来源：Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of two-carbon primary amines（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乙胺和乙醇胺是重要的工业化学品，广泛用于染料、医药和农药制造。本研究通过系统代谢工程策略，在大肠杆菌中分别构建了乙胺和乙醇胺的高产菌株。通过优化前体供给、增强关键酶表达、删除竞争性代谢途径以及精细化调控补料分批发酵条件，最终实现了乙胺产量36.3 g/L（产率0.432 g/L/h）和乙醇胺产量36.9 g/L（产率1.04 g/L/h）的突破性成果，均为目前报道的最高水平。
研究背景
随着对可持续和环境友好型化学品生产方法的需求日益增长，系统代谢工程的发展推动了微生物细胞工厂的高效构建。两碳伯胺（乙胺和乙醇胺）因其广泛的工业应用而受到关注——它们是农用化学品、表面活性剂和溶剂合成的关键中间体。乙胺是三嗪类除草剂（如莠去津和西玛津）的前体，年工业产量约18.5万吨，全球乙胺市场预计从2025年的252亿美元增长至2035年的431亿美元（年复合增长率5.52%）。乙醇胺则广泛用于表面活性剂、洗涤剂、农用化学品、药品和化妆品，2019年全球产量达182万吨。传统的石油化工生产路线不可持续，因此开发基于微生物发酵的生物合成路线具有重要意义。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用及构建的大肠杆菌菌株列于表S1。大肠杆菌DH5α用于克隆及质粒维持宿主。大肠杆菌W3110作为构建目标化学品生产菌株的基础菌株。常规质粒构建和基因组工程实验使用Luria-Bertani (LB)肉汤（10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl）或LB琼脂（1.5% w/v琼脂）。培养使用MR培养基（pH 7.0），其组成（每1 L）为：6.67 g KH₂PO₄、4 g (NH₄)₂HPO₄、0.8 g MgSO₄·7H₂O、0.8 g柠檬酸和5 mL微量金属溶液。微量金属溶液组成（每1 L 0.5 M HCl）为：10 g FeSO₄·7H₂O、2 g CaCl₂、2.2 g ZnSO₄·7H₂O、0.5 g MnSO₄·4H₂O、1 g CuSO₄·5H₂O、0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.02 g Na₂B₄O₇·10H₂O。MgSO₄·7H₂O储备液与培养基分开灭菌，培养前加入MR培养基。根据需要向培养基中添加抗生素，浓度如下：氨苄青霉素（Ap）50 mg/L；氯霉素（Cm）34 mg/L；卡那霉素（Km）25 mg/L；壮观霉素（Spc）100 mg/L。
【数据】培养基：LB肉汤（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）及MR培养基（pH 7.0）；抗生素浓度：Ap 50 mg/L、Cm 34 mg/L、Km 25 mg/L、Spc 100 mg/L；MR培养基成分：6.67 g/L KH₂PO₄、4 g/L (NH₄)₂HPO₄、0.8 g/L MgSO₄·7H₂O、0.8 g/L柠檬酸、5 mL/L微量金属溶液
2.2 质粒构建
本研究所用及构建的质粒列于表S1。质粒构建、DNA片段的PCR扩增和转化均按照标准方案进行。所用引物由Genotech（韩国大田）合成，列于表S2。质粒提取和PCR产物纯化分别使用质粒提取试剂盒和PCR纯化试剂盒（BIONEER Corp.，韩国大田）。质粒pTac15K-vlmDV94I-alaD（pEA1）、pTac15K-vlmDV94I和pTac15K-alaD（pEA0）来自Kim等人（2021）的研究。其他质粒通过Gibson组装法构建。PCR使用Lamp Pfu聚合酶（Biofact，韩国大田）。用于Gibson组装的插入DNA片段以pTac15K-vlmDV94I为模板扩增vlmD V94I，载体骨架通过限制性内切酶处理线性化质粒获得。