₂、2.00 g/L酵母提取物和5.00 g/L葡萄糖。四氢嘧啶发酵在37℃、pH 8.0条件下进行。
【数据】NaCl：58.50 g/L；KCl：55.88 g/L；MgSO₄·7H₂O：24.65 g/L；MSG：9.83 g/L；柠檬酸钠：3.00 g/L；酪蛋白酶解物：7.50 g/L；无水CaCl₂：0.20 g/L；酵母提取物：2.00 g/L；葡萄糖：5.00 g/L；温度：37℃；pH：8.0
2.2 基因敲除菌株的构建
基因敲除基于H. campaniensis XH26的hom和doeA基因序列。所用菌株和质粒列于表S1。CRISPR/Cas9系统使用两个质粒，均来源于pRE112骨架。质粒W351携带sgRNA表达盒和同源修复模板，质粒W352含有Cas9表达盒和氨基糖苷类腺苷酰转移酶基因（SmR），赋予壮观霉素抗性。
构建W351质粒时，修复模板以W35A为模板、使用引物W35–3C1和W35–4C4扩增，质粒骨架以W35B为模板、使用引物W35–1和W35–2扩增。W35A含有由hom基因上下游各500 bp融合形成的1000 bp同源片段，通过Gibson组装克隆至pRE112。W35B通过酶切连接将两个合成的sgRNA ORF和Cas9启动子序列插入pRE112载体构建而成。质粒W351导入E. coli S17-λ pir后，通过接合转移转入XH26，获得菌株XH26-W35。
质粒W352以W35B为基础、以W159为模板进行改造。使用引物W15-F4和W34-S2将质粒线性化（命名为Vec1），Cas9基因以pWT-Cas9为模板、使用引物W15-F1和W34-S1扩增获得W34-S1。氯霉素抗性基因被合成的壮观霉素抗性基因（SmR）替换，后者使用引物W34–5和SmR-R扩增。W34-S1用引物W34–3和W34–4线性化后，通过Gibson组装将SmR片段插入线性化载体，阳性克隆经测序确认。携带W34的E. coli S17-λ pir与XH26-W35进行接合，转接合子在含壮观霉素的平板上筛选，并用蔗糖反向筛选。单菌落使用表S2所列hom特异性引物进行PCR验证，确认hom基因成功敲除。
XH26/Δhom/ΔdoeA菌株在XH26/Δhom背景上构建。hom基因敲除时使用的Cas9表达质粒W352（SmR抗性）再次用于制备该菌株。doeA基因的5′和3′同源臂以XH26基因组为模板、使用引物W182–1F和W182–1R通过融合PCR扩增，克隆至线性化的W351质粒中生成重组质粒W182。W351中的sgRNA使用W182-sgRNA-1F和W182-sgRNA-1R引物替换为靶向doeA的新sgRNA，获得质粒W182-sgRNA1。该质粒转化至E. coli S17-λ pir后接合转入XH26/Δhom菌株，筛选壮观霉素抗性菌落获得双基因敲除菌株XH26/Δhom/ΔdoeA。
【数据】同源臂长度：500 bp（hom基因上/下游）；同源片段总长：1000 bp；抗性标记：SmR（壮观霉素）；培养温度：37℃；筛选方式：壮观霉素平板+蔗糖反向筛选
2.3 菌株形态与生理特性表征
野生型菌株XH26及代谢缺陷菌株XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA在固体培养基上于37℃培养36 h后观察菌落形态。固体培养基上培养的细菌细胞经8000 rpm离心5 min收集，然后在新鲜配制的2.5%戊二醛溶液中于4℃固定12 h。使用扫描电子显微镜（JSM-6610，JEOL Ltd.，日本）观察形态特征。碳源和氮源利用能力以及生理生化特性按照《伯杰系统细菌学手册》（Krieg, 2001）中的方案进行评估。
【数据】培养时间：36 h；温度：37℃；离心：8000 rpm、5 min；固定液：2.5%戊二醛；固定条件：4℃、12 h；SEM型号：JSM-6610（JEOL）
2.4 生长与产量分析
菌株XH26、XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA在基础培养基中于37℃、180 rpm振荡培养至OD₆₀₀达1.20。然后以等生物量接种至新鲜培养基中继续培养48 h。每4 h间隔测定OD₆₀₀、胞内四氢嘧啶和胞内甜菜碱产量。同时，将菌株接种至含不同浓度NaCl（0.0至3.0 mol/L，以0.5 mol/L递增）的250 mL基础培养基中。培养48 h后取样测定细胞生长量以及四氢嘧啶和甜菜碱产量。
