来源：Efficient production of l-tryptophan by dynamic regulation of the intracellular l-Gln:l-Ser ratio in Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-色氨酸是人和动物必需氨基酸，在医药、食品和饲料行业应用广泛。本研究通过整合胞内代谢物 profiling 与转录分析，在大肠杆菌中鉴定了磷酸烯醇式丙酮酸、莽草酸、L-谷氨酰胺和L-丝氨酸四个代谢瓶颈。研究发现胞内L-谷氨酰胺与L-丝氨酸的摩尔比是影响细胞生长和L-色氨酸生产的关键因素——当比例控制在5.0:4.0时，L-色氨酸效价提升18.6%。作者进一步构建了名为RNAi-SG的代谢调控系统，将L-谷氨酰胺响应型转录抑制子GINLB与RNA干扰相结合，动态维持该比例，最终工程菌株TRPA在52小时发酵后L-色氨酸效价和得率分别达到68.2 g/L和0.260 g/g。
研究背景
芳香族氨基酸（AAAs）包括L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸，具有高生理活性，广泛用于食品、饲料、医药和营养保健品行业。全球AAAs及其衍生物市场快速扩张，年需求量估计超过53,000公吨。工业规模生产AAAs主要依靠工程菌株（如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌）的微生物细胞工厂。然而，高效大规模生产AAAs仍受两个瓶颈制约：一是从葡萄糖到L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸的生物合成途径分别需要约18、18和20个酶促步骤，长途径导致碳通量在多个中间代谢物间逐步耗散；二是该途径架构包含多重调控，限制了通量进一步提升。
研究方法
2.1 培养条件
本研究所用全部基因、菌株、质粒和引物见补充材料。常规培养使用LB培养基，组成为（1% w/v）胰蛋白胨、（0.5% w/v）酵母提取物和（1% w/v）NaCl；固体LB培养基用于平板培养时添加（1.5% w/v）琼脂。5-L补料分批发酵使用基础培养基，含酵母提取物（2 g/L）、葡萄糖（7.5 g/L）、K2HPO4·H2O（12 g/L）、MgSO4·7H2O（0.5 g/L）、KH2PO4（3 g/L）、柠檬酸钠（2 g/L）、FeSO4·7H2O（0.1 mg/mL）和(NH4)2SO4（4 g/L）。发酵实验时添加四环素至100 mg/L。通过自动添加含168 g NH3/L（约18 wt% NH3）的氨水维持培养pH，溶解氧（DO）通过自动调节搅拌和通气来控制。初始葡萄糖耗尽后，立即启动浓缩葡萄糖补料（720 g/L）。所有5-L补料分批实验均设三次重复。E. coli JM109细胞在5 mL LB液体培养基中、37或30°C、220 rpm条件下培养。当pXll质粒导入JM109后，菌株在含四环素的LB液体或固体培养基中、37°C培养。构建Cas9系列质粒时，JM109在含卡那霉素的LB中、30°C培养。
【数据】培养基：LB（1%胰蛋白胨+0.5%酵母提取物+1% NaCl）；发酵基础培养基：酵母提取物2 g/L、葡萄糖7.5 g/L、K2HPO4·H2O 12 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 3 g/L、柠檬酸钠2 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 mg/mL、(NH4)2SO4 4 g/L；四环素：100 mg/L；补料葡萄糖：720 g/L；温度：37或30°C；转速：220 rpm
2.2 分析方法
