来源：Metabolic engineering of Escherichia coli for efficient 5-aminolevulinic acid production via the C4 pathway（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是四吡咯化合物生物合成的关键前体，在农业、畜牧业和医学领域应用广泛。传统高产菌株依赖多拷贝质粒，存在稳定性差和成本高的问题。本研究通过染色体整合策略，结合DLKcat深度学习工具筛选高效ALAS酶、启动子文库精细调控hemB基因、转录组挖掘转录因子PspC等多层次代谢工程手段，构建了无质粒、无诱导剂、无抗生素的5-ALA细胞工厂。最终工程菌株ALA33在5 L生物反应器中通过补料分批发酵实现40.88 g/L的5-ALA产量，为工业化生产提供了可行方案。
研究背景
5-ALA天然存在于微生物、植物和动物细胞中，是血红素和叶绿素等必需色素生物合成的中心分子。在农业领域，5-ALA作为高效植物生长调节剂，显著增强作物光合作用和抗逆性；在畜牧业中，可作为饲料添加剂促进ATP产生和免疫应答；在医学领域，5-ALA作为高效的肿瘤光动力治疗前体光敏剂，应用前景广阔。
与化学合成相比，微生物发酵在生产成本、规模化潜力和环境友好性方面更具优势。化学合成依赖石油基原料和多步反应，物料和下游处理成本较高；而发酵可利用葡萄糖等可再生底物，与现有工业放大技术兼容性好，且反应条件温和、有机溶剂使用少。然而，传统高产菌株多采用多拷贝质粒策略，导致遗传不稳定和生产成本上升。本研究旨在通过染色体整合构建稳定、高效的5-ALA细胞工厂，摆脱对抗生素和诱导剂的依赖。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于表S1。大肠杆菌W3110作为5-ALA代谢工程改造的初始宿主菌株，大肠杆菌JM109作为质粒构建的克隆宿主。所有质粒构建采用Gibson组装法。基因组工程中使用pEcCpf1和pcrEG质粒。所有菌株在37°C的Luria–Bertani（LB）培养基中培养，LB培养基含5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L NaCl。根据需要添加抗生素进行筛选：壮观霉素50 μg/mL、四环素1 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素50 μg/mL。
摇瓶种子培养基使用LB培养基。摇瓶发酵生产5-ALA的培养基成分为（g/L）：葡萄糖20、酵母提取物2、(NH4)2SO4 16、KH2PO4 3、Na2HPO4·12H2O 16、MgSO4·7H2O 1、MnSO4·7H2O 0.01。另添加10 g/L CaCO3作为缓冲剂维持发酵过程中pH稳定。甘氨酸以4 g/L的浓度每12小时补充一次。所有摇瓶发酵实验在37°C、220 rpm条件下进行。
【数据】培养基：LB及改良发酵培养基；温度：37°C；转速：220 rpm；抗生素浓度：壮观霉素50 μg/mL、四环素1 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素50 μg/mL；CaCO3：10 g/L；甘氨酸：4 g/L每12 h
2.2 ALAS的筛选
DLKcat是一种深度学习框架，通过神经网络模型预测ALAS的动力学参数，利用酶氨基酸序列和甘氨酸的结构信息（Gly SMILES: C(C(=O)O)N）估算转换数（kcat）。具体操作如下：从GitHub（https://github.com/SysBioChalmers/DLKcat）获取DLKcat工具箱；随后，按照要求的输入规范准备ALAS蛋白序列及其推定底物甘氨酸的SMILES字符串；运行DLKcat预测流程后，模型使用图神经网络（GNN）处理底物结构，使用卷积神经网络（CNN）分析蛋白质序列，最终输出预测的kcat值。根据预测的kcat值分布，选择候选的高活性ALAS变体用于后续实验验证。
【数据】预测工具：DLKcat；底物：甘氨酸（SMILES: C(C(=O)O)N）；模型：GNN+CNN
2.3 基因组编辑
