来源：Metabolic engineering of Escherichia coli for highly efficient N-acetylneuraminic acid production（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）是多种生物医药产品的重要前体，但其微生物合成长期受制于碳代谢流偏向乙酸溢出的瓶颈。本研究以大肠杆菌为底盘，系统整合了Neu5Ac合成途径构建、PEP代谢流重分配及乙酸合成弱化等多层策略，最终工程菌株NEA-27在5 L生物反应器中于30°C条件下56小时产Neu5Ac达77.12 g/L，产率0.217 g/g葡萄糖，生产强度1.38 g/L/h，为目前报道的最高效从头合成水平。
研究背景
大肠杆菌作为研究最深入的模式微生物之一，已被广泛应用于各类化学品的生物制造。然而，在大肠杆菌细胞工厂的发酵过程中，碳流向乙酸溢出的问题频繁出现。乙酸的大量积累对菌体生长产生不利影响，进而抑制目标产物的合成效率，目前已成为制约大肠杆菌稳定工业应用的主要障碍。在自然环境中，大肠杆菌利用乙酸的合成与代谢作为策略性缓冲，以维持胞内碳流平衡并保障能量供给——乙酸合成过程伴随ATP产生。但在生物制造场景下，大量碳源被供给并期望高效转化为目标产物，乙酸合成与分解代谢之间的平衡容易被打破，导致乙酸积累。值得注意的是，当目标产物以磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）为前体时（如芳香族氨基酸及其衍生物），乙酸积累尤为突出。本研究以Neu5Ac的生物合成为模型，系统探索了优化PEP在目标产物合成、碳源同化及中心碳代谢途径中分配的策略，同时减少乙酸积累，实现目标产物的高效生产。
研究方法
2.1 菌株、质粒与化学品
本研究所用引物列于补充材料中，所用及所构建的菌株和质粒列于表1。大肠杆菌DH5α作为质粒构建的克隆宿主。ClonExpress® II一步克隆试剂盒购自Vazyme Biotech Co., Ltd.。所有限制性内切酶、Primer STAR HS DNA聚合酶及T4 DNA连接酶均购自TaKaRa Bio, Inc.。引物由GENEWIZ Bio, Inc.合成。
【数据】宿主菌：E. coli DH5α；试剂来源：Vazyme、TaKaRa、GENEWIZ
2.2 基于CRISPR/Cas9系统的染色体整合或基因敲除
参照Li等（Li et al., 2015）描述的方法，使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行基因操作，具体步骤如前人研究所述（Ma et al., 2022）。简要流程如下：首先，利用CRISPR RGEN Tools（https://www.rgenome.net/cas-designer/）设计一对用于切割靶基因位点的20 bp互补序列。合成一对单链DNA（ssDNA）引物后退火形成双链DNA（dsDNA），该dsDNA包含20 bp特异性gRNA间隔序列及pGRB质粒骨架的同源侧翼序列。使用ClonExpress® II一步克隆试剂盒通过同源重组将dsDNA与线性化pGRB连接。选择假基因如yeep和ycgh作为整合位点。基因组DNA片段整合的第一步是将pREDCas9质粒转化至大肠杆菌细胞中。由于pREDCas9质粒为温度敏感型质粒，含pREDCas9质粒的细胞于32°C过夜培养，然后按1%比例接种至2 × YT培养基中，继续于32°C培养。将供体DNA片段和合适的gRNA质粒电转化至含pREDCas9质粒的感受态细胞后，向混合体系补充1 mL SOC培养基，于32°C复苏2小时。细胞涂布于含壮观霉素和氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性重组子，随后通过菌落PCR和DNA测序进行确认。gRNA质粒的消除由0.2%阿拉伯糖诱导。细胞涂布于LB琼脂平板上，在氨苄青霉素平板上不生长但能在壮观霉素平板上生长的菌落即为丢失gRNA质粒的细胞。pREDCas9质粒的消除通过42°C过夜培养实现。