L-色氨酸浓度采用高效液相色谱（HPLC）测定，按照XBridge BEH C18色谱柱说明书操作。流动相A（0.3 g/L KH2PO4）与流动相B（10%甲基氰）比例为9:1。HPLC条件如下：流速（1 mL/min）、紫外波长（278 nm）、温度（39°C）。从5-L发酵罐采集的样品稀释两倍（1:1，v/v）并加热至L-Trp完全溶解。样品随后离心。取上清液过滤后进HPLC分析。发酵过程中葡萄糖浓度使用M-100生物传感器（深圳西曼科技有限公司，中国）测定。琥珀酸、乳酸和乙酸盐浓度使用配备Agilent Polaris C18-A色谱柱的HPLC（Agilent 1200）检测。具体条件：流速（流动相A，10%甲基氰）设为0.8 mL/min，柱温39°C，紫外波长340 nm。
【数据】HPLC条件：流速1 mL/min、波长278 nm、温度39°C、流动相A:B=9:1；葡萄糖传感器：M-100；有机酸HPLC：流速0.8 mL/min、波长340 nm、柱温39°C
2.3 基因操作
本研究采用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑流程进行靶基因的染色体整合。pTarget衍生物通过全质粒PCR构建，每个质粒携带相应的N20原型间隔序列和供体整合盒。所得pTarget质粒与pCas9一起共转化至指定菌株，引导位点特异性切割并促进靶序列的同源定向整合。
【数据】基因编辑方法：CRISPR/Cas9；整合方式：同源定向整合；质粒：pTarget衍生物+pCas9
2.4 胞内前体浓度定量
采集的样品在4°C离心（8000 × g，5 min），重悬于缓冲液A（pH 7.5，25 g/L湿重，25 mM Tris-HCl）。随后用超声波破碎仪（Scientz JY96-IIN）裂解细胞，裂解液离心（12,000 rpm，30 min）。收集细胞裂解液上清，使用商业试剂盒（Coibo，中国）测定L-Gln、L-Ser和Ru-5-P的胞内浓度。同时，PEP、E4P、莽草酸和DAHP的胞内浓度通过LC-MS/MS分析（Genwiz，中国）测定。采用商业试剂盒进行双抗体两步夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）。将标准品和样品依次加入预先包被细菌谷氨酰胺或丝氨酸特异性捕获抗体的微孔板中，孵育使抗原结合。随后加入生物素化检测抗体，严格洗涤去除未结合组分。再加入HRP偶联抗体形成酶检测复合物，重复洗涤去除多余试剂。以3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）启动信号显色，TMB被HRP氧化生成蓝色中间体。酸终止后蓝色中间体转化为稳定的黄色产物。在微孔板读数器中记录450 nm吸光度，根据标准曲线定量分析物浓度，信号强度与各样品中谷氨酰胺或丝氨酸丰度成正比。在TRP10菌株发酵过程中调节L-Gln:L-Ser比例时，向发酵罐中补加0.5 M L-Gln和0.1 M L-Ser，每2小时取样测定L-Gln和L-Ser胞内水平，据此调整L-Gln和L-Ser的补加速率。胞内L-Gln和L-Ser测定时，收集发酵液并以6000 rpm离心5 min获得约15 mg细胞生物量。细胞用PBS缓冲液（50 mM，pH 7.0）洗涤两次，超声破碎（150 W，20 min），然后8000 rpm离心20 min收集上清。上清中L-Gln和L-Ser浓度使用ELISA试剂盒测定，比例点为取样测定而非在线锁定。在保持外部L-Gln:L-Ser比例为5:4的条件下，还进行了不同绝对补加水平的额外实验，包括1.5:1、3:2、6:4和12:8 g/L。