大肠杆菌基因组中的基因敲除和染色体整合使用CRISPR/Cpf1系统完成。本研究所用引物列于表S2。以iclR基因敲除为例：基于大肠杆菌W3110基因组序列，在iclR编码区5′端附近选择满足5′-TTTV-3′ PAM要求且无明显脱靶风险的目标位点，设计相应的crRNA并克隆至pcrEG载体。同源重组供体DNA由各约500 bp的上游和下游同源臂组成，通过重叠PCR扩增获得。上游臂引物对为iclR-arm-F1/iclR-arm-R1，下游臂引物对为iclR-arm-F2/iclR-arm-R2；iclR-arm-R1和iclR-arm-F2含有18-22 bp的重叠区域，使两个臂连接成完整的缺失 cassette。
操作开始时，加入10 mM L-阿拉伯糖诱导λ-Red重组酶表达。随后将iclR同源臂和质粒pcrEG-iclR与pEcCpf1一同电转化至对数中期（OD600 ~ 0.5）的大肠杆菌W3110细胞中，复苏后涂布于含卡那霉素和壮观霉素的抗生素琼脂平板筛选阳性克隆。使用菌落PCR验证基因缺失，确认的iclR缺失菌株PCR条带明显短于野生型菌株。PCR产物经测序确认iclR片段完全缺失且无意外突变，最终获得iclR敲除菌株。
【数据】诱导剂：10 mM L-阿拉伯糖；电转化菌株OD600：~0.5；同源臂长度：各约500 bp；筛选抗生素：卡那霉素+壮观霉素；PAM序列：5′-TTTV-3′
2.4 转录组分析
在对数期（T1）和稳定期（T2），从大肠杆菌W3110和工程菌株ALA31各收集4 mL培养样品，12,000 rpm离心10 min收集细胞。液氮速冻后，将细胞沉淀送至AZENTA生命科学（中国苏州）进行RNA-seq分析。测序读段比对至参考基因组，以|log2FC|≥1且p值≤0.05为阈值鉴定差异表达基因，比较W3110-T1与ALA31-T1、W3110-T2与ALA31-T2的转录谱。比对结果显示，W3110-T1和W3110-T2样品分别获得14,307,582和20,099,068个比对读段，而ALA31-T1和ALA31-T2样品分别获得14,149,840和14,261,558个比对读段。
【数据】样品体积：4 mL；离心：12,000 rpm × 10 min；差异表达阈值：|log2FC|≥1，p≤0.05；比对读段数：W3110-T1 14,307,582；W3110-T2 20,099,068；ALA31-T1 14,149,840；ALA31-T2 14,261,558
2.5 补料分批发酵
补料分批发酵在5 L生物反应器中进行。以10%（v/v）接种量接入对数后期细胞，总工作体积为2 L。发酵培养基成分为（g/L）：KH2PO4 5、(NH4)2SO4 3、NaCl 5、酵母提取物5、蛋白胨8、MgSO4·7H2O 0.5、甜菜碱1.5、葡萄糖20。发酵在37°C下进行，溶解氧（DO）维持在30%，通过自动添加氨水控制pH为6.8。由于5-ALA在高温和富氧条件下易氧化降解，发酵18 h后将DO设定值降至10%，培养温度降至30°C。补料阶段，通过蠕动泵向反应器中添加浓缩葡萄糖溶液（800 g/L）和甘氨酸溶液（200 g/L），维持葡萄糖浓度在1-10 g/L，甘氨酸以1-2 g/(L·h)的速率连续补加。
【数据】反应器：5 L；接种量：10%（v/v）；工作体积：2 L；温度：37°C（18 h后降至30°C）；DO：30%（18 h后降至10%）；pH：6.8；葡萄糖补料：800 g/L浓缩液，维持1-10 g/L；甘氨酸补料：200 g/L溶液，1-2 g/(L·h)
2.6 分析方法
5-ALA定量：400 μL适当稀释的培养样品与200 μL醋酸钠缓冲液（pH 4.6）混合，加入100 μL乙酰丙酮。混合物沸水浴加热15 min，冷却至室温。随后加入700 μL Ehrlich试剂，孵育20 min显色后，在554 nm处测定吸光度。细胞生物量通过UV-2000Z紫外可见分光光度计（上海佑科）测定600 nm处光密度（OD600）确定，葡萄糖浓度使用SBA-40C生物传感器分析仪（山东省科学院，中国）测定。
【数据】5-ALA检测波长：554 nm；沸水浴：15 min；显色时间：20 min；OD600测定仪器：UV-2000Z；葡萄糖测定仪器：SBA-40C
研究结果
3.1 基于DLKcat的ALAS高效筛选
在C4途径中，5-ALA由琥珀酰辅酶A和甘氨酸经5-氨基乙酰丙酸合酶（ALAS）催化的一步缩合反应合成（图2A）。ALAS是一种PLP依赖性同源二聚体，催化该途径的关键步骤，其活性通常被认为是5-ALA生物合成的主要限速因素。催化转换数（kcat）是酶动力学的核心参数，也是催化效率的关键指标。
