来源：CRISPR/Cas9-based evidence that overexpression of Gm-mGST1 mediates abamectin resistance in the oriental fruit moth, Grapholita molesta（Insect Biochemistry and Molecular Biology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
阿维菌素类杀虫剂是全球害虫综合治理的重要工具，但抗性演化正威胁其长期药效。本研究以梨小食心虫（Grapholita molesta）为对象，综合运用CRISPR/Cas9基因敲除、转基因果蝇异位表达、原核表达及体外代谢等多层次手段，首次提供谷胱甘肽S-转移酶基因Gm-mGST1直接介导阿维菌素抗性的功能性证据。抗性品系（AB-R）相比敏感品系（AB-S）抗性水平提高85.5倍，敲除Gm-mGST1后抗性下降16.3倍，田间种群中抗性水平与Gm-mGST1表达呈显著正相关。
研究背景
杀虫剂抗性对全球农业构成严峻挑战，威胁作物保护、粮食安全及害虫管理项目的长期效果。阿维菌素是源于阿维链霉菌的大环内酯类化合物，凭借高效活性与良好毒理学特性在IPM中占据关键地位。其作用机制主要涉及激活无脊椎动物谷氨酸门控氯离子通道（GluCls），也可能与离子型GABA受体发生次级互作。由于具有跨层移性，阿维菌素对蛀果类害虫尤其有效，梨小食心虫便是其中最具破坏性的种类之一。然而，高强度重复使用已推动多种螨类和昆虫产生抗性。机制上，阿维菌素抗性主要通过两条途径介导：靶标位点不敏感与代谢解毒。已有研究提示GSTs参与阿维菌素抗性，但多为相关性证据或RNAi敲低实验，尚缺乏CRISPR/Cas9基因编辑的直接功能验证。
研究方法
2.1 供试昆虫
敏感品系AB-S最初采自中国陕西省杨凌区，在实验室不接触任何杀虫剂条件下饲养超过七年。抗性品系AB-R由AB-S种群经饲料混毒法以LC20浓度阿维菌素连续筛选建立。梨小食心虫幼虫以人工饲料（番茄酱、玉米粉、酵母提取物和大豆粉配制）饲养，成虫提供10%糖水。幼虫与成虫均在26 ± 1 °C、70 ± 10%相对湿度、光周期15 h光照:9 h黑暗条件下饲养。
果蝇品系w1118携带attP40停靠位点（位于2号染色体），购自启东丰基生物技术有限公司，作为无转基因品系用于建立转基因品系。Trans-mGST1品系为表达Gm-mGST1的转基因果蝇品系。果蝇幼虫与成虫饲喂人工饲料（蔗糖、葡萄糖、无水氯化钙、琼脂、山梨酸钾、酵母提取物和玉米粉配制）。所有果蝇品系在光周期12:12 h（L:D）、相对湿度70%、温度25 ± 1 °C条件下饲养。
【数据】梨小食心虫饲养条件：26 ± 1 °C，70 ± 10% RH，光周期15:9 h（L:D）；果蝇饲养条件：25 ± 1 °C，70% RH，光周期12:12 h（L:D）
2.2 化学试剂
阿维菌素（98%纯度）购自四川维克奇生物科技有限公司。1-萘酚、1-萘乙酸酯、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、固蓝B盐购自上海生工生物工程有限公司；1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）、4-硝基苯甲醚、对硝基苯酚、L-谷胱甘肽（GSH）、十二烷基硫酸钠（SDS）、S-己基谷胱甘肽（GTX）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCl）购自广东光华科技股份有限公司。增效剂马来酸二乙酯（DEM）、磷酸三苯酯（TPP）、胡椒基丁醚（PBO）购自北京索莱宝科技有限公司。
【数据】阿维菌素纯度：98%；增效剂：DEM、TPP、PBO
2.3 生物测定
采用微滴法评估阿维菌素对梨小食心虫品系的毒性。以二甲基亚砜（DMSO）配制10 g/L阿维菌素母液，再用DMSO稀释为系列浓度梯度——AB-S品系：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 g/L；AB-R品系：0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 g/L；mGST1-KO品系：0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 g/L——以DMSO为对照。每个浓度处理30头3龄幼虫，每个浓度设3个生物学重复。处理后试虫置于26 ± 1 °C、70 ± 10% RH、光周期15:9 h（L:D）条件下。72 h后检查结果，以细毛笔轻触无反应判定为死亡。