【数据】离心：8000×g/5min/4°C；缓冲液A：pH 7.5、25 g/L湿重、25 mM Tris-HCl；超声破碎仪：Scientz JY96-IIN；裂解液离心：12,000 rpm/30min；L-Gln/L-Ser/Ru-5-P试剂盒：Coibo；PEP/E4P/莽草酸/DAHP：LC-MS/MS（Genwiz）；ELISA：双抗体两步夹心法、TMB显色、450 nm读数；补料：0.5 M L-Gln和0.1 M L-Ser；取样间隔：2 h；细胞量：约15 mg；PBS洗涤：50 mM pH 7.0；超声：150 W/20min；离心：8000 rpm/20min；外部比例实验：1.5:1、3:2、6:4、12:8 g/L
2.5 荧光测量
为定量L-Gln响应型生物传感器的荧光输出，将相应质粒导入指定的TRP10菌株。挑取单菌落接种于5 mL含梯度L-Gln浓度（0–10 g/L）的LB培养基中，37°C、200 rpm振荡培养过夜。以OD600定量生物量，eGFP和mKate信号在多模式微孔板读数器上平行测量（eGFP：Ex 488 nm/Em 525 nm；mKate：Ex 588 nm/Em 645 nm）。荧光强度归一化至OD600，以便在不同L-Gln条件下对生物传感器响应进行稳健比较。
【数据】L-Gln梯度：0–10 g/L；温度：37°C；转速：200 rpm；eGFP：Ex 488 nm/Em 525 nm；mKate：Ex 588 nm/Em 645 nm；归一化：荧光/OD600
2.6 分子对接
为增强GINLB的抑制强度，基于BsGlnR-DNA结构（PDB: 4R4E）和100个GlnR同源物的序列保守性分析对BsGlnR进行工程改造。选择DNA结合区域中13个非保守残基进行饱和突变，所得变体在GINLB报告系统中用归一化荧光进行评估。鉴定出5个有益的单一替换，进一步组合生成22个组合变体。其中，三重突变体M18Q/N34P/A40R表现出最强的抑制效果，被命名为BsGlnRTM，随后用于优化后的GINLB回路。
【数据】结构模板：PDB 4R4E；同源物分析：100个GlnR同源物；突变位点：13个非保守残基；有益单替换：5个；组合变体：22个；最优突变体：M18Q/N34P/A40R（BsGlnRTM*）
2.7 BsGlnR突变体的高通量筛选
对于BsGlnR的蛋白质工程，每个饱和突变变体导入GINLB报告菌株背景，使用上述荧光抑制实验（方法2.5）进行评估。抑制强度通过6 g/L L-Gln条件下下游报告基因的归一化荧光定量，荧光低于野生型对照的变体被认为是具有改善抑制效果的候选突变体。初筛中鉴定出的有益单点突变体随后重新转化并三重复评估进行二次验证。确认的有益替换随后组合生成双、三、四和五重变体，使用相同实验进行筛选。表现出最强抑制的变体被选用于后续表征和回路构建。
【数据】筛选条件：6 g/L L-Gln；验证方式：三重复；组合范围：双/三/四/五重变体
2.8 分子对接与结构分析
为获得BsGlnRTM*与优化操纵子mutDN结合的复合物结构，后续进行了分子对接与结构分析（具体参数原文未详述）。
【数据】对接对象：BsGlnRTM*与mutDN复合物；原文未详述具体对接参数
研究结果
3.1 增强莽草酸生物合成途径的碳通量
如图1A所示，经5-L补料分批发酵48小时后，E. coli TRP0的L-Trp效价、得率和生产速率分别为36.1 g/L、0.167 g/g和0.75 g/L/h。发酵曲线显示细胞密度、葡萄糖消耗速率和L-Trp生产速率在28小时达到最大值（分别为30.8 g/L、24 g/h和1.19 g/L/h），随后下降。至48小时，细胞密度、葡萄糖消耗速率和L-Trp生产速率分别下降10.0%、11.2%和26.2%。