【数据】培养温度：37℃；转速：180 rpm；接种OD₆₀₀：1.20；培养时间：48 h；采样间隔：4 h；NaCl浓度范围：0.0–3.0 mol/L（0.5 mol/L梯度）；培养基体积：250 mL
2.5 RT-qPCR分析
三株菌在指数生长期（OD₆₀₀ = 0.8–1.6）分别于OD₆₀₀值0.8、1.0、1.2、1.4和1.6时取样。十倍系列稀释（10⁻¹–10⁻⁹）涂布平板，计数产生30–300个清晰菌落的稀释度并计算CFU/mL（n = 3）。这些数据用于构建OD₆₀₀–CFU/mL校准曲线，通过最小二乘线性回归拟合（R² ≥ 0.99）（图S1）。将菌株培养至指数期，每株收获1.25 × 10⁹个细胞用于总RNA提取（n = 3）。RNA纯度使用NanoDrop 2000分光光度计（ND200，Thermo Fisher Scientific，美国）评估，浓度使用Qubit荧光计（v2.0，Q32867，Invitrogen，美国）测定。使用PrimeScript™ RT试剂盒（Takara Bio Inc.，中国）按照制造商说明书合成互补DNA（cDNA），于−20℃保存备用。引物使用Primer Premier（v5.0）设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。RT-qPCR循环条件为：94℃初始变性4 min，然后45个循环的95℃ 10 s、58℃ 20 s和72℃ 30 s。GAPDH作为内参，相对基因表达水平使用2⁻ΔΔCT方法计算。
【数据】取样OD₆₀₀：0.8、1.0、1.2、1.4、1.6；稀释梯度：10⁻¹–10⁻⁹；计数范围：30–300 CFU；R² ≥ 0.99；细胞数：1.25 × 10⁹/株；RT-qPCR条件：94℃ 4 min；45×（95℃ 10 s；58℃ 20 s；72℃ 30 s）；内参基因：GAPDH；计算方法：2⁻ΔΔCT
2.6 靶向代谢组学分析
每个样品取100 µL培养液，与400 µL含内标L-2-氯苯丙氨酸（0.02 mg/mL）的乙腈-甲醇提取液（1:1，v/v）混合。涡旋30 s后，样品在5℃、40 kHz条件下超声提取30 min。然后混合物在−20℃孵育30 min。在13,000 rpm、4℃离心15 min后，收集上清液并在氮气下干燥。干燥残留物用100 µL乙腈-水溶液（1:1，v/v）复溶，冰上超声5 min，再次在13,000 rpm、4℃离心10 min。最终上清液用于LC-MS分析。
LC-MS分析平台：代谢谱分析使用UPLC-Triple TOF系统（SCIEX，美国）进行。色谱分离使用HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm内径，1.8 µm）。流动相A为水-乙腈（95:5，v/v）含0.1%甲酸，流动相B为乙腈-异丙醇-水（47.5:47.5:5，v/v/v）含0.1%甲酸。流速设为0.40 mL/min，柱温维持40℃。
数据处理与统计分析：原始LC-MS数据使用Progenesis QI软件（Waters Corporation，Milford，美国）进行基线校正、峰检测、解卷积、保留时间对齐和归一化处理。该处理生成包含保留时间、质荷比（m/z）和峰强度的数据矩阵。多变量分析（包括主成分分析PCA和偏最小二乘判别分析PLS-DA）使用R软件中的'ropls'包进行。
【数据】样品量：100 µL；提取液：乙腈-甲醇（1:1，v/v）含0.02 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸；超声：5℃、40 kHz、30 min；−20℃孵育：30 min；离心：13,000 rpm、4℃、15 min；复溶：100 µL乙腈-水（1:1，v/v）；再离心：13,000 rpm、4℃、10 min；流速：0.40 mL/min；柱温：40℃；色谱柱：HSS T3（100 mm × 2.1 mm，1.8 µm）
研究结果
3.1 四氢嘧啶生物合成和代谢基因敲除的验证
