来源：Pioneering the formation of 2-carboxylic anthraquinone: CRISPR/Cas9-mediated functional validation of Octaketide synthase and Polyketide reductase genes in Aloe vera（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
芦荟（Aloe vera）富含芳香族聚酮类化合物，其中蒽醌类物质如芦荟苷具有重要药用价值，但其生物合成酶学基础长期不明。本研究通过生化重构、光谱表征与CRISPR/Cas9基因编辑三重策略，首次证明八酮合酶（OKS）与聚酮还原酶（PKR）协同作用可将丙二酰辅酶A转化为2-羧基蒽醌，并在芦荟植株中验证了二者对芦荟苷生物合成的必要性。该工作填补了芦荟蒽醌途径关键酶功能验证的空白。
研究背景
植物源性治疗化合物在全球初级卫生保健中占据重要地位。芦荟（Aloe barbadensis Miller）因其广泛的药用、营养及商业价值而备受关注。已有大量生化、转录组和代谢组学研究揭示了芦荟在哮喘、糖尿病、皮肤病及微生物感染等健康问题中的潜在应用价值。芦荟的治疗潜力主要归因于其含有的75余种生物活性次级代谢产物，包括蒽醌、烷基苯、多糖、凝集素、木质素、皂苷等。芦荟苷（Aloin）作为一种蒽酮C-糖苷，是芦荟中含量丰富的蒽醌类化合物，其A型和B型两种异构体已被证明能选择性抑制SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶的蛋白水解和去泛素化活性。
尽管八酮合酶（OKS）早被提出是蒽醌生物合成的起始酶，但仅异源表达OKS始终产生分流聚酮产物，无法生成天然蒽醌骨架，这一"脱轨"机制长期悬而未决。本研究将生化重构、结构表征与CRISPR/Cas9基因编辑相结合，旨在阐明芦荟蒽醌生物合成途径中OKS与聚酮还原酶（PKR）的协同作用机制。
研究方法
2.1 植物材料、载体与菌株
本研究所用健康芦荟（Aloe barbadensis Miller）植株在印度Hisar的Guru Jambheshwar科技大学苗圃条件下维持培养。采集生长旺盛的叶片用于RNA提取及后续分子分析。克隆与质粒繁殖使用E. coli DH5α菌株，异源蛋白表达在E. coli BL21细胞中进行。农杆菌GV3101菌株用于本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片的瞬时表达实验，所用双元载体为pCAMBIA1302。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑实验以农杆菌AGL1菌株为转化宿主。所有细菌培养均在添加相应抗生素的Luria–Bertani（LB）培养基中进行，抗生素包括卡那霉素（50 μg/mL）、氨苄青霉素（100 μg/mL）、利福平（50 μg/mL）和庆大霉素（100 μg/mL）。储备液按制造商建议配制，在高压灭菌后加入。克隆所需的分子生物学酶购自商业供应商（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）。纯化RNA的反转录使用RevertAid试剂盒（Thermo Fisher Scientific, USA）。实验所用全部试剂和化学品均为分析纯或色谱纯。
【数据】菌株：E. coli DH5α、E. coli BL21、农杆菌GV3101、农杆菌AGL1；抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、利福平50 μg/mL、庆大霉素100 μg/mL；培养基：LB
2.2 OKS基因的计算机模拟、理化性质及系统发育分析
#### 2.2.1 芦荟OKS基因的鉴定与理化性质分析
候选八酮合酶（OKS）转录本对应Locus_3851_Transcript_1/9，从前期生成的芦荟叶片转录组数据集中鉴定，该数据集存放于NCBI Sequence Read Archive，登录号为SRR5167034（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）。编码序列被提取并翻译为预测氨基酸序列，用于下游计算分析。为验证结构域架构和催化特征，推导的蛋白序列使用NCBI保守结构域数据库（CDD）和SMART平台进行分析。预测蛋白序列使用ExPASy服务器上的ProtParam程序分析，以确定分子量、理论等电点、不稳定指数和氨基酸组成等关键理化性质（https://web.expasy.org/protparam/）。预测OKS蛋白的亚细胞定位使用Cello 2.0评估（http://cello.life.nctu.edu.tw/）。多序列比对（MSA）使用ClustalX 2.0进行，以检查同源序列中催化残基和其他功能重要基序的保守性（http://www.clustal.org/clustal2/）。