果蝇成虫对阿维菌素的敏感性变化参照Pei等（2023）的方法。将不同浓度药液加入含1.5% w/v琼脂和1% w/v蔗糖的标准果蝇管中，室温过夜晾干。每管放入30头羽化后2至5天的成虫，倒置以防果蝇陷入琼脂。72 h后记录死亡率。
【数据】AB-S浓度梯度：0–0.4 g/L；AB-R浓度梯度：0–6.4 g/L；mGST1-KO浓度梯度：0–1.6 g/L；每浓度30头3龄幼虫，3个生物学重复；72 h后检查；果蝇每管30头，72 h后记录
2.4 GmGluCl cDNA片段的扩增、克隆与测序
分别从AB-S和AB-R品系各取5头5龄幼虫混合提取总RNA，使用TRNzol试剂（天根生化科技有限公司）。以1 μg总RNA为模板，用HiScript II Q RT SuperMix Kit（诺唯赞）合成第一链cDNA（该试剂盒含gDNA wiper以去除DNA污染）。合成产物作为模板，−20 °C保存备用。
根据梨小食心虫基因组中GmGluCl序列设计引物，扩增GmGluCl开放阅读框（GenBank登录号：PV958088）。PCR反应体系：12.5 μL 2 × Phanta Flash Master Mix（诺唯赞）、正反向引物各2 μL（10 μM）、cDNA模板2 μL、ddH₂O 6.5 μL，终体积25 μL。PCR程序：98 °C预变性30 s；35个循环（98 °C变性10 s，60 °C退火5 s，72 °C延伸10 s）；72 °C终延伸1 min，12 °C保持。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化，克隆至pClone007 Blunt载体后转化大肠杆菌Trelief™ 5α感受态细胞。含插入片段的重组质粒由擎科生物技术有限公司测序。每个品系（AB-S和AB-R）各获得5条cDNA序列。
【数据】总RNA提取：5头5龄幼虫/品系；cDNA合成：1 μg总RNA；PCR体系：12.5 μL Master Mix + 引物各2 μL + cDNA 2 μL + ddH₂O 6.5 μL；PCR程序：98 °C 30 s预变性，35循环（98 °C 10 s / 60 °C 5 s / 72 °C 10 s），72 °C 1 min终延伸；凝胶浓度：1.0%；每品系测序：5条
2.5 三类解毒酶活性分析
分别取AB-S和AB-R品系3头5龄幼虫置于1.5 mL离心管中，用PBS缓冲液进行组织匀浆。PBS由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、KCl配制，pH用NaOH或HCl调节。不同酶活性测定使用不同PBS条件：GST活性用0.1 M PBS（pH 8.0），P450活性用0.1 M PBS（pH 7.8），CarE活性用0.04 M PBS（pH 7.0）。4 °C匀浆后，12,000×g离心30 min，取上清用于酶活性和蛋白含量测定。GST、P450和CarE酶活性参照Su等（2021a）的方法测定。每个处理至少3个生物学重复。
蛋白含量用BCA蛋白定量试剂盒（索莱宝）测定。总反应体积220 μL，含20 μL酶液和200 μL BCA工作液（BCA试剂与Cu²⁺溶液按50:1比例混合）。酶标板在37 °C恒温培养箱中孵育25 min，用酶标仪（Tecan Infinite M200，瑞士）在562 nm处读取吸光度。蛋白浓度根据标准蛋白曲线计算。
【数据】GST测定：0.1 M PBS pH 8.0；P450测定：0.1 M PBS pH 7.8；CarE测定：0.04 M PBS pH 7.0；离心：12,000×g，30 min，4 °C；BCA反应：37 °C，25 min，562 nm读数
2.6 增效剂生物测定
以AB-S和AB-R品系3龄幼虫进行增效剂实验。三种增效剂DEM、PBO和TPP用DMSO稀释至终浓度100 mg/L。测定前，将增效剂溶液滴于3龄幼虫背部，处理2 h后按上述生物测定法测定阿维菌素毒性，72 h后检查死亡情况。增效比（SR）由有增效剂与无增效剂条件下LC50的比值计算。
【数据】增效剂浓度：100 mg/L；增效剂预处理时间：2 h；检查时间：72 h
2.7 基因表达分析（原文节选未完整呈现，按原文可译部分处理）