提取XH26、XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA菌株的基因组DNA作为模板，使用相应引物对（hom-F/hom-R和doeA-F/doeA-R）进行PCR扩增。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析（图2）。泳道1和2对应野生型XH26菌株，分别显示hom和doeA片段的扩增，两者位于2000至3000 bp之间，大小分别约为2500 bp（hom；预期：2458 bp）和2400 bp（doeA；预期：2443 bp）。泳道3对应XH26/Δhom菌株，hom扩增子出现在约1100 bp处（预期大小：1108 bp），而泳道4显示XH26/Δhom菌株中doeA基因产物未改变（约2400 bp；预期：2443 bp）。泳道5和6对应双敲除菌株XH26/Δhom/ΔdoeA，hom和doeA条带分别出现在约1100 bp（预期：1108 bp）和1200 bp（预期：1243 bp）处，均与预期大小一致。这些结果证实代谢缺陷菌株XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA构建成功。
【数据】hom片段（XH26）：约2500 bp（预期2458 bp）；doeA片段（XH26）：约2400 bp（预期2443 bp）；hom片段（XH26/Δhom）：约1100 bp（预期1108 bp）；hom片段（XH26/Δhom/ΔdoeA）：约1100 bp（预期1108 bp）；doeA片段（XH26/Δhom/ΔdoeA）：约1200 bp（预期1243 bp）
3.2 形态与生理特性比较分析
接下来检查了菌株XH26、XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA的形态和生理特性（图3）。形态学上，三株菌均形成圆形、乳白色、不透明的菌落，表面微凸。然而，代谢缺陷菌株的菌落尺寸小于野生型菌株（图3A−C）。扫描电镜显示所有菌株的细胞均呈短杆状形态，末端钝圆，未见鞭毛。与XH26相比，突变菌株的细胞更短且更宽。测得的细胞尺寸如下：XH26为长2.24–3.34 µm、宽0.55–0.88 µm（图3D）；XH26/Δhom为长2.05–3.18 µm、宽0.67–0.92 µm（图3E）；XH26/Δhom/ΔdoeA为长1.34–1.74 µm、宽0.70–1.04 µm（图3F）。
生理生化鉴定表明，三株菌均能利用蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、苦杏仁苷和柠檬酸盐作为碳源，但无法代谢鼠李糖、肌醇、乳糖或海藻糖。精氨酸可被所有菌株用作氮源，而赖氨酸和鸟氨酸不能。所有菌株的邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）活性、明胶液化和脲酶活性均为阳性，但吲哚产生为阴性。值得注意的是，与XH26和XH26/Δhom相比，双敲除菌株XH26/Δhom/ΔdoeA对山梨醇、蔗糖、苦杏仁苷和阿拉伯糖的利用较慢。
【数据】XH26细胞尺寸：长2.24–3.34 µm、宽0.55–0.88 µm；XH26/Δhom细胞尺寸：长2.05–3.18 µm、宽0.67–0.92 µm；XH26/Δhom/ΔdoeA细胞尺寸：长1.34–1.74 µm、宽0.70–1.04 µm；可利用碳源：蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、苦杏仁苷、柠檬酸盐；不可利用碳源：鼠李糖、肌醇、乳糖、海藻糖；可利用氮源：精氨酸；不可利用氮源：赖氨酸、鸟氨酸；阳性：ONPG、明胶液化、脲酶；阴性：吲哚产生
3.3 生长性能及四氢嘧啶和甜菜碱产量分析
菌株XH26、XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA在不同NaCl浓度（0.0–3.0 mol/L，以0.5 mol/L递增）下培养，以评估其生长性能及四氢嘧啶和甜菜碱产量（图4和表S3）。所有菌株对NaCl浓度升高均呈钟形响应，生长先改善后下降。在3.0 mol/L NaCl条件下，生长几乎完全被抑制（图4A）。四氢嘧啶（图4B）和甜菜碱（图4C）的最佳产量出现在1.0 mol/L NaCl条件下。在此条件下，四氢嘧啶产量为XH26 0.45 g/L、XH26/Δhom 0.51 g/L、XH26/Δhom/ΔdoeA 0.60 g/L，较野生型XH26分别增加了13.3%和33.3%（图4E）。相反，XH26、XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA中的甜菜碱浓度分别为0.26 g/L、0.07 g/L和0.06 g/L，突变菌株中相应减少了73.08%和76.92%（图4F）。