此外，在0、8、16、24、28、32、40和48小时定量了胞内PEP、E4P、DAHP、Ru-5-P和莽草酸浓度（图1B）。在后期（28–48 h），E4P和DAHP积累至2.41 mM和1.19 mM，相对于28小时分别增加了2.0倍和20.0倍。尽管DAHP积累，莽草酸下降了18.3%，而PEP和Ru-5-P从28小时到48小时分别持续下降8.1%和2.1%。这些数据表明E4P和PRPP的供应并不限制L-Trp生产。然而，DAHP和莽草酸的矛盾积累表明DAHP向莽草酸转化之间存在瓶颈。此外，PEP可用性的下降可能与莽草酸途径碳通量减少有关，并影响了L-Trp的生产。为阐明PEP可用性下降的原因，分析了与PEP合成、磷酸转移酶系统（PTS）和三羧酸（TCA）循环相关基因的转录（图1C和D）。28小时后，ptsH和pykF显著上调，而编码PEP合酶的ppsA在48小时相对于28小时下调58.8%。
【数据】TRP0发酵48h：效价36.1 g/L、得率0.167 g/g、生产速率0.75 g/L/h；28h峰值：细胞密度30.8 g/L、葡萄糖消耗24 g/h、生产速率1.19 g/L/h；48h下降：细胞密度-10.0%、葡萄糖消耗-11.2%、生产速率-26.2%；E4P积累：2.41 mM（2.0倍）；DAHP积累：1.19 mM（20.0倍）；莽草酸：-18.3%；PEP：-8.1%；Ru-5-P：-2.1%；ppsA下调：58.8%
为缓解PTS途径造成的PEP消耗，删除了ptsH并在菌株TRP0中引入非PEP依赖的葡萄糖摄取系统（glf-glk），生成菌株TRP1（图1E）。来自运动发酵单胞菌的glf基因和大肠杆菌的glk基因在PJ23119启动子控制下过表达。在5-L补料分批发酵中（图1F），菌株TRP1细胞密度下降5.1%，但L-Trp效价（42.5 g/L）和得率（0.174 g/g）相对于菌株TRP0分别提高17.7%和4.2%。为进一步减少PEP消耗，在菌株TRP1中删除pykF，生成菌株TRP2，细胞密度、效价和得率相对于TRP1分别提高15.1%（34.3 g/L）、12.9%（48.0 g/L）和5.7%（0.184 g/g）（图1F）。接下来，在菌株TRP2中过表达ppsA基因以增强PEP再生，获得菌株TRP3。在TRP3的5-L补料分批发酵中，细胞密度不变（34.3 g/L），而L-Trp效价和得率分别提高至50.0 g/L（4.2%）和0.200 g/g（8.7%）（图1F）。如图1G所示，菌株TRP1、TRP2和TRP3的胞内PEP水平分别为30.7 μM、32.2 μM和35.6 μM，相对于TRP0分别提高12.8%、20.4%和25.3%，表明较高的胞内PEP可能优先被导向芳香族途径的前体供应，并间接转化为生物量增加。
【数据】TRP1：细胞密度-5.1%、效价42.5 g/L（+17.7%）、得率0.174 g/g（+4.2%）；TRP2：细胞密度34.3 g/L（+15.1%）、效价48.0 g/L（+12.9%）、得率0.184 g/g（+5.7%）；TRP3：细胞密度34.3 g/L（不变）、效价50.0 g/L（+4.2%）、得率0.200 g/g（+8.7%）；PEP水平：TRP1 30.7 μM（+12.8%）、TRP2 32.2 μM（+20.4%）、TRP3 35.6 μM（+25.3%）
为缓解AroE的底物抑制，将突变体AroEfbr(T61W/L241I)引入菌株TRP3，生成菌株TRP4，L-Trp效价和得率分别提高6.6%（53.3 g/L）和3.5%（0.207 g/g）。最后，将菌株TRP4中AroEfbr基因拷贝数增至五个，生成菌株TRP5，其中L-Trp效价和得率进一步提高至55.0 g/L和0.210 g/g。在菌株TRP5中，胞内L-Gln和莽草酸水平相对于TRP0分别下降25.6%和提高12.4%（见补充材料），表明PEP相关工程同时影响碳流向分支酸的分配和L-Gln生物合成的前体供应。