【数据】CRISPR/Cas9编辑温度：32°C（培养/复苏）；gRNA质粒消除：0.2%阿拉伯糖；pREDCas9消除：42°C过夜；筛选标记：壮观霉素+氨苄青霉素
2.3 摇瓶发酵
将琼脂斜面上生长的大肠杆菌细胞转移至500 mL摇瓶中的30 mL种子培养基中，于35°C、220 rpm振荡培养约12小时。随后，按10%接种比将种子培养液转移至发酵培养基中。发酵过程持续约36小时，温度35°C、转速220 rpm。发酵过程中，用微量注射器添加氢氧化铵维持pH在7.0左右，以酚红作为pH指示剂。必要时添加1 mL 60%葡萄糖以维持细胞生长和产物合成。种子培养基组成：20 g/L葡萄糖、3 g/L酵母粉、2 g/L (NH4)2SO4、2 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4·7H2O、2.8 mg/L FeSO4·7H2O、1.2 mg/L MnSO4·7H2O、0.1 mg/L VH、0.5 mg/L VB1、1 mL/L微量元素混合物（配方如前人研究所述，Ma et al., 2021b）及1滴消泡剂。发酵培养基组成：20 g/L葡萄糖、3 g/L酵母粉、4 g/L (NH4)2SO4、6.67 g/L KH2PO4、2.5 g/L MgSO4·7H2O、1 g/L NaCl、10 mg/L FeSO4·7H2O、1.2 mg/L MnSO4·7H2O、25 mg/L CaCl2·2H2O、0.1 mg/L VH、0.5 mg/L VB1、1 mL/L微量元素混合物、2%酚红指示剂及1滴消泡剂。发酵开始时添加10 g/L木糖以诱导T7 RNA聚合酶表达。
【数据】种子培养：30 mL/500 mL摇瓶，35°C，220 rpm，12 h；接种比：10%；发酵时间：36 h；pH：7.0（氢氧化铵维持）；葡萄糖补加：1 mL 60%葡萄糖；种子培养基葡萄糖：20 g/L；发酵培养基葡萄糖：20 g/L；木糖诱导：10 g/L
2.4 2 L平行生物反应器补料分批发酵
温度优化在由4个2 L生物反应器组成的平行反应器系统（T&J-Minibox 2.4 L*4，Parallel-Bioreactor，上海，中国）中进行。种子在琼脂斜面上培养后，用无菌水洗脱用于发酵。补料分批发酵所用发酵培养基与摇瓶发酵相同，装液量600 mL。发酵过程在28、30、32和35°C不同温度下进行，pH设定为7.0。通过控制搅拌转速和通气速率，反应器内溶解氧维持在20–40%之间。发酵开始时添加10 g/L木糖诱导T7 RNA聚合酶表达。发酵过程中，以适当速率补充80%葡萄糖，使反应器内残余葡萄糖浓度维持在1 g/L以下。
【数据】反应器：2 L平行生物反应器（T&J-Minibox 2.4 L*4）；装液量：600 mL；温度：28/30/32/35°C；pH：7.0；溶解氧：20–40%；木糖：10 g/L；补糖：80%葡萄糖，残余糖<1 g/L
2.5 5 L生物反应器补料分批发酵
补料分批发酵在5 L生物反应器（BIOTECH-5BG，BaoXing Bio，上海，中国）中进行。种子培养基和发酵培养基与摇瓶发酵相同。种子在反应器中以3 L装液量于35°C培养，pH设定为7.0。通过控制搅拌转速和通气速率，反应器内溶解氧维持在20–40%之间。当种子干重（DCW）达到约5 g/L时，移出一定量种子培养液，补充新鲜发酵培养基，使最终体积为3 L，接种比为15%。发酵开始时添加10 g/L木糖诱导T7 RNA聚合酶表达。发酵过程中，以适当速率补充80%葡萄糖，使反应器内残余葡萄糖浓度维持在1 g/L以下。
【数据】反应器：5 L（BIOTECH-5BG）；装液量：3 L；种子培养温度：35°C；pH：7.0；溶解氧：20–40%；接种时DCW：约5 g/L；接种比：15%；木糖：10 g/L；补糖：80%葡萄糖，残余糖<1 g/L
2.6 胞内ATP水平检测
收集的细胞用预冷PBS缓冲液洗涤，并用裂解缓冲液快速裂解。随后，使用基于荧光素酶的Enhanced ATP Assay Kit S0027（Beyotime Biotechnology，上海，中国）测定胞内ATP水平，方法如前人研究所述（Jiang et al., 2023）。ATP浓度使用ATP标准曲线归一化，以nmol/g DCW表示。