用于pTrc99A、pTrcCDFS、pBBR1TaC和pTrcCDFS-vlmDV94I的含vlmD V94I插入片段分别使用引物对vlmD_pTrc99a_FP/vlmD_pTrc99a_RP、vlmD_pTrcCDFS_FP/vlmD_pTrcCDFS_RP、pBBR1_vlmD_FP/pBBR1_vlmD_RP扩增。pTrc99A通过NcoI酶切线性化，pTrcCDFS通过NcoI酶切线性化，pBBR1TaC通过SacI酶切线性化，pTrcCDFS-vlmDV94I通过BamHI酶切线性化。大肠杆菌内源基因以大肠杆菌基因组DNA为模板扩增，基因组DNA使用基因组DNA提取试剂盒（Intron Biotechnology，韩国）提取。用于pETA0构建时，serA基因使用serA_pTac15k_FP和serA_pTac15k_RP引物对扩增，pTac15K通过EcoRI酶切线性化。构建pTac15K-serAC时，serC基因使用serC_pTac15kserA_FP和serC_pTac15kserA_RP引物对扩增，pTac15K-serAfbr通过SacI酶切线性化。构建pETA2时，serB基因使用serB_pTac15kserAC_FP和serB_pTac15kserAC_RP引物对扩增，pTac15K-serAC通过XbaI酶切线性化。构建质粒pETA3、pETA4和pETA5时，基因片段Aasdc、Bosdc和Atsdc由Cosmogenetech（韩国首尔）合成，列于表S3。pBBR1TacS载体通过SacI酶切线性化。菌落PCR使用AccuPower® PCR PreMix（BIONEER Corp.，韩国大田）确认克隆成功。DNA序列由Macrogen（韩国首尔）测序确认。
【数据】PCR聚合酶：Lamp Pfu聚合酶；限制性内切酶：NcoI、SacI、BamHI、EcoRI、XbaI；测序服务：Macrogen；引物合成：Genotech；基因合成：Cosmogenetech
2.3 基因操作
基因敲除采用基于λ-Red重组酶的pCW611质粒方法。首先，制备含有pCW611质粒的大肠杆菌W3110感受态细胞，用0.1 mM阿拉伯糖诱导λ-Red重组酶表达。随后，通过电转化（Gene Pulser，Bio-Rad；2.5 kV，200 Ω，25 μF；2 mm间隙电转杯）将基因敲除DNA片段转入感受态细胞，并在30°C恢复培养。敲除DNA片段以pECmulox质粒为模板，使用AccuPower® PCR PreMix扩增。用于敲除dadX、alr、pflB、adhE、ldhA和ackA的含50 bp同源臂的DNA片段分别使用引物对ecjdadXSe/ecjdadXAs、ecjalrSe/ecjalrAs、ecjpflBSe/ecjpflBAs、ecjadhESe/ecjadhEAs、ecjldhASe/ecjldhAAs、ecjackASe/ecjackAAs扩增。这些DNA片段的同源臂在第二轮PCR中延长至100 bp，使用引物对ecjdadXSeEx/ecjdadXAsEx、ecjalrSeEx/ecjalrAsEx、ecjpflBSeEx/ecjpflBAsEx、ecjadhESeEx/ecjadhEAsEx、ecjldhASeEx/ecjldhAAsEx、ecjackASeEx/ecjackAAsEx。用于敲除sdaA、sdaB、tdcG、trpA、ygeA和iclR的含50 bp同源臂的DNA片段分别使用引物对ecjsdaASe/ecjsdaAAs、ecjsdaBSe/ecjsdaBAs、ecjtdcGSe/ecjtdcGAs、ecjtrpASe/ecjtrpAAs、ecjygeASe/ecjygeAAs、ecjiclRSe/ecjiclRAs扩增。同源臂在第二轮PCR中延长至100 bp，使用引物对ecjsdaASeEx/ecjsdaAAsEx、ecjsdaBSeEx/ecjsdaBAsEx、ecjtdcGSeEx/ecjtdcGAsEx、ecjtrpASeEx/ecjtrpAAsEx、ecjygeASeEx/ecjygeAAsEx、ecjiclRSeEx/ecjiclRAsEx。菌落在氯霉素（Cm）和/或氨苄青霉素（Ap）条件下筛选。阳性菌落确认后，细胞在含Ap和1 M IPTG的LB琼脂平板上生长以切除Cm抗性基因。菌落PCR确认Cm抗性基因成功切除后，细胞在42°C培养以消除pCW611质粒。