为理性筛选ALAS，使用基于深度学习的kcat预测工具DLKcat系统预测来自不同推定来源生物的ALAS同源物的催化常数（kcat）（图2B）。根据预测的kcat值，选择推定催化效率最高的六个ALAS候选物进行进一步表征，包括来自Billgrantia bachuensis的BgALAS、来自Rickettsiales bacterium的RkALAS、来自Rhodopseudomonas palustris的RpALAS、来自Methylocystis sp.的MlALAS、来自Mesorhizobium koreense的MhALAS和来自Ferrovibrio sp.的FbALAS（表S3）。
为阐明该酶家族的进化关系，以MlALAS序列为参考，与BgALAS、RkALAS、RpALAS、MhALAS和FbALAS进行多序列比对（图2C）。MlALAS与其他五个同源物的序列一致性分别为32.5%、40.8%、49.7%、35.2%和42.1%，显示出从相对较远到中等接近的同源性梯度。
随后，评估了六个ALAS变体在大肠杆菌W3110中的异源表达，并测定了相应的5-ALA产量。使用Ptrc启动子和pSC101骨架，构建了重组质粒pSC101-BghemA、pSC101-RkhemA、pSC101-RphemA、pSC101-MlhemA、pSC101-MhhemA和pSC101-FbhemA，并导入大肠杆菌W3110，生成菌株ALA01–ALA06。SDS-PAGE分析细胞蛋白确认所有ALAS变体均成功异源表达（图2D）。
后续摇瓶发酵确认所有工程菌株均能产生5-ALA。值得注意的是，菌株ALA04（携带pSC101-MlhemA，表达来自Methylocystis sp.的MlALAS）显示出最高的蛋白表达水平和5-ALA产量，达到3.22 g/L，显著高于其他菌株（图2E）。综合表达水平和发酵产量分析，确定MlALAS为最优ALAS候选酶。
为进一步增强染色体表达稳定性并精确控制基因拷贝数以构建整合型5-ALA细胞工厂，首先在大肠杆菌W3110中敲除了lacI基因。摇瓶实验表明，lacI缺失对细胞生长或5-ALA生产无显著影响。随后采用基因组整合策略，将选定的MlhemA基因以1至5个拷贝数插入确定的染色体位点，生成菌株ALA08–ALA12。其中，携带4个拷贝MlhemA的菌株ALA11在摇瓶培养中产5-ALA最高，达3.60 g/L（图2F）。
【数据】ALAS候选数：6个；序列一致性：32.5%-49.7%；ALA04菌株5-ALA产量：3.22 g/L；ALA11菌株（4拷贝MlhemA）5-ALA产量：3.60 g/L
3.2 5-ALA降解途径基因hemB的敲低
作为多种吡咯化合物生物合成的中心代谢前体，5-ALA在细胞内被下游途径迅速消耗，严重限制其积累。因此，阻断或减弱这一竞争性代谢流对于实现5-ALA的高水平生产至关重要（图3A）。为此，最初尝试通过删除编码胆色素原合酶的hemB基因来阻断5-ALA向胆色素原（PBG）的转化。然而，多次尝试后所有hemB敲除突变体均无法存活，表明hemB对细胞生长是必需的（图3B）。这一必需性可解释为：5-ALA被持续消耗用于血红素生物合成。由于血红素是呼吸链中不可或缺的辅因子，完全破坏其合成将导致细胞必需功能丧失，最终导致细胞死亡。
因此，本研究旨在采用精确的转录敲低策略适度降低hemB表达，从而有效平衡细胞活力与5-ALA积累。为此，采用基于CRISPR-dCas9的转录抑制系统。在该系统中，设计了三个靶向hemB 5′区、中区和3′区的特异性sgRNA（L1、L2和L3），并克隆至质粒骨架pGRB（图3C）。将所得的sgRNA质粒分别与dCas9质粒共转化至菌株ALA11，生成三个工程菌株（ALA13、ALA14和ALA15）。摇瓶发酵和5-ALA定量分析显示，表达靶向hemB 5′区sgRNA的菌株ALA13产量最高，达3.95 g/L，较ALA11提高了9.72%（图3D）。
由于基于CRISPR-dCas9的敲低系统依赖双质粒共转化，会给大肠杆菌宿主带来显著的代谢负担，导致生长速率降低，表现为OD明显下降。为克服这一技术瓶颈，采用启动子工程策略，通过构建hemB启动子文库来精细调控hemB的表达水平。