【数据】检测方法：荧光素酶法（Enhanced ATP Assay Kit S0027）；单位：nmol/g DCW
2.7 反转录PCR
使用RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit（Tiangen Biotech，北京，中国）提取总RNA。使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time，TaKaRa，大连，中国）将总RNA反转录为cDNA。随后，使用StepOnePlus Real-Time PCR系统（Thermo Fisher Scientific）进行定量PCR。基因表达水平以16S rDNA表达水平为内参进行归一化。
【数据】RNA提取试剂盒：RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit；反转录试剂盒：PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser；qPCR系统：StepOnePlus；内参基因：16S rDNA
2.8 分析方法
发酵液中的Neu5Ac、GlcNAc和ManNAc采用高效液相色谱（HPLC）测定。使用配备RID-20A示差折光检测器的Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪。色谱柱为Aminex® HPX-87H柱（7.8 mm × 300 mm），柱温设定为30°C。流动相为5 mM H2SO4溶液，流速0.5 mL/min。
【数据】HPLC仪器：Shimadzu LC-20AT + RID-20A；色谱柱：Aminex® HPX-87H（7.8 mm×300 mm）；柱温：30°C；流动相：5 mM H2SO4；流速：0.5 mL/min
研究结果
3.1 GlcNAc高产菌株中Neu5Ac合成途径的构建
前期研究中已构建了GlcNAc高产菌株大肠杆菌GLA（Ma et al., 2021b）。在GLA中，来源于酿酒酵母的氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶编码基因GNA1和天然的氨基葡萄糖-6-磷酸合酶编码基因glmS均使用强PT7启动子过表达。由此，GlcNAc-6-P被高效合成，并可在跨膜输出过程中通过去磷酸化转化为GlcNAc。然而，Neu5Ac的合成需要非磷酸化形式的GlcNAc，其随后可通过N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶的催化转化为ManNAc——Neu5Ac合成的两个直接前体之一（图1）。在GLA中，由于编码负责GlcNAc摄取的PTS系统的nagE基因已被敲除，部分胞外GlcNAc可通过扩散重新进入细胞并保持非磷酸化状态。为增强胞内GlcNAc-6-P的去磷酸化，我们在GLA中过表达了受Ptrc启动子控制的果糖-1-磷酸磷酸酶YqaB编码基因yqaB，构建了菌株NEA-1。果糖-1-磷酸磷酸酶YqaB具有催化GlcNAc-6P去磷酸化生成GlcNAc的能力。NEA-1中yqaB的过表达使GlcNAc积累量增加了14.1%（图2A），与前期研究一致（Zhang et al., 2018）。在引入Neu5Ac合成途径之前，负责Neu5Ac摄取和代谢的nanATEK基因簇（图1）在菌株NEA-1中被敲除，得到菌株NEA-2，为Neu5Ac合成途径的引入做好了准备。如图1所示，Neu5Ac的合成涉及两个关键酶，即N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶。来源于Anabaena sp. CH1的AGE基因（Chen et al., 2018）和来源于Synechocystis sp. PCC 6803的slr1975基因（Kang et al., 2012）所编码的两种不同来源的N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶均已被报道可高效催化GlcNAc向ManNAc的转化。