【数据】TRP4：效价53.3 g/L（+6.6%）、得率0.207 g/g（+3.5%）；TRP5：效价55.0 g/L、得率0.210 g/g；TRP5胞内：L-Gln -25.6%、莽草酸 +12.4%
3.2 增强L-Gln和L-Ser生物合成以改善L-Trp生产
如图2A所示，L-Gln和L-Ser被鉴定为L-Trp生物合成的两个关键分支特异性前体。L-Gln在邻氨基苯甲酸合酶反应中作为酰胺氮供体，而L-Ser作为L-Trp合酶的直接底物，贡献L-Trp的氨基酸骨架部分。
在28小时，其胞内浓度分别为629.2 μM和498.7 μM。两种代谢物在48小时分别降至435.4 μM和165.3 μM，相对于28小时分别下降30.8%和66.8%（图2B）。一致地，编码L-Gln生物合成关键酶的glnA和gdhA转录水平在48小时相对于28小时分别下降9.7%和8.1%（图2C）。类似地，编码L-Ser生物合成途径关键酶（催化3-磷酸甘油酸转化为L-Ser）的serA、serC和serB分别下调26.6%、39.2%和47.4%（见补充材料）。这些下调基因与胞内L-Gln和L-Ser池的下降相关，可能反映了发酵后期碳-氮再平衡、中心代谢重分布和全局调控变化的综合效应。
【数据】28h胞内：L-Gln 629.2 μM、L-Ser 498.7 μM；48h胞内：L-Gln 435.4 μM（-30.8%）、L-Ser 165.3 μM（-66.8%）；转录下调：glnA -9.7%、gdhA -8.1%、serA -26.6%、serC -39.2%、serB -47.4%
为在发酵后期扩大胞内L-Gln和L-Ser池，从BRENDA数据库中选择三个与天然大肠杆菌GlnA（Km = 7.2）Km值不同的革兰氏阳性异源glnA候选基因：BbGlnA（两歧双歧杆菌，UniProt ID: A0A0E2ZCY0，Km = 1.1）、BsGlnA（枯草芽孢杆菌，UniProt ID: P12425，Km = 3.4）和SaGlnA（金黄色葡萄球菌，UniProt ID: P0A040，Km = 37.0），分别基因组整合至菌株TRP5中，生成菌株TRP6、TRP7和TRP8。基因序列见补充材料。在5-L补料分批发酵中（图2C），菌株TRP7表现最佳，细胞密度达34.45 g/L，L-Trp效价和得率分别为56.4 g/L和0.213 g/g，相对于TRP5分别提高1.4%、2.5%和3.4%。尽管TRP7胞内L-Gln水平相对于TRP5提高17.8%，但L-Ser水平高于L-Gln水平（见补充材料），可能是因为L-Gln作为中心酰胺氮供体。
【数据】Km值：E. coli GlnA 7.2、BbGlnA 1.1、BsGlnA 3.4、SaGlnA 37.0；TRP7：细胞密度34.45 g/L（+1.4%）、效价56.4 g/L（+2.5%）、得率0.213 g/g（+3.4%）；TRP7胞内L-Gln：+17.8%
为进一步加强L-Gln供应，在菌株TRP7中过表达gdhA基因，生成菌株TRP9，L-Trp效价和得率进一步提高至57.3 g/L和0.231 g/g（图2C）。为增加L-Ser可用性，在菌株TRP9中分别过表达serA、serB和serC，生成菌株TRP10、TRP11和TRP12。在5-L补料分批发酵中，菌株TRP10的L-Trp效价和得率达到58.6 g/L和0.234 g/g，相对于TRP9分别提高2.3%和1.3%（图2D）。相比之下，尽管菌株TRP11和TRP12的胞内L-Ser浓度分别提高65.2%和74.0%（图2E），L-Trp效价却降低>99.5%。对TRP10、TRP11和TRP12菌株胞内PEP和莽草酸水平的分析表明，增强L-Ser生物合成将糖酵解碳通量从PEP转向丝氨酸生物合成途径，从而减少了莽草酸途径的前体供应。此外，这些结果表明L-Gln和L-Ser之间的化学计量平衡构成L-Trp生物合成效率的关键决定因素（见补充材料）。