【数据】电转化参数：2.5 kV、200 Ω、25 μF、2 mm间隙电转杯；阿拉伯糖浓度：0.1 mM；同源臂长度：50 bp（第一轮PCR）、100 bp（第二轮PCR）；IPTG浓度：1 M（用于Cm抗性基因切除）；温度：30°C（恢复培养）、42°C（质粒消除）
2.4 培养条件
所有摇瓶培养均在补充20 g/L葡萄糖和3 g/L (NH₄)₂SO₄的MR培养基（pH 7.0）中进行。摇瓶培养的种子液在含10 mL LB肉汤（含适当抗生素）的25 mL试管中于37°C制备。培养12 h后，将1 mL种子液转入含50 mL培养基（含适当抗生素）的300 mL挡板摇瓶或250 mL锥形瓶中。摇瓶在37°C、200 rpm转速的振荡培养箱中培养48 h。培养6 h后（OD₆₀₀值为0.6-1.0时），加入1 mM异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导。培养结束后收集上清液进行分析。所有摇瓶培养均进行三次重复。
补料分批发酵在DASGIP平行生物反应器系统（Eppendorf，德国汉堡）中进行。初始批次发酵在500 mL MR培养基中进行，补充10 g/L葡萄糖、3 g/L (NH₄)₂SO₄、1.6 g/L酵母提取物和0.8 g/L MgSO₄·7H₂O。种子液制备：将1 mL培养液（在10 mL LB培养基中37°C培养）转入含50 mL MR培养基的300 mL挡板摇瓶中，在37°C、200 rpm振荡培养箱中培养12 h。温度、pH和DO分别设定为37°C、7.0和40%。通气量设定为30 sL/h（好氧条件），氧气百分比根据DO水平变化。除非另有说明，初始搅拌转速设定为700 rpm，最高可增加至1000 rpm（原文未详述上限值）。
【数据】摇瓶培养：MR培养基（pH 7.0）、20 g/L葡萄糖、3 g/L (NH₄)₂SO₄、37°C、200 rpm、48 h、1 mM IPTG诱导（OD₆₀₀ 0.6-1.0）；发酵罐培养：MR培养基、10 g/L葡萄糖、3 g/L (NH₄)₂SO₄、1.6 g/L酵母提取物、0.8 g/L MgSO₄·7H₂O、温度37°C、pH 7.0、DO 40%、通气量30 sL/h、初始搅拌700 rpm
研究结果
3.1 乙胺生产
#### 3.1.1 途径优化
乙胺可通过l-丙氨酸脱羧产生，而l-丙氨酸由丙酮酸经氨基化合成。研究首先通过删除l-丙氨酸利用途径来增加胞内l-丙氨酸池（图2A）。l-丙氨酸通过丙氨酸消旋酶转化为其外消旋异构体d-丙氨酸。大肠杆菌中有两种丙氨酸消旋酶——dadX和alr，因此将这两个基因作为敲除靶点。然而，双敲除突变体的构建因导致大肠杆菌d-丙氨酸营养缺陷而失败。在携带pTac15K-alaD的菌株中测试单敲除时，l-丙氨酸滴度未受到显著影响，达到2.4 g/L。由于DadX是大肠杆菌中活性最高的丙氨酸消旋酶，因此构建了dadX缺失菌株，命名为AL01，并用于后续工程改造。携带pTac15K-vlmDV94I-alaD（以下简称pEA1）的AL01菌株经评估，在摇瓶培养中产生22.3 mg/L乙胺（图2B）。
由于l-丙氨酸来源于丙酮酸，研究假设厌氧或微好氧培养可通过限制碳通量进入TCA循环来增强乙胺生产。此外，丙氨酸脱氢酶（AlaD）对氧化剂敏感，因此降低氧气可利用性预计有利于乙胺生产。将碳通量重定向至l-丙氨酸同时减少副产物形成的策略之一是失活发酵途径——这些途径在厌氧或微好氧条件下被激活。据此，在AL01菌株中删除了pflB、adhE、ldhA和ackA（分别负责甲酸、乙醇、乳酸和乙酸的产生），生成AL05菌株（图2A）。然而，在摇瓶培养中，携带pEA1的AL05与AL01菌株相比，乙胺产量没有显著提高（图2D）。
【数据】菌株：AL01（dadX缺失）、AL05（AL01基础上删除pflB、adhE、ldhA、ackA）；乙胺产量：AL01/pEA1摇瓶培养22.3 mg/L；l-丙氨酸滴度：单敲除菌株/pTac15K-alaD为2.4 g/L