因此，将带PT7启动子的AGE基因和slr1975基因分别整合至NEA-2的gapC位点，构建菌株NEA-3和NEA-4。图2B的摇瓶发酵结果表明，NEA-3中ManNAc积累量比NEA-4高22.8%。因此，选择携带Anabaena sp. CH1来源AGE基因的菌株NEA-3进行后续构建。将来源于脑膜炎奈瑟菌的N-乙酰神经氨酸合酶编码基因neuB（Gunawan et al., 2005）以PT7启动子控制引入NEA-3，构建菌株NEA-5。NEA-5摇瓶发酵36小时时检测到3.2 g/L Neu5Ac（图2B）。随后，测试了PT7-AGE和PT7-neuB的不同拷贝数组合，得到菌株NEA-6（2拷贝PT7-AGE和1拷贝PT7-neuB）、NEA-7（1拷贝PT7-AGE和2拷贝PT7-neuB）和NEA-8（2拷贝PT7-AGE和2拷贝PT7-neuB）。如图2C所示，菌株NEA-7中1拷贝PT7-AGE和2拷贝PT7-neuB的组合在测试菌株中实现了最高效的Neu5Ac合成。具体而言，摇瓶发酵36小时时，菌株NEA-7积累4.2 g/L Neu5Ac，比菌株NEA-5的效价提高了32.5%。
【数据】yqaB过表达使GlcNAc提高：+14.1%；NEA-3 vs NEA-4 ManNAc：+22.8%；NEA-5 Neu5Ac：3.2 g/L（36 h）；NEA-7 Neu5Ac：4.2 g/L（36 h），较NEA-5提高32.5%
3.2 前体ManNAc供给的优化
作为Neu5Ac合成的两个前体之一，首先进行了ManNAc库的富集。哺乳动物肝脏及部分致病菌（包括脑膜炎奈瑟菌和金黄色葡萄球菌）中由neuC编码的UDP N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶已被报道可催化UDP N-乙酰氨基葡萄糖的水解和异构化获得ManNAc。将脑膜炎奈瑟菌来源的neuC基因置于Ptrc启动子控制下引入菌株NEA-7以增强ManNAc供给，构建菌株NEA-9。摇瓶发酵结果（图3A）表明，与菌株NEA-7相比，NEA-9中GlcNAc和ManNAc效价分别提高了122.2%和157.1%。然而，Neu5Ac效价并未提高，表明NEA-7中ManNAc的供给并非Neu5Ac生产的限制因素。推测起始菌株中GlcNAc的高效合成已确保了ManNAc的充足供给。
【数据】NEA-9 vs NEA-7：GlcNAc +122.2%，ManNAc +157.1%；Neu5Ac效价：未提高
3.3 通过代谢流重编程优化PEP的补充与分配
#### 3.3.1 通过修饰中心碳代谢增强PEP补充
作为Neu5Ac合成的另一关键前体，PEP的供给直接影响合成效率。为增强PEP从丙酮酸和草酰乙酸的补充，将编码磷酸烯醇式丙酮酸合酶的pps基因和编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的pck基因分别在Ptrc启动子控制下于NEA-7中过表达，构建菌株NEA-10和NEA-11。图3B的摇瓶发酵结果表明，过表达pps或pck均有利于Neu5Ac合成，Neu5Ac效价分别提高了37.0%和27.4%。然而，NEA-10和NEA-11的细胞生长均受到抑制。这些结果表明，通过修饰中心碳代谢增强PEP补充，更多PEP可能被重新导向Neu5Ac的合成，但Neu5Ac合成与细胞生长之间的平衡仍需精确调控。
【数据】pps过表达（NEA-10）：Neu5Ac +37.0%，生长受抑；pck过表达（NEA-11）：Neu5Ac +27.4%，生长受抑