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2.8 CRISPR/Cas9敲除（原文节选未完整呈现方法步骤，按结果部分对应内容处理）
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2.9 原核表达与蛋白纯化（原文节选未完整呈现方法步骤，按结果部分对应内容处理）
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2.10 酶动力学与抑制实验（原文节选未完整呈现方法步骤，按结果部分对应内容处理）
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2.11 体外代谢实验（原文节选未完整呈现方法步骤，按结果部分对应内容处理）
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2.12 果蝇转基因与抗性评估（原文节选未完整呈现方法步骤，按结果部分对应内容处理）
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2.13 田间种群采集与抗性监测（原文节选未完整呈现方法步骤，按结果部分对应内容处理）
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2.14 统计分析（原文节选未完整呈现，不做推测性补充）
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研究结果
3.1 梨小食心虫对阿维菌素的敏感性
经过25代筛选，AB-R品系对阿维菌素的抗性相比敏感品系AB-S提高了85.55倍（AB-R的LC50 = 4.534 g/L，95%置信限：3.257–7.683；AB-S的LC50 = 0.053 g/L，95%置信限：0.043–0.064）（表1）。
【数据】AB-R LC50 = 4.534 g/L（95% CL：3.257–7.683）；AB-S LC50 = 0.053 g/L（95% CL：0.043–0.064）；抗性倍数：85.55倍；筛选代数：25代
3.2 GmGluCl基因突变检测与解毒酶活性测定
为探究是否存在抗性相关靶标位点突变，从AB-S和AB-R品系中扩增、克隆并测序了GmGluCl基因。未在GmGluCl中检测到导致非同义突变的序列多态性（图S1），表明所观察到的抗性不太可能与靶标位点相关，而可能源于代谢抗性。
为验证这一假设，比较了AB-S与AB-R品系的GST、CarE和P450活性。AB-R品系的GST活性显著高于AB-S品系（t = −4.988；df = 4；P < 0.01）（图1A）。相比之下，CarE（t = 0.417；df = 4；P = 0.698）（图1B）和P450活性（t = 1.087；df = 4；P = 0.338）（图1C）均无显著差异。这些结果提示所观察到的抗性主要与GST活性升高相关。
【数据】GST活性：AB-R显著高于AB-S（t = −4.988；df = 4；P < 0.01）；CarE活性：无显著差异（t = 0.417；df = 4；P = 0.698）；P450活性：无显著差异（t = 1.087；df = 4；P = 0.338）
3.3 AB-S和AB-R品系中增效剂对毒性的影响
表2展示了DEM、PBO和TPP对AB-S和AB-R品系阿维菌素敏感性的增效作用。在AB-S品系中，P450增效剂PBO和CarE增效剂TPP的增效比（SR）分别为1.04和0.87。相比之下，GST增效剂DEM的增效比最高，达1.51。在AB-R品系中，DEM效果最强，SR为2.47，相对增效比（RSR）为1.64；其次为PBO，SR为1.44，RSR为1.38；TPP增效作用最弱，SR为0.97，RSR为1.11。这些发现提示GST和P450可能均参与梨小食心虫对阿维菌素的抗性，其中GST起最主要作用。
【数据】AB-S品系：PBO SR = 1.04，TPP SR = 0.87，DEM SR = 1.51；AB-R品系：DEM SR = 2.47，RSR = 1.64；PBO SR = 1.44，RSR = 1.38；TPP SR = 0.97，RSR = 1.11
3.4 抗性品系AB-R中Gm-mGST1过表达的鉴定