【数据】数据库：NCBI SRA SRR5167034；分析工具：CDD、SMART、ProtParam、Cello 2.0、ClustalX 2.0；基因座位：Locus_3851_Transcript_1/9
#### 2.2.2 OKS蛋白的系统发育分析
为探究芦荟OKS的进化位置，从Ensembl Plants数据库（https://plants.ensembl.org/index.html）基于相似性搜索检索了代表性单子叶和双子叶物种的同源蛋白序列。所选序列（列于表S1）在系统发育重建前进行比对。所选序列的进化历史在MEGA X中通过邻接法重建，成对距离使用泊松校正计算，分支稳健性通过1000次自举重复评估，空位采用成对删除处理。生成树使用Interactive Tree of Life（iTOL）在线工具（https://itol.embl.de/upload.cgi）可视化为环形布局。
【数据】方法：邻接法；距离校正：泊松校正；自举重复：1000次；空位处理：成对删除
2.3 通过*E. coli*重组蛋白表达进行OKS基因功能表征
#### 2.3.1 OKS基因的鉴定与克隆
使用LiCl沉淀法从苗圃条件下维持的芦荟幼嫩健康叶片中提取总RNA。随后按照cDNA合成试剂盒说明将提取的RNA反转录为互补DNA（cDNA）。为进行OKS基因的异源表达，设计了末端带有常规限制性位点的基因特异性引物（表S2）。这些引物基于Locus_3851_Transcript_1/9编码序列（CDS）设计。OKS序列的引物在5′端引入NdeI，3′端引入BamHI。使用基因特异性引物，以Hotstart Phire DNA II聚合酶（Thermo Fisher Scientific, USA）从芦荟cDNA中扩增候选基因。纯化的OKS基因克隆至pJET 1.2克隆载体（CloneJET PCR Cloning Kit, Thermo Fisher Scientific, USA）。确认后，使用相应限制性内切酶切除OKS插入片段，亚克隆至细菌表达载体pET28a（Sigma-Aldrich, Merck, USA）。所得重组构建体转化至感受态E. coli细胞进行繁殖和后续蛋白表达分析。
【数据】RNA提取方法：LiCl沉淀法；限制性位点：NdeI（5′）、BamHI（3′）；聚合酶：Hotstart Phire DNA II；克隆载体：pJET 1.2；表达载体：pET28a
#### 2.3.2 基因表达与蛋白纯化
确认的pET28a-OKS构建体导入E. coli BL21细胞进行异源蛋白生产。挑取单阳性菌落接种至含卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基中，37°C振荡培养（150 rpm）至培养物达到对数中期（OD600 ≈ 0.6）。重组蛋白表达通过向培养物中添加0.5 mM IPTG（β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷）诱导。诱导培养物随后在28°C维持8小时以促进可溶性蛋白组分的积累。未诱导培养物在相同条件下作为对照。细胞通过4°C、7000 rpm离心15分钟收集。N端His标签OKS蛋白在非变性条件下通过Ni-NTA亲和层析（HisPur™ Ni-NTA Magnetic Beads, Thermo Fisher Scientific, USA）分离。纯化组分在12% SDS（十二烷基硫酸钠）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad, Hercules, California, USA）上分析，并用考马斯亮蓝染色显色。蛋白纯度和预期分子量通过使用抗His抗体的Western blot进一步验证。洗脱蛋白组分随后透析以去除过量盐和咪唑，蛋白浓度使用Micro BCA蛋白检测试剂盒（GENETIX）按制造商说明定量。