首先，使用Softberry基因结构预测服务器鉴定hemB启动子的−10和−35区域。随后设计针对这些区域的简并引物，在调控片段中引入序列多样性（图S1）。鉴于编码序列的5′区域对基因表达有强烈影响，且启动子在驱动报告基因（如荧光蛋白基因）与天然靶基因时往往表现出不同的表观强度，这使得预测启动子在代谢调控中的表现变得困难。为解决这一问题，构建了将hemB前180 bp与柔性连接肽(GGGGS)3及绿色荧光蛋白（GFP）基因融合的定制报告系统。
具体而言，将设计的引物、hemB 5′端180 bp片段、柔性连接肽(GGGGS)3和GFP编码序列组装生成报告质粒。该构建体通过GFP表达反映不同hemB启动子变体的强度，从而间接反映其对hemB的转录调控。将质粒文库转化至大肠杆菌，获得具有一系列荧光强度的转化子。将这些转化子在96孔板中培养，测定其荧光强度，系统分离覆盖宽动态范围的启动子变体——约为天然启动子强度的80%、60%、40%和20%（图3E，S2）。
利用基因组编辑，将代表性启动子变体整合至染色体替换天然hemB启动子，生成工程菌株ALA16–ALA19。摇瓶发酵分析表明，启动子强度显著影响5-ALA积累。其中，菌株ALA18维持了稳健的生长并达到最高5-ALA产量4.17 g/L（图3F），较ALA11提高15.83%，表明hemB表达与代谢需求之间达到了最佳平衡。对两种敲低策略——CRISPR-dCas9介导的转录抑制与启动子文库表达调控——的系统比较显示，后者具有明显优势（图3G）。启动子文库策略不仅有效避免了双质粒系统带来的代谢负担和生长抑制，显著改善了OD和最终5-ALA产量。
【数据】hemB敲除：不可行（必需基因）；ALA13产量：3.95 g/L（较ALA11提高9.72%）；启动子变体强度范围：天然启动子的20%-80%；ALA18产量：4.17 g/L（较ALA11提高15.83%）
3.3 关键代谢靶点的工程改造
（注：此部分原文节选未完整提供，以下内容基于可获取的原文信息编译）
【数据】原文未详述
3.4 转录组挖掘转录因子
（注：此部分原文节选未完整提供，以下内容基于可获取的原文信息编译）
【数据】原文未详述
3.5 5 L生物反应器补料分批发酵
（注：此部分原文节选未完整提供，以下内容基于可获取的原文信息编译）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过基因组规模的模块化代谢工程系统性地重编程和优化了5-ALA生物合成的代谢流。工程策略包括：（1）利用DLKcat预测工具筛选来自Methylocystis sp.的高活性5-ALA合酶，并进行稳定的染色体整合；（2）使用启动子文库精细调控下游基因hemB的表达；（3）靶向修饰关键节点，理性调节控制5-ALA生物合成通量的基因；（4）转录组指导的转录因子pspC的鉴定与工程改造；（5）在5 L生物反应器中无抗生素、无诱导剂补料分批培养，实现5-ALA产量40.88 g/L，葡萄糖到5-ALA的转化率为0.23 g/g。
虽然本研究建立了有效的代谢工程策略以提高5-ALA产量，但潜在的代谢流重分布和前体分配尚未直接表征。未来需要代谢组学和代谢流分析进一步阐明改良表型的代谢基础。
编译者解读
该研究展示了合成生物学中"设计-构建-测试-学习"循环的完整实践。亮点在于将深度学习工具DLKcat引入酶筛选环节，大幅提升了关键酶选择的理性程度；同时以染色体整合替代质粒表达，从根本上解决了工业发酵中常见的质粒丢失和抗生素成本问题。启动子文库精细调控必需基因hemB的策略尤为巧妙——既避免了完全敲除导致的致死效应，又有效减少了碳流损耗。转录组指导的转录因子挖掘进一步体现了组学数据驱动工程决策的前沿思路。最终40.88 g/L的产量在无诱导剂无抗生素条件下实现，具备良好的工业转化潜力。局限在于代谢流重分布机制尚未完全阐明，后续可结合代谢组学与13C代谢流分析深化理解。
参考来源
Jin M. Metabolic engineering of Escherichia coli for efficient 5-aminolevulinic acid production via the C4 pathway. Food Bioscience, 2026. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108784
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108784