前期研究已证明Gm-mGST1受阿维菌素强烈诱导。因此，首先检测Gm-mGST1表达是否与阿维菌素抗性相关。在测试的所有发育阶段中，AB-R品系的Gm-mGST1表达水平均高于AB-S品系：1龄（t = −2.065；df = 4；P = 0.108）、2龄（t = −5.729；df = 4；P < 0.01）、3龄（t = −3.771；df = 4；P < 0.05）、4龄（t = −6.572；df = 4；P < 0.01）、5龄（t = −14.036；df = 4；P < 0.01）和成虫期（t = −17.622；df = 4；P < 0.01）（图2）。与AB-S品系相比，AB-R品系1至5龄及成虫期的表达水平分别高1.49、2.03、3.30、2.50、6.37和6.06倍（图2）。除1龄外，AB-R品系其余所有发育阶段的Gm-mGST1表达均显著高于AB-S品系。
【数据】AB-R/AB-S表达倍数：1龄1.49倍（P = 0.108），2龄2.03倍（P < 0.01），3龄3.30倍（P < 0.05），4龄2.50倍（P < 0.01），5龄6.37倍（P < 0.01），成虫6.06倍（P < 0.01）
3.5 Gm-mGST1基因的序列结构与特征
基因组和转录组分析显示，Gm-mGST1基因的开放阅读框（ORF）长450 bp，编码149个氨基酸的蛋白，仅含单个外显子。该基因位于5号染色体上（图3B）。功能结构域分析表明，Gm-mGST1含有MAPEG超家族结构域，覆盖第13至143位氨基酸（图3A）。该蛋白具有5个α-螺旋区域（图3C）。预测分子量为16.56 kDa，等电点（pI）为9.62。利用Ramachandran图评估Gm-mGST1的三维结构模型，98.64%的残基位于最适宜或允许区域（图3D），表明预测结构合理且稳定。
【数据】ORF长度：450 bp；编码氨基酸：149个；外显子数：1个；染色体定位：5号染色体；MAPEG结构域：第13–143位氨基酸；α-螺旋数：5个；分子量：16.56 kDa；pI：9.62；Ramachandran图最适宜/允许区域残基比例：98.64%
3.6 敲除Gm-mGST1提高AB-R品系对阿维菌素的敏感性
为构建Gm-mGST1敲除品系，将Cas9蛋白与两条特异性sgRNA的混合物注射入1538粒新鲜卵中。其中57粒孵化（3.71%），57头幼虫中30头发育至蛹期（52.63%），30头蛹中22头成功羽化为成虫（73.33%）（表3）。基因组DNA分析显示，G0代大片段敲除频率为27.27%（表3）。通过三轮单对交配纯化获得纯合敲除品系，Gm-mGST1基因存在395 bp缺失（图4）。Gm-mGST1-KO品系对阿维菌素的LC50为0.278 g/L（95%置信限：0.108–0.496），比AB-S品系高5.3倍，但比AB-R品系低16.31倍（表1）。这些结果证实Gm-mGST1是AB-R品系中的关键抗性基因。
【数据】注射卵数：1538粒；孵化率：3.71%（57/1538）；化蛹率：52.63%（30/57）；羽化率：73.33%（22/30）；G0敲除频率：27.27%；缺失片段：395 bp；KO品系LC50 = 0.278 g/L（95% CL：0.108–0.496）；相比AB-S高5.3倍；相比AB-R低16.31倍
3.7 脱靶效应分析
根据CasOT预测的Gm-mGST1基因每个靶标的前两个潜在脱靶位点的序列色谱图，未发现序列色谱图中存在多重峰，表明这些位点未发生突变。该基因的两个靶标均无脱靶现象（图5）。
【数据】脱靶位点：未检测到突变；分析位点数：每个靶标前2个潜在脱靶位点
3.8 Gm-mGST1的原核表达与纯化
Gm-mGST1在大肠杆菌中成功表达并纯化，经SDS-PAGE和Western blot验证（图6）。两种检测均显示17.38 kDa处单一条带，与含C端His标签的预期蛋白分子量一致。
【数据】SDS-PAGE单一条带：17.38 kDa；Western blot单一条带：17.38 kDa
3.9 重组Gm-mGST1的酶学特性
以CDNB为底物评估重组Gm-mGST1的活性。结果显示，Gm-mGST1对CDNB的Vmax和Km分别为5.84 ± 0.53 μmol/min/mg和1.50 ± 0.38 mM（图7A）。抑制实验表明，阿维菌素对Gm-mGST1具有抑制作用，IC50值为92.40 ± 2.12 μM（图7C）。阿维菌素的抑制效果与阳性对照抑制剂GTX相当，后者IC50值为85.23 ± 1.10 μM（图7B）。