【数据】诱导剂：0.5 mM IPTG；培养温度：37°C（诱导前）/28°C（诱导后）；振荡：150 rpm；诱导时间：8h；收获：7000 rpm、4°C、15 min；检测：12% SDS-PAGE、抗His Western blot
#### 2.3.3 OKS酶以起始底物的酶活测定
OKS的功能表征通过以丙二酰辅酶A为底物的酶促反应进行。OKS酶活测定参照文献[23]描述的方法并稍作修改。测定体系为500 μL，包含100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0），补充216 μM丙二酰辅酶A和10 μg重组OKS酶。反应在30°C孵育1小时。产物用1000 μL乙酸乙酯提取，经0.22 μm滤膜（HiMedia, India）过滤至琥珀色HPLC进样瓶中。此外，含热灭活OKS酶的对照反应在相同条件下进行，以验证OKS依赖性产物形成。样品在超声波清洗器（Aczet Pvt. Ltd., India）中超声处理15分钟，使用Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0 × 100 mm，2.7 μm粒径，120 Å孔径）HPLC色谱柱（Agilent Technologies, USA）分析，流速为0.8 mL/min。HPLC梯度洗脱使用含0.1% TFA的H₂O和MeOH混合物。洗脱梯度程序如下：30% MeOH（0–5 min）；30–60% MeOH（5–17 min）；60% MeOH（17–25 min）；60–70% MeOH（25–27 min）；70% MeOH（27–35 min）；70–100% MeOH（35–40 min）。
【数据】缓冲液：100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）；底物：216 μM丙二酰辅酶A；酶量：10 μg；温度：30°C；时间：1h；提取：1000 μL乙酸乙酯；流速：0.8 mL/min；色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18
#### 2.3.4 OKS与PKR酶的累积活性
PKR酶的催化活性采用已建立的标准测定条件进行，具体如文献所报道。
【数据】原文未详述
2.4 CRISPR/Cas9介导的芦荟OKS和PKR基因编辑
（方法部分后续内容原文节选未完整提供，此处保留原文对应内容——原文未详述部分以"原文未详述"标注）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 转录组挖掘显示候选基因OKS和PKR参与芦荟蒽醌生物合成
OKS和PKR核苷酸序列及其预测氨基酸翻译已提交至GenBank（NCBI），分别以登录号BankIt2714563 Locus_3851_Transcript_1/9 OR146495和BankIt2620826 AvAKR提供。OKS蛋白的保守结构域分析显示存在催化活性位点（Cys174、His316和Asp349）、丙二酰辅酶A结合位点以及产物结合位点，共同代表查尔酮合酶超家族的保守结构域（图S1）。此外，OKS推导氨基酸序列的多序列比对也显示存在保守催化三联体，与先前报道的其他植物物种相应基因序列一致（图S2）。OKS蛋白的理化性质分析显示，其编码区长度为1212 bp，编码403个氨基酸残基，分子量为44.28 kDa。平均残基质量约为109.87 Da。序列等电点测定为5.85，表示其净电荷为零时的理论pH。此外，该序列在包涵体中表达的概率极低，约为0.62%。计算机模拟预测OKS蛋白定位于细胞质，该预测随后通过烟草叶片中的GFP（绿色荧光蛋白）融合分析得到验证。
【数据】基因长度：1212 bp；氨基酸残基：403个；分子量：44.28 kDa；平均残基质量：109.87 Da；等电点：5.85；包涵体表达概率：0.62%；催化三联体：Cys174、His316、Asp349；GenBank登录号：OR146495（OKS）、AvAKR（PKR）
3.2 系统发育分析表明芦荟OKS与单子叶植物PKS亲缘关系密切
本研究的系统发育分析旨在探究芦荟候选基因与其他作物物种的进化关联。根据系统发育树，芦荟来源的OKS酶与单子叶组成员亲缘关系密切，如木立芦荟（Aloe arborescens）、石刁柏（Asparagus officinalis）、玉米（Zea mays）和燕麦（Avena sativa）。这些物种与芦荟OKS酶共享共同的进化谱系。相比之下，双子叶物种的其他主要分支与OKS分支的亲缘关系较远（图1）。聚类模式表明芦荟来源的OKS与单子叶物种进化关系较近，而其他类群的序列关联较远。