在最佳盐浓度（1.0 mol/L NaCl）下，所有菌株约在4 h进入指数生长期（图4D）。12 h之前，XH26生长最快。此后，XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA的生长速率逐渐超过野生型XH26，其中XH26/Δhom/ΔdoeA获得最高生物量。所有菌株的生长约在36 h达到平台期。
【数据】最佳NaCl浓度：1.0 mol/L；四氢嘧啶产量：XH26 0.45 g/L、XH26/Δhom 0.51 g/L（+13.3%）、XH26/Δhom/ΔdoeA 0.60 g/L（+33.3%）；甜菜碱浓度：XH26 0.26 g/L、XH26/Δhom 0.07 g/L（−73.08%）、XH26/Δhom/ΔdoeA 0.06 g/L（−76.92%）；进入指数期时间：约4 h；平台期：约36 h；NaCl完全抑制浓度：3.0 mol/L
3.4 四氢嘧啶代谢途径相关基因表达分析
在最佳盐浓度（1.0 mol/L NaCl）条件下，使用RT-qPCR评估四氢嘧啶代谢途径中关键基因的差异表达（图5）。比较XH26/Δhom和XH26菌株时（图5A），XH26/Δhom中四氢嘧啶生物合成基因ectA、lysC和asd显著上调。此外，与四氢嘧啶降解相关的基因（ectD、doeA、doeB、doeC、doeD）和赖氨酸生物合成基因（dapL、dapF、lysA）也上调。相比之下，hom缺失后参与甜菜碱生物合成的基因下调。
比较XH26/Δhom/ΔdoeA和XH26菌株时（图5B），双敲除菌株表现出关键四氢嘧啶生物合成基因（包括ectA、ectC、lysC和asd）表达增加，而doeA、doeB和doeD（四氢嘧啶降解相关）下调。值得注意的是，赖氨酸途径基因（dapA、dapL、dapF、lysA）上调，可能是由于代谢中间产物的积累。
比较XH26/Δhom/ΔdoeA和XH26/Δhom菌株时（图5C），双敲除菌株表现出四氢嘧啶生物合成基因（ectA、ectB、ectC、lysC、asd）和赖氨酸途径基因（dapA、dapF、lysA）的进一步上调。相反，四氢嘧啶降解相关基因（doeA、doeB、doeC、doeD）下调，表明四氢嘧啶向下游中间产物的转化减少。
【数据】NaCl浓度：1.0 mol/L；XH26/Δhom vs XH26上调基因：ectA、lysC、asd、ectD、doeA、doeB、doeC、doeD、dapL、dapF、lysA；XH26/Δhom/ΔdoeA vs XH26上调基因：ectA、ectC、lysC、asd、dapA、dapL、dapF、lysA；XH26/Δhom/ΔdoeA vs XH26下调基因：doeA、doeB、doeD；XH26/Δhom/ΔdoeA vs XH26/Δhom上调基因：ectA、ectB、ectC、lysC、asd、dapA、dapF、lysA；XH26/Δhom/ΔdoeA vs XH26/Δhom下调基因：doeA、doeB、doeC、doeD
3.5 基于靶向代谢组学的差异代谢物分析
采用靶向代谢组学定量分析野生型和代谢缺陷菌株中与四氢嘧啶生物合成途径相关的关键代谢物。对检出的代谢物进行差异分析（图6）。PCA显示第一主成分（PC1）占总方差的35.00%，第二主成分（PC2）占18.30%。样品分布显示清晰的组间分离，表明代谢谱存在显著差异（图6A）。PLS-DA的主评分为34.6%，正交评分为6.80%，证实了模型的可靠性。组内紧凑聚集和组间明显分离表明野生型和敲除菌株之间存在显著的代谢差异（图6B）。基于归一化代谢物丰度的层次聚类也显示一致的组内模式和显著的组间变异（图6C），表明基因缺失显著影响了四氢嘧啶相关代谢物水平。
靶向代谢组学共分析了四氢嘧啶生物合成途径中涉及的22种主要代谢物。基于VIP > 1和P < 0.05的筛选标准，鉴定出显著变化的代谢物子集（表S4）。对检出的代谢物进行定性和定量分析后，计算组间倍数变化并以柱状图可视化呈现差异代谢物丰度水平（图7）。