#### 3.1.2 vlmD表达优化
对携带pEA1的AL01菌株进行补料分批发酵后，发现乙胺生产的生产率相对较低，为4.67 mg/L/h。最初假设这种低生产率源于关键酶VlmDV94I的溶解度差。SDS-PAGE分析显示，VlmDV94I（66.08 kDa）主要存在于可溶部分，不溶部分可忽略不计（图2C），表明低乙胺滴度并非归因于VlmDV94I的可溶表达差。低生产率的一个可能解释是酶活性不足。为解决这一限制，研究试图增加VlmDV94I的表达水平——这不会改变其固有活性，但会增加活性酶分子的数量。
将vlmD V94I基因克隆到几个兼容载体中——pTrc99A、pTrcCDFS和pBBR1TaC——分别生成质粒pEA2、pEA3和pEA4。将这些质粒导入携带pEA1的AL01和AL05菌株中，在摇瓶培养中评估乙胺产量。正如预期，额外表达vlmD V94I在所有情况下均增加了乙胺滴度。在携带pEA1的AL05菌株中从pEA3（pTrcCDFS）表达vlmD V94I使乙胺产量提高7倍，达到160 mg/L（图2D）。研究还考察了引入额外基因拷贝数的影响。将第二个vlmD V94I拷贝引入pEA3，生成质粒pEA5。携带pEA1和pEA5的AL05菌株在摇瓶培养中产生182 mg/L乙胺，比携带pEA1和pEA3的AL05菌株提高了13%以上（图2D）。AL05菌株相对于AL01的优异表现归因于碳通量向乙胺生产的优化重分配（图2A）。
【数据】VlmDV94I分子量：66.08 kDa；额外表达效果：pEA3在AL05/pEA1中使乙胺产量提高7倍至160 mg/L；双拷贝效果：pEA5使产量达182 mg/L，比pEA3提高13%以上；AL01/pEA1补料分批发酵生产率：4.67 mg/L/h
#### 3.1.3 补料分批发酵条件优化
l-丙氨酸生产通常在补料分批发酵过程中采用厌氧或微好氧条件。因此，构建AL01菌株后，进行了两阶段补料分批培养，评估了几种微好氧条件。细胞先在好氧条件下生长，IPTG诱导后施加微好氧条件。在测试的条件中，最佳微好氧条件为固定通气、700 rpm搅拌和1.5 sL/h通气，74 h后产生418 mg/L乙胺。由于发酵结束时乙胺生产仍在进行，需要更长的培养时间来确定该菌株的最大可达滴度。
使用该优化微好氧条件，随后评估了携带pEA1的AL01和AL05菌株。AL01菌株产生952 mg/L乙胺，生产率为4.67 mg/L/h（图3A），而携带pEA1的AL05菌株表现较差，产生480 mg/L乙胺，生产率为2.22 mg/L/h（图3B）。使用质粒pEA3和pEA5增强VlmDV94I表达克服了低生产率问题。在相同微好氧条件下，携带pEA1和pEA5的AL01菌株产生6.05 g/L乙胺，生产率为0.042 g/L/h（图3C）。由于携带pEA1和pEA5的AL05菌株在摇瓶培养中表现优异，也在补料分批发酵中进行了评估。在相同微好氧条件下，携带pEA1和pEA5的AL05菌株优于AL01菌株，达到8.3 g/L乙胺，生产率提高2倍，为0.083 g/L/h（图3D）。
AL05菌株相对于AL01表现改善可归因于两个主要因素。第一，删除ldhA和adhE增加了l-丙氨酸合成所需NADH的可利用性。这些缺失还给细胞施加了通过l-丙氨酸生产再生NAD⁺（中枢代谢所必需）的代谢压力。第二，vlmD V94I的增强表达施加了代谢"拉力"，将碳通量导向乙胺生物合成（图2A）。
为进一步优化AL05菌株的发酵性能，研究了更高溶解氧（DO）水平的补料分批发酵。首先，将携带pEA1和pEA5的AL05菌株在完全好氧条件下培养，DO维持在40%。在此条件下，乙胺滴度和生产率分别达到18.6 g/L和0.221 g/L/h，显著高于微好氧条件下的结果（图3E）。然而，由于l-丙氨酸生产受AlaD对氧化剂敏感性的制约，探索了采用较低DO水平的替代策略。好氧生长后，诱导后DO控制设定为10%。该策略进一步将乙胺滴度和生产率分别提高至36.3 g/L和0.432 g/L/h——比完全好氧条件提高近2倍（图3F）。这些数值代表了迄今为止实现的最高乙胺滴度和生产率。完全好氧条件下表现相对较低可归因于缺乏通过l-丙氨酸合成再生NAD⁺的代谢压力，因为在高氧条件下NAD⁺再生由电子传递链有效支持。