【数据】系统发育方法：邻接法；相关物种：Aloe arborescens、Asparagus officinalis、Zea mays、Avena sativa
3.3 OKS酶表征：重组OKS单独产生分流产物
扩增的OKS编码序列插入pET28a(+)表达载体并导入E. coli BL21细胞进行重组蛋白生产。诱导培养物显示目标蛋白显著积累，主要存在于可溶性组分中。12% SDS–PAGE凝胶电泳分离显示约49 kDa的清晰条带，与His标签OKS蛋白的预期分子量一致。重组细胞表达的蛋白为含有约5 kDa His标签的融合蛋白。His特异性抗体的Western blot验证了His标签OKS融合蛋白的表达（图2a）。重组OKS酶利用起始底物丙二酰辅酶A，合成了SEK4/SEK4b（图2c）——这是结构简单的同源二聚体型III型PKS迄今形成的最长聚酮化合物。保留时间：SEK4（12.7 min）和SEK4b（14.7 min）。热灭活OKS对照中未检测到额外产物峰。
【数据】蛋白大小：~49 kDa（含~5 kDa His标签）；SEK4保留时间：12.7 min；SEK4b保留时间：14.7 min；产物：SEK4/SEK4b
3.4 OKS与PKR协同作用生成天然蒽醌骨架
为理解芦荟苷生物合成机制，本研究考察了重组芦荟OKS和PKR共同作用下丙二酰辅酶A的酶促转化。研究首次证明，在OKS/PKR酶系统的协同作用下，丙二酰辅酶A被转化为1,8-二羟基-3-甲基-9-氧代蒽-2-羧酸（2-羧基蒽醌）。本研究首先考察了产物的质谱特征，考虑其化学结构及与先前报道化合物及其代谢物的相似性。光谱表征前，反应产物经HPLC分析，在指定色谱条件下显示单一主峰（3.6 min）（图S3），而热灭活PKR对照中未检测到额外的PKR相关产物峰。相应组分随后进行ESI-MS、FTIR和¹H NMR分析。
产物经ESI-MS（SCIEX TripleTOF 5600和5600+/SCIEX）正离子模式分析结果如图2d所示。分子阳离子（2-羧基蒽醌，C₁₆H₁₂O₅）以[M]⁺和[M + H]⁺形式被ESI-MS检测到（m/z 284.2936和285.2421）。母体化合物还显示m/z 255.0670（[M + H − CO]⁺）和257.2459（[M + H – C₂H₄]⁺）的碎片离子。母体化合物产物离子表现出的独特碎裂模式被用于辅助其表征。例如，m/z 255.0670（[M + H − CO]⁺）的离子与大黄酚一致（依据大黄酚标准的ESI-MS谱图）。
FTIR进一步分析显示，与大黄酚标准品相比，3412 cm⁻¹处出现更宽的峰，表明存在显著的OH伸缩振动，提示产物中存在特征性羧基。测定提取物还在2950.94和2843.54 cm⁻¹处显示显著峰，以及2981.21和2923.88 cm⁻¹处的肩峰（脂肪族CH）。样品与大黄酚标准的FTIR谱图表现出相似的红外特征：1670至1760 cm⁻¹区域明显峰（芳香CC、氢键CO）、1452 cm⁻¹附近尖锐峰（CH₂）、1150至1160 cm⁻¹区域峰（脂肪族CH₂、OH或CO伸缩振动）。产物谱图在2800至3500 cm⁻¹区域因氢键羧基和含脂肪族CH区域的未知脂肪链的存在，表现出多个尖锐小峰和肩峰，与大黄酚谱图不同，从而表明2-羧基蒽醌是OKS和PKR的累积产物（图2e）。样品IR谱图在Perkin Elmer Spectrum BX II（版本10.6.02）分光光度计上以KBr压片记录。
¹H NMR谱图在Bruker Advance III分光光度计上于400 MHz、CDCl₃中记录，显示δH 12.161和12.054 ppm信号，表明存在强酸性基团（如羧酸COOH）或强酸性质子；五个邻位偶合芳香质子（δH 7.85、7.70、7.28、7.13 ppm），其中7.85 ppm和7.70 ppm处双峰的偶合常数（J）分别为9.6 Hz和10.8 Hz；一个与不饱和碳相连的质子（δH 5.36 ppm，J-4.4 Hz）；六个与官能团或饱和碳（CH₂或CH₃）相关的质子（δH 4.14 ppm，J-6.8 Hz）；δH 1.2（J-7.2 Hz）、2.0、2.1和2.4 ppm处的化学位移提示存在八个与脂肪族或饱和碳原子相关的质子；以及约六个与末端甲基相关的质子（δH 0.84 ppm，J-6 Hz）（图2f）。