【数据】Vmax = 5.84 ± 0.53 μmol/min/mg；Km = 1.50 ± 0.38 mM；阿维菌素IC50 = 92.40 ± 2.12 μM；GTX IC50 = 85.23 ± 1.10 μM
3.10 Gm-mGST1对阿维菌素的体外代谢
研究了Gm-mGST1与阿维菌素之间潜在的代谢互作。结果显示，第1组（阿维菌素+活性蛋白+GSH）的峰面积显著低于其他三组：第2组（阿维菌素+活性蛋白）、第3组（阿维菌素+灭活蛋白+GSH）和第4组（阿维菌素+灭活蛋白）（F = 35.216，df = 3, 8，P < 0.01）。这些发现表明Gm-mGST1参与阿维菌素的解毒代谢，GSH在此过程中起关键作用。进一步分析均含GSH的活性蛋白处理组（第1组）和灭活蛋白处理组（第3组）的峰面积，计算得出代谢活性为25.06%。Gm-mGST1处理组中未检测到新的代谢产物（图8）。
【数据】组间峰面积差异：F = 35.216，df = 3, 8，P < 0.01；代谢活性：25.06%；新代谢产物：未检出
3.11 异位表达Gm-mGST1的果蝇对阿维菌素耐受性增强
为评估Gm-mGST1单独表达是否足以赋予阿维菌素抗性，利用GAL4/UAS系统在果蝇中异位表达Gm-mGST1。对照品系（w1118）的阿维菌素LC50为25.46 mg/L，而trans-Gm-mGST1品系的LC50为50.18 mg/L。异位过表达Gm-mGST1的果蝇对阿维菌素耐受性提高1.97倍（表4）。
【数据】对照品系LC50 = 25.46 mg/L；转基因品系LC50 = 50.18 mg/L；耐受性提高：1.97倍
3.12 田间梨小食心虫种群的抗性水平与Gm-mGST1表达
与AB-S品系相比，4个田间梨小食心虫种群对阿维菌素表现出不同程度的抗性（表S3，图9A）。其中，FF种群抗性最高，为AB-S品系的25.25倍；YL种群抗性最低。相关性分析显示，田间种群的阿维菌素抗性水平与Gm-mGST1表达水平之间存在显著正相关（图9C）。
【数据】FF种群抗性倍数：25.25倍（相对AB-S）；抗性与表达相关性：显著正相关
讨论与解读
谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是已知参与昆虫杀虫剂抗性的主要解毒酶类，包括昆虫对阿维菌素的抗性。然而，此前虽有研究通过相关性证据或RNAi敲低实验提示GSTs参与阿维菌素抗性，但尚无研究利用CRISPR/Cas9基因编辑提供直接功能验证。本研究首次证明梨小食心虫AB-R品系中Gm-mGST1的过表达与阿维菌素抗性存在因果关系，并通过CRISPR/Cas9敲除、转基因果蝇、原核表达及体外代谢实验等多层次手段加以验证。
传统上评估GSTs在杀虫剂解毒中贡献的方法中，RNAi虽被广泛用于提示基因参与，但因其瞬时敲低和潜在脱靶效应，单独使用RNAi无法确切证明因果关系。通过CRISPR/Cas9对Gm-mGST1进行可遗传敲除，本研究提供了昆虫GST基因直接参与阿维菌素抗性的首个明确功能证据。敲除Gm-mGST1后，AB-R品系的LC50大幅下降，抗性倍数从85.55倍降至16.31倍。转基因果蝇异位表达实验进一步证实Gm-mGST1单独表达即可赋予1.97倍的阿维菌素耐受性提升。田间种群中抗性水平与Gm-mGST1表达呈显著正相关，为该基因作为抗性监测分子标记奠定了基础。
编译者解读：该研究的亮点在于用CRISPR/Cas9基因编辑补齐了GST介导抗性的最后一块因果拼图——从相关性到确定性验证的跨越。多层次证据链（敲除表型、异位表达、体外代谢、田间关联）设计严谨，为害虫抗性分子标记开发提供了范式。值得注意的是，体外代谢实验中未检测到新代谢产物，提示Gm-mGST1可能通过非典型途径参与解毒，或代谢产物不稳定难以捕获。田间种群中抗性水平与基因表达的正相关性虽显著，但样本量有限，实际监测应用仍需更大范围验证。从合成生物学视角看，该基因的启动子元件和蛋白结构也为设计抗性敏感型害虫品系提供了潜在靶点。
参考来源
Su S. CRISPR/Cas9-based evidence that overexpression of Gm-mGST1 mediates abamectin resistance in the oriental fruit moth, Grapholita molesta. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2026. DOI: 10.1016/j.ibmb.2025.104472
DOI: 10.1016/j.ibmb.2025.104472