#### 3.3.2 PTS系统替换为非PTS系统
PTS依赖性转运对PEP的需求是细胞内PEP的主要消耗途径之一。我们进一步测试了将PTS替换为非PTS以将PEP重新导向Neu5Ac合成。在NEA-7中敲除ptsG基因，获得菌株NEA-12。PTS的损伤使NEA-12的葡萄糖消耗速率较NEA-7显著降低（图3C），导致NEA-12中Neu5Ac效价下降。为弥补PtsG缺失造成的葡萄糖摄取损伤，将编码运动发酵单胞菌葡萄糖通透酶的glf基因（Parker et al., 1995）引入菌株NEA-12，构建NEA-13。NEA-13的葡萄糖消耗速率提高（图3C），Neu5Ac效价达到4.9 g/L（图3B）。然而，NEA-13的葡萄糖消耗仍远慢于NEA-7。葡萄糖消耗速率较低的原因可能是葡萄糖激酶的磷酸化效率不足。因此，在NEA-13中进一步以强Ptrc启动子过表达天然葡萄糖激酶编码基因glk，构建菌株NEA-14。摇瓶发酵结果显示，NEA-14中Neu5Ac效价达到11.3 g/L，较NEA-13提高了130.6%（图3B）。值得注意的是，NEA-14的葡萄糖消耗曲线与NEA-7相似（图3C），表明使用非PTS系统后葡萄糖利用效率得以恢复。PTS替换为非PTS可减少葡萄糖摄取过程中的PEP消耗，从而使PEP能够重新导向Neu5Ac合成和中心碳代谢。
【数据】NEA-12：PTS损伤，葡萄糖消耗速率显著降低；NEA-13（+glf）：Neu5Ac 4.9 g/L；NEA-14（+glf+glk）：Neu5Ac 11.3 g/L，较NEA-13提高130.6%
#### 3.3.3 PEP重分配的组合策略
上述研究结果表明，通过过表达pps和pck增强PEP补充，以及使用非PTS系统减少PEP消耗，均有利于Neu5Ac合成。我们进一步测试了这些策略的组合应用。将Ptrc控制的pps和pck基因分别单独及同时引入具有非PTS葡萄糖摄取系统的菌株NEA-14中，分别获得菌株NEA-15、NEA-16和NEA-17。以NEA-14为对照，对这三株菌进行摇瓶发酵。结果（原文后续部分）……
【数据】原文此部分未提供NEA-15/16/17的具体数值
3.4 乙酸合成途径的弱化与发酵优化
（以下内容基于原文后续结果部分——原文节选在此处中断，但根据摘要和讨论信息，后续内容包括：通过弱化乙酸合成途径相关基因（如poxB、ackA-pta等）减少乙酸积累；在5 L生物反应器中优化发酵温度；通过敲除rhaB基因增强ATP供给等策略，最终构建菌株NEA-27。）
【数据】最终菌株NEA-27：77.12 g/L Neu5Ac（56 h，5 L反应器，30°C）；产率：0.217 g/g葡萄糖；生产强度：1.38 g/L/h
讨论与解读
讨论要点
以富集PEP为导向的代谢工程在提升目标产物合成效率的同时，可能打破碳源摄取与中心碳代谢中PEP分配的平衡，进而易引起上游糖酵解与下游TCA循环的失衡，导致乙酸积累并抑制目标产物合成效率。此外，由于中心碳代谢和乙酸合成途径与ATP生成密切相关，PEP浓度的波动容易影响胞内ATP库。由此，PEP富集、碳源代谢、乙酸积累、ATP库及Neu5Ac合成之间形成了一个错综复杂的互联网络。在这些PEP相关活动之间实现最优平衡，是构建用于PEP衍生物生物制造的微生物细胞工厂时面临的共同挑战。针对PTS系统和丙酮酸激酶的定向工程已被证明能有效提升PEP可用性，但往往以细胞生长受损或副产物积累增加为代价。
编译者解读
本研究展示了系统代谢工程策略在解决"前体供给-副产物积累-能量平衡"这一经典矛盾中的出色效果。值得关注的是，研究者并未停留在单一途径的强化，而是通过PTS替换、丙酮酸激酶动态调控、乙酸合成弱化及ATP供给增强等多层次协同策略，最终将Neu5Ac产量推至77.12 g/L——这一数据在同类报道中处于领先水平。从合成生物学应用角度看，该工作为其他以PEP为前体的高值化学品（如芳香族氨基酸及其衍生物）的微生物合成提供了可借鉴的代谢流重分配范式。但需注意，多基因编辑与发酵条件优化的组合策略是否能在工业放大中保持稳定，仍有待进一步验证。
参考来源
Sun C. Metabolic engineering of Escherichia coli for highly efficient N-acetylneuraminic acid production. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133343
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133343