【数据】产物分子式：C₁₆H₁₂O₅；ESI-MS：[M]⁺ m/z 284.2936，[M+H]⁺ m/z 285.2421；碎片离子：m/z 255.0670（[M+H−CO]⁺）、257.2459（[M+H−C₂H₄]⁺）；HPLC保留时间：3.6 min；FTIR特征峰：3412 cm⁻¹（OH）、2950.94/2843.54 cm⁻¹（脂肪族CH）；¹H NMR：δH 12.161/12.054（COOH）、7.85/7.70/7.28/7.13（芳香质子）、5.36（不饱和CH）、4.14（CH₂/CH₃）、0.84（末端CH₃）
3.5 CRISPR/Cas9介导的OKS和PKR基因突变揭示其在芦荟苷生物合成中的作用
CRISPR-OKS和CRISPR-PKR构建体（图3a）使用双元载体pRGEB31成功制备，验证后的质粒有效转化至农杆菌细胞（AGL1）。携带CRISPR-OKS和CRISPR-PKR构建体的各重组农杆菌细胞用于转化芦荟芽。经过严格筛选过程，每个构建体均获得独立转化芽。推定转化芽转移至生根培养基，随后在盆装Soilrite混合物中驯化。植株在移入温室前于生长室中成功驯化。
与未编辑对照芦荟系相比，编辑株系中芦荟苷含量显著降低——OKS突变体降低2.54倍，PKR突变体1和2分别降低1.23倍和1.53倍。这些结果证实OKS和PKR均参与芦荟中芦荟苷的生物合成。
【数据】OKS突变体芦荟苷降低：2.54倍；PKR突变体1降低：1.23倍；PKR突变体2降低：1.53倍；转化菌株：农杆菌AGL1；载体：pRGEB31
3.6 OKS在本氏烟草中的瞬时表达与亚细胞定位
pCAMBIA1302-based GFP融合构建体用于农杆菌浸润实验。共聚焦显微照片显示：（a）未处理对照叶片，（b）细胞质分布，（d）未靶向对照的分布情况。
【数据】载体：pCAMBIA1302；宿主：本氏烟草（Nicotiana benthamiana）；定位：细胞质
讨论与解读
本研究提供了直接的生化和遗传证据，证明芦荟中芦荟苷/蒽醌生物合成需要OKS与下游修饰酶PKR的协同活性。研究采用E. coli中OKS异源表达和芦荟中CRISPR/Cas9介导的OKS和PKR编辑来阐明该机制。OKS（Locus_3851_Transcript_1/9）和PKR（unigene_74658）序列从先前报道的芦荟叶片转录组数据集中获取。OKS蛋白的理化性质分析和结构域分析代表了CHS超家族的保守结构域，这与先前植物III型PKS酶的结构和突变分析一致——保守催化三联体（Cys、His、Asp）是其聚酮链延伸过程中脱羧-缩合反应的基础。OKS单独表达产生SEK4和SEK4b的现象与多项先前研究一致，这些研究报道了芦荟来源的芳香族八酮化合物的形成。本研究的关键突破在于证明PKR的加入改变了反应谱，使产物通量导向2-羧基蒽醌——这是天然蒽醌骨架的正确前体。CRISPR/Cas9编辑实验进一步在植株水平验证了OKS和PKR对芦荟苷积累的必要性。
编译者解读
本研究的方法论值得关注：单一酶学重构的"死胡同"（OKS单独产生分流产物）通过引入第二个酶（PKR）实现了通路"纠偏"，这种逐步重构策略对解析复杂植物天然产物途径具有示范意义。CRISPR/Cas9在芦荟这种多肉植物中的成功编辑也拓展了药用植物基因编辑的物种范围。不过，编辑株系中芦荟苷仅降低1.23–2.54倍而非完全消除，提示可能存在冗余酶或旁路代谢；此外，2-羧基蒽醌到芦荟苷之间的下游步骤（羟化、脱羧、糖基化等）尚未在酶学水平完全重构，这为后续研究留下了空间。从合成生物学应用看，若能在大肠杆菌或酵母中重建完整的OKS-PKR-修饰酶级联，将有望实现蒽醌类药物的微生物细胞工厂生产。
参考来源
Jangra A. Pioneering the formation of 2-carboxylic anthraquinone: CRISPR/Cas9-mediated functional validation of Octaketide synthase and Polyketide reductase genes in Aloe vera. International Journal of Biological Macromolecules, 2026. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.153385
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.153385