比较XH26/Δhom和XH26菌株时（图7A），顺乌头酸是上调最显著的代谢物，其次是异柠檬酸、L-四氢嘧啶、柠檬酸、L-谷氨酰胺、L-苹果酸、草酰琥珀酸、L-高丝氨酸、琥珀酸和延胡索酸。下调最显著的代谢物是草酰乙酸，其次是O-磷酸-L-高丝氨酸、胆碱、L-赖氨酸、甜菜碱、N(γ)-乙酰二氨基丁酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-氧代戊二酸和甘氨酸。
比较XH26/Δhom/ΔdoeA和XH26时（图7B），异柠檬酸再次高度上调，其次是顺乌头酸、L-四氢嘧啶、柠檬酸、L-高丝氨酸、延胡索酸、草酰琥珀酸、L-谷氨酰胺、L-苹果酸和琥珀酸。2-氧代戊二酸下调最显著，其次是2-氧代戊二酸、胆碱、L-2,4-二氨基丁酸……
【数据】PC1：35.00%；PC2：18.30%；PLS-DA主评分：34.6%；正交评分：6.80%；代谢物总数：22种；筛选标准：VIP > 1、P < 0.05；XH26/Δhom vs XH26上调最显著：顺乌头酸、异柠檬酸、L-四氢嘧啶；下调最显著：草酰乙酸、O-磷酸-L-高丝氨酸、胆碱；XH26/Δhom/ΔdoeA vs XH26上调最显著：异柠檬酸、顺乌头酸、L-四氢嘧啶；下调最显著：2-氧代戊二酸、胆碱、L-2,4-二氨基丁酸
讨论与解读
4.1 基因敲除对细胞形态和四氢嘧啶产量的影响
单基因或多基因的编辑可显著影响细菌生长和代谢产物积累。Zhang等将ectABC基因簇导入E. coli并敲除lysA基因，构建的代谢工程菌株E. coli ET03四氢嘧啶产量达1.08 g/L，较亲本菌株提高2.08倍。Lim等删除Methylomicrobium alcaliphilum 20Z的doeA基因，获得1.0 g/L的四氢嘧啶产量。Feng等在E. coli中导入ectABC并敲除crr基因，将代谢通量从磷酸烯醇式丙酮酸重定向至草酰乙酸，四氢嘧啶产量达1.27 g/L。本研究中，利用CRISPR/Cas9系统敲除hom基因（参与甜菜碱合成）和doeA基因（参与四氢嘧啶降解），成功构建了两株代谢缺陷菌株。与野生型相比，突变菌株胞内四氢嘧啶浓度达0.51 g/L和0.60 g/L，分别提高13.3%和33.3%。关键代谢节点上调控基因的敲除也会影响细菌形态。Niu等敲除Acinetobacter baumannii的wza基因后观察到形态变化，与本研究观察到的突变菌株细胞变短变宽的现象一致。
4.2 代谢通量重塑的分子机制
RT-qPCR结果表明，hom和doeA基因的缺失导致四氢嘧啶生物合成基因（ectA、ectB、ectC、lysC、asd）显著上调，同时四氢嘧啶降解基因（doeA、doeB、doeC、doeD）下调。靶向代谢组学进一步证实，差异丰度代谢物主要涉及TCA循环、氨基酸代谢等四个关键能量代谢途径。敲除hom基因阻断了甜菜碱合成分支，使更多碳通量流向四氢嘧啶合成；敲除doeA基因则阻断了四氢嘧啶的降解途径，减少了产物的回流消耗。双基因敲除的协同效应使碳代谢通量向四氢嘧啶生物合成途径重排，实现了产量提升与降解减少的双重效果。
编译者解读
本研究采用CRISPR/Cas9双质粒系统在嗜盐菌中依次敲除竞争途径和降解途径的关键基因，策略上具有清晰的代谢工程逻辑——先堵住分支代谢流失，再切断产物回补消耗。值得注意的是，hom基因敲除后赖氨酸途径基因同步上调，提示天冬氨酸半醛节点存在复杂的反馈调控网络，这为后续多基因协同编辑提供了潜在靶点。双基因敲除使四氢嘧啶产量提升33.3%，增幅虽不及部分异源表达体系，但考虑到XH26本身为天然高产菌株且未进行发酵优化，该遗传改造策略在工业菌株底盘改良中具有较好的叠加应用潜力。局限在于研究仅停留在摇瓶水平，未涉及补料分批发酵和规模化放大验证。
参考来源
Zou M. CRISPR/Cas9-based gene deletion and targeted metabolomics reveal ectoine flux reprogramming in Halomonas campaniensis. Journal of Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.10.006
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2025.10.006