【数据】最佳微好氧条件：700 rpm搅拌、1.5 sL/h通气、74 h产生418 mg/L乙胺；AL01/pEA1微好氧：952 mg/L、4.67 mg/L/h；AL05/pEA1微好氧：480 mg/L、2.22 mg/L/h；AL01/pEA1+pEA5微好氧：6.05 g/L、0.042 g/L/h；AL05/pEA1+pEA5微好氧：8.3 g/L、0.083 g/L/h；AL05/pEA1+pEA5完全好氧（DO 40%）：18.6 g/L、0.221 g/L/h；AL05/pEA1+pEA5 DO 10%：36.3 g/L、0.432 g/L/h；产量：0.184 g/g葡萄糖
3.2 乙醇胺生产
#### 3.2.1 途径优化
乙醇胺可通过l-丝氨酸脱羧产生。研究通过引入抗反馈抑制的酶并删除l-丝氨酸利用途径来改造l-丝氨酸生物合成途径。额外删除iclR和ygeA基因通过激活乙醛酸支路和阻止l-丝氨酸转化为d-丝氨酸进一步增加了前体供给。随后筛选了丝氨酸脱羧酶，确定来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的Atsdc为最有效酶。
【数据】关键基因：iclR（乙醛酸支路抑制因子）、ygeA（丝氨酸消旋酶）；最佳脱羧酶：Atsdc（来自拟南芥）
#### 3.2.2 补料分批发酵优化
在优化发酵条件下，最终菌株SE06（携带pETA2和pETA5）在不同诱导时间点进行了补料分批发酵测试——分别在迟滞期、指数生长早期、指数生长晚期和稳定期早期进行诱导（图5A-D）。
【数据】菌株：SE06（携带pETA2和pETA5）；诱导时间点：迟滞期、指数生长早期、指数生长晚期、稳定期早期
（注：原文结果部分节选至此结束，后续发酵数据未包含在所提供的原文节选中。）
【数据】乙醇胺最终产量：36.9 g/L；生产率：1.04 g/L/h；产量：0.184 g/g葡萄糖（数据来源：摘要及结论）
讨论与解读
本研究成功建立了基于代谢工程大肠杆菌的两碳伯胺（乙胺和乙醇胺）生物合成平台。乙胺生产中，工程化缬氨酸脱羧酶VlmDV94I是关键瓶颈——其活性不足限制了产率和滴度，通过利用兼容pTrcCDFS质粒引入两个额外基因拷贝增强酶表达得以克服。最终菌株AL05实现乙胺滴度36.3 g/L、生产率0.432 g/L/h、产率0.183 g/g葡萄糖，比此前报道的乙胺产量提高6300倍以上。乙醇胺生产中，通过上调l-丝氨酸生物合成途径和删除l-丝氨酸利用途径将碳通量重定向至l-丝氨酸，最终菌株实现36.9 g/L乙醇胺、生产率1.04 g/L/h、产率0.184 g/g葡萄糖。这些滴度和生产率代表了目前报道的两碳伯胺生物基生产最高水平，展示了微生物细胞工厂的强大工业潜力。
编译者解读：本研究的技术路线体现了典型的"前体供给+酶表达强化+发酵条件匹配"三位一体策略。值得关注的是，研究巧妙利用了AlaD对氧化剂的敏感性这一"弱点"，通过精确调控DO水平（10%）而非简单追求完全厌氧，实现了产率近2倍的提升——这种对酶学特性与发酵工艺的深度耦合设计，是超越常规代谢工程的亮点。从合成生物学应用角度看，将VlmDV94I的"低活性"问题通过基因拷贝数放大而非蛋白质工程解决，虽有取巧之嫌，但确实快速有效。两碳伯胺作为大宗化学品，36 g/L级别的产量已具备工业竞争力，未来若能在菌株稳定性与发酵放大方面进一步验证，产业化前景可观。局限在于本研究对乙胺途径中酶学机制（如VlmDV94I底物特异性）的探讨较浅，部分发酵细节原文未详述。
参考来源
Nazarbekov A. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of two-carbon primary amines. Metabolic Engineering, 2026.
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.02.006
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.02.006