【数据】TRP9：效价57.3 g/L、得率0.231 g/g；TRP10：效价58.6 g/L（+2.3%）、得率0.234 g/g（+1.3%）；TRP11胞内L-Ser：+65.2%；TRP12胞内L-Ser：+74.0%；TRP11/TRP12效价：降低>99.5%
3.3 胞内L-Gln和L-Ser浓度及比例对L-Trp生产的影响
如图3所示，补加2.0–10.0 g/L L-Gln使菌株TRP10的细胞密度从34.8 g/L提高至39.9 g/L。然而，较高L-Gln水平（≥10.0 g/L）显著抑制生长，细胞密度降低22.7%。
【数据】L-Gln补加范围：2.0–10.0 g/L；细胞密度：34.8→39.9 g/L；高浓度抑制：≥10.0 g/L、细胞密度-22.7%
（以下结果部分原文节选在此截断，后续内容涉及RNAi-SG系统构建与优化、TRPA菌株发酵工艺优化等，但由于提供的原文节选在3.3节中途截止，无法继续翻译未提供的部分。根据摘要和讨论部分信息，RNAi-SG系统将L-Gln响应型转录抑制子GINLB与RNA干扰结合，抑制强度提升43.3%，在6–42小时发酵期间将胞内L-Gln:L-Ser比例维持在接近5.0:4.0。菌株TRPA在52小时发酵后L-Trp效价和得率分别达到68.2 g/L和0.260 g/g。以下讨论部分基于原文讨论节选编译。）
讨论与解读
本研究通过系统性地结合静态和动态代谢策略，构建了高效的L-Trp细胞工厂。在胞内代谢物 profiling 和转录分析的指导下，对PEP、莽草酸、L-Gln和L-Ser代谢中的关键节点进行了重新布线，以提升前体池并强化菌株TRP10中的莽草酸途径。发现氨基酸供体L-Gln和L-Ser之间的摩尔比同时影响生物量和L-Trp生产。为动态调控该比例，设计了L-Gln响应型转录调控生物传感器GINLB，并与基于RNAi的翻译抑制子结合，开发了RNAi-SG调控系统。使用该系统，菌株TRPA的胞内L-Gln:L-Ser摩尔比维持在5.0:4.0，从而增加L-Trp途径的碳通量并提高L-Trp的效价、得率和生产速率。通过静态代谢工程策略构建菌株TRP10，在相同48小时补料分批发酵和补料速率1条件下，L-Trp效价和得率相对于TRP0分别提高84.2%和47.9%。
【数据】TRP10相对TRP0：效价+84.2%、得率+47.9%；RNAi-SG：抑制强度+43.3%；比例维持：5.0:4.0（6–42 h）；TRPA：效价68.2 g/L、得率0.260 g/g（52 h）
编译者解读：该研究的技术亮点在于将代谢物 profiling 指导的静态工程与基于生物传感器的动态调控相结合——先通过多组学手段精确定位瓶颈节点，再用合成生物学工具（RNAi-SG系统）实现发酵过程中前体比例的实时维持。这种"先诊断、后精准干预"的策略对微生物细胞工厂的理性设计具有方法论价值。值得注意的是，L-Gln:L-Ser比例从"被发现的关联因子"转变为"可动态控制的工程参数"，体现了合成生物学从静态敲除/过表达向动态调控演进的趋势。局限在于RNAi-SG系统的构建与优化复杂度较高，其普适性有待在其他宿主和产物体系中验证。
参考来源
Qiang Zhou. Efficient production of l-tryptophan by dynamic regulation of the intracellular l-Gln:l-Ser ratio in Escherichia coli. